广谱抗LPS mAb的生物学活性
作者：马越云 苏明权 丁振若 于文彬
单位：第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033
关键词：单克隆抗体；脂多糖；生物学活性
第四军医大学学报001020 摘 要： 目的 鉴定抗LPS mAb对不同种属细菌及其LPS的交叉反应性和保护活性. 方法 以间接ELISA，Western 印迹试验鉴定mAb对不同种属细菌及其LPS的交叉反应性；检测不同浓度mAb对LPS诱导的淋巴细胞分泌TNF-α和IL-6的抑制作用；以大肠埃希菌、铜绿色假单胞菌、鼠伤寒沙门菌建立小鼠菌血症模型，鉴定mAb的保护作用. 结果 在ELISA试验中，抗LPS mAb C3A2 和H3D3可与鉴定所用的18株革兰阴性菌产生交叉反应；在Western印迹试验中可与鉴定所用的全部7个种属的LPS产生交叉反应；随mAb浓度的提高，LPS诱导淋巴细胞分泌TNF-α和IL-6的作用受到抑制；在动物保护试验中，相对于生理盐水对照组，存活率提高30%～60%. 结论 抗LPS mAb C3A2 和H3D3不仅对众多革兰阴性菌LPS具有广泛交叉反应性,而且具有高保护活性.
, http://www.100md.com
中图号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1234-04
Biologic characters of mAb against LPS
MA Yue-Yun, SU Ming-Quan, DING Zhen-Ruo,YU Win-Bin
(Department of Clinical Laboratory,Xijing Hospital, Fourth Military Medical University,Xi'an 710033, China)
Abstract:AIM To investigate the cross-reactivity and protectivity of mAbs against LPS. METHODS By using inhibition ELISA and Western-blot we identified the cross-reactivity of these McAbs, and by using E.coli O114:B5，S.typhim urium and P.aeruginosa to challenge mice we determined the protective role of these mAbs. RESULTS C3A2 and H2-3D3 mAbs against LPS cross-reacted with all the 18 grem-negative bacterial LPS available in ELISA and the 7 in Western-blot. In the mouse protective test, the rate of survival was enhanced about 30%～60%. CONCLUSION C3A2 and H2-3D3 mAb against LPS have not only broadly cross-reactivity binding to heterologous LPS but also high protectivity.
, 百拇医药
Keywords: monoclonal antibody; LPS;bioactivity
0 引言
LPS是革兰阴性细菌(GNB)外膜的主要组成部分，是革兰阴性细菌致病的重要因素. 近20年来的研究不断证实,GNB败血症及感染性休克的发病及致死的主要原因,是由于GNB释放的或从肠道进入体内的LPS所引起[1]. 使用抗生素治疗此类疾患,死亡率仍高达45%[2],目前尚无有效的治疗措施. 抗LPS mAb作为一种有中和活性的免疫制剂，对治疗内毒素血症及其他内毒素引起的疾病有极其重要的临床价值. 但是，由于LPS在众多的不同种属细菌中的抗原性差异，用单一或几个种属细菌的LPS免疫小鼠所制备的抗LPS mAb存在着显著的交叉反应局限性，不能中和其他种属细菌LPS的毒性作用，致使其应用受到限制.
脂多糖高密度脂蛋白(LPS-HDL)复合物是LPS在体内代谢的一种中间产物,90%的LPS在体内形成LPS-HDL[3]，并具有与LPS同样的致休克与DIC活性，因此，LPS-HDL与LPS可能具有共同的抗原决定簇，不同种属的LPS形成的LPS-HDL复合物，也可能具有相同的抗原决定簇. 为了制备具有广泛交叉反应的mAb，我们首先制备了E.coli J5 LPS-HDL复合物，筛选出4株抗LPS mAb,并进一步验证了其抗LPS的性质.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 E.coli J5菌株;S.minisota R3，R4，R5，R60，R595及V.ch95 LPS由第二军医大学焦炳华教授惠赠;酚-氯仿-石油醚法(PCP)提取E.coli J5 LPS；参照Pollack[1]的方法提取类脂A;E.coli O26:B6,E.coli O55:B5,E.coli O111:B4,E.coli O127:B8购自中国生物制品药品检定所;大肠埃希菌、铜绿色假单胞菌、催产克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、豚鼠气单胞菌、鼠伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和变形杆菌为本室保存菌株,以酚-水法分别提取LPS. G7F9细胞株为由单纯LPS筛选所得抗LPS mAb，由本室制备. 内毒素-高密度脂蛋白复合物(LPS-HDL)的制备参照文献[4],取新鲜血浆(含20 mmol*L-1 EDTA) 3 mL,加入100 μg LPS,37℃温育1 h,加入3 mL KBr(d=1.06),100 000 g离心2.5 h,取上清2 mL,经透析去掉KBr后备用. 分别以E.coli J5热杀死菌体2×108和LPS 30 μg按常规法免疫BALB/c鼠并融合制备抗LPS mAb. 取LPS-HDL,以PBS稀释50倍,LPS(10 mg*L-1),分别包被酶联板[5],检测细胞阳性孔上清,ABTS显色,测定A410 nm.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 检测方法 间接ELISA:包被不同属细菌LPS，10 μg*mL-1，PBS作空白对照，金黄色葡萄球菌超声粉碎上清做为阴性对照，其余同上文间接ELISA，并用TMB显色，测定A450 nm. Western斑点杂交:用Bio-rad微型垂直电泳仪,将LPS同时行两块SDS-PAGE凝胶电泳,完毕后,一块行银染色,一块行转印电泳,125 mA,7 h,50 g*L-1脱脂奶粉室温封闭2 h,,经PBS洗涤3次,加mAb(腹水10倍稀释), 4℃作用2 h,洗涤后,浸入羊抗鼠HRP-IgG,室温2 h,洗涤,TMB显色.
1.2.2 生物学活性 ①mAb对LPS体外诱导细胞释放TNF-α和IL-6的影响：收集正常人外周抗凝血,按常规法用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,用100 mL*L-1小牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度至5×106*mL-1,加入96孔板,每孔1×106个细胞(200 μL),37℃培养24 h,加入LPS和系列稀释的抗体,继续培养4 h,收集上清. TNF-α和IL-6测定分别按其 ELISA检测试剂盒(购自第四军医大学免疫学教研室)说明书进行； ②mAb对LPS攻击小鼠的保护作用:将昆明小鼠随机分成数目相同的4组,每组10只,分别经尾静脉注入C3A2,H3D3和对照抗LPS mAb G7F9各100 μg,4 h以后,经尾静脉注入E.coli J5 LPS各10 μg,攻击同时一组为生理盐水对照，48 h内统计小鼠死亡情况； ③mAb对革兰阴性菌攻击小鼠的保护作用:参照Appelmelk等[6]建立大肠杆菌、铜绿色假单胞菌和鼠伤寒沙门菌小鼠菌血症模型. 将昆明小鼠随机分成数目相同的12组,每组5只,其中5组分别由腹腔(ip)注入混合毒力促进剂的10倍系列稀释菌液, 另5组注入未加毒力促进剂的10倍系列稀释菌液,其余2组分别由腹腔注入毒力促进剂和生理盐水作为对照,72 h内统计小鼠死亡情况,按改良寇氏法计算LD50. 将18～22 g昆明小鼠随机分成4组,分别由腹腔注入抗LPS C3A2和H3D3 mAb和生理盐水,以及对照抗LPS mAb G7F9. 4 h后,经腹腔攻入混合毒力促进剂的活菌液,其中大肠杆菌和铜绿色假单胞菌注入量均为3×LD50, 鼠伤寒沙门菌注入量为5×LD50. 72 h内统计小鼠死亡情况. 试验组与对照组存活率间差异的显著性用卡方检验进行判定.
, 百拇医药
2 结果
2.1 mAb的制备与鉴定 共获得4株抗LPS mAb, 分别命名为C3A2，A11B5，F1F9，H3D3. ELISA结果表明,在与18株不同菌株LPS的反应中,4株mAb表现出明显的交叉反应性,其中C3A2和H3D3与全部试验用LPS均有交叉反应，且反应程度最强(Tab 1). Western印迹试验表明C3A2 mAb与3株光滑型细菌LPS和4株粗糙型细菌LPS均有反应,反应位置多位于LPS电泳条带的底端,即类脂A的位置上(Fig 1).
图 1 mAb与不同种属细菌LPS的交叉反应性Western-blot
Fig 1 Cross-reactivities of mAb to heterologous LPS by Western-blot
Lane 1: Re LPS; Lane 2: Rd LPS; Lane 3: Rc LPS; Lane 4: Ra LPS Lane 5:E.coli O111:B4 LPS; Lane 6:E.coli O127:B8 LPS; Lane 7:E.coli J5 LPS.
, 百拇医药
2.2 生物学活性
2.2.1 mAb对细胞释放TNF-α,IL-6的影响 随着mAb浓度的升高,TNF-α和IL-6水平均呈下降趋势，与生理盐水对照组相比,差异显著(P<0.01)，提示C3A2,H3D3 mAb可抑制LPS刺激淋巴细胞释放TNF-α和IL-6的作用(Fig 2).
2.2.2 mAb对LPS攻击的小鼠的保护作用 C3A2和H3D3均对E.coli J5 LPS攻击的小鼠有保护作用，C3A2保护效果最好，于生理盐水对照组比，存活率提高60%, H3D3 mAb稍弱,提高存活率40%,G7F9未显示明显的保护效果(P<0.01,Fig 3).
表 1 mAb与各种细菌LPS的ELISA交叉反应性
Tab 1 Cross-reactivities of mAb to heterologous LPS
, 百拇医药
LPS
C3-A2
All-B5
F1-F9
H2-3D3
Smooth LPS
E.coli O26:B6
+
E.coli O55:B5
, 百拇医药
E.coli O111:B4
E.coli O127:B8
-
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E.coli
-
Ps.aeruginosa
-
+
K.oxytoca
-
, 百拇医药
K.pneumoniae
-
A.caviae
-
S.typhi-murium
, 百拇医药
-
S.paratyphi B
-
Proteus
-
+
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Rough LPS
E.coli J5
+
S.minisota R60
R3
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+
R4
+
R5
-
R595
, 百拇医药
-
LPS-HDL
E.coli J5
S.minisota R60
, 百拇医药
R3
+
R4
+
R5
, 百拇医药
-
R595
+
图 2 mAb对hPMBC分泌TNF-α和IL-6的抑制作用
Fig 2 Inhibition of mAb C3A2 and H3D3 on TNF-αand IL-6 secreted by S.typhi R4 LPS-stimulating human PBMC
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2.2.3 C3A2对被致死剂量细菌攻击的小鼠的保护作用 C3A2 mAb不仅对E.coli菌株攻击的小鼠有保护作用,而且对铜绿色假单胞菌和鼠伤寒沙门菌攻击的小鼠有保护作用,C3A2各试验组与对照组比较,存活率均存在明显差异(P<0.01,Fig 4).
图 3 mAb对E.coli J5 LPS攻击小鼠的保护
Fig 3 Protection of mAb on mice challenged by E.coli J5 LPS
图 4 C3A2对被致死剂量细菌攻击的小鼠的保护
Fig 4 Protective effects of mAb on survival rate of mice challenged by GNB of lethal dose
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3 讨论
影响抗LPS mAb广泛交叉反应的因素大体可分为3类，即种属差异、提取和溶解因素及非特异性因素[7],为了避免这些因素的影响,特别是种属差异和非特异性因素的影响,我们采取了以LPS-HDL复合物筛选mAb的方法,因各种属细菌的LPS在体内均形成LPS-HDL复合物. 该复合物除没有热原作用及致白细胞减少、血小板减少等作用有所减低外,完全保留了LPS的致休克与DIC的生物学活性[3],说明LPS激活机体关键系统的位点同样存在于LPS-HDL复合物上. 由于LPS-HDL的形成,使LPS的密度由1.38 g*cm-3降低到1.2 g*cm-3以下,从而明显减少和改变了抗原位点[8],因此,LPS的某些作用位点可能比从静态菌中提取的LPS更加突出,使得LPS因种属差异而造成的多糖侧链及其他成分遮蔽作用的限制明显减弱. 我们的试验由LPS-HDL筛选得到的4株单抗,2株具有广泛交叉反应性,另2株推测可能是由于亲和力较低而未能表现广泛交叉反应性.
, 百拇医药
实验证明,C3A2和H3D3 mAb有明显延长小鼠存活率的作用,由大肠J5菌LPS攻击的小鼠中, 预先注入mAb组的存活率分别为70%和50%,明显高于对照组的10%,用E.coli O111∶B4、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿色假单胞菌攻击的小鼠中,预先注入mAb组的存活率也明显高于对照组；而以单纯LPS筛选得到的G7F9 mAb却不具备明显的保护作用；显示了C3A2和H3D3 mAb的交叉保护活性，提示以LPS-HDL制备广谱抗LPS mAb具有积极的意义，LPS-HDL可能是LPS在体内发挥毒性作用的重要和共同结构形式.
尽管该mAb保护作用与输入剂量和时间等的关系，以及在体内发挥作用的机制尚须研究,但广谱抗内毒素单克隆抗体作为诊断和免疫治疗一种新的手段,在早期诊断和补充、 调整抗菌药物治疗GNB感染中的重要性正为多数人所公认. 随着对抗LPS mAb研究的不断深入, 有望可能应用到临床治疗.
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800154)
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作者简介：马越云(1968-)，男(汉族)， 河北省唐山市. 微生物专业博士生(导师马文煜)，主要研究领域感染与免疫，获军队科技进步三等奖2项. Tel.(029)3375572 Email.mayueyun@163.net
参考文献：
[1] Steven MO, Richard L. Antiendotoxin strategies for the prevention and treatment of septic shock [review][J]. Drugs,1998;55(4):497-508.
[2] Cross AS, Opal SM. Therapeutic intervention in sepsis with antibody to endotoxin:Is there a future?[J]. J Endotoxin Res,1994;1:57-69.
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[3] 焦炳华. 分子内毒素学[M]. 上海：上海科学技术出版社,1996：131-138.
[4] Cheung MC,Segrest JP,Albers JJ et al. Characterization of high density lipoprotein subspecies:Strutural studies by single vertical spin ultracentrifugation and immunoaffinity chromatography[J]. J Lipid Res,1987;28:913-928.
[5] Heumann D, Baumgartner JD, Jacot-Guillarmod H et al. Antibodies to core lipopolysaccharide determinants: Absense of cross-reactivity with heterologous lipopolysaccharides[J]. J Infect Dis,1991;163:762-768.
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[6] Appelmelk JB et al. Use of mucin and hemoglobin in experimental murine gram-negative bacteremia enhances the immunoprotective action of antibodies reactive with the lipopolysacchaiide core region[J]. Anto Van Leeuwenkoek, 1986;52:537-541.
[7] 马越云. 抗内毒素单克隆抗体的实验研究[J]. 国外医学临床生物化学及检验学分册, 1996;6:280-282.
[8] Ziegler EJ,Fisher CJ,Sprung CL et al. Tretment of gram-negative bacteremia and septic shock with HA-1A human monoclonal antibody against endotoxin[J]. J Med, 1991;324(7):429-436.
收稿日期:2000-03-10; 修回日期:2000-06-05, http://www.100md.com
单位：第四军医大学西京医院检验科，陕西 西安 710033
关键词：单克隆抗体；脂多糖；生物学活性
第四军医大学学报001020 摘 要： 目的 鉴定抗LPS mAb对不同种属细菌及其LPS的交叉反应性和保护活性. 方法 以间接ELISA，Western 印迹试验鉴定mAb对不同种属细菌及其LPS的交叉反应性；检测不同浓度mAb对LPS诱导的淋巴细胞分泌TNF-α和IL-6的抑制作用；以大肠埃希菌、铜绿色假单胞菌、鼠伤寒沙门菌建立小鼠菌血症模型，鉴定mAb的保护作用. 结果 在ELISA试验中，抗LPS mAb C3A2 和H3D3可与鉴定所用的18株革兰阴性菌产生交叉反应；在Western印迹试验中可与鉴定所用的全部7个种属的LPS产生交叉反应；随mAb浓度的提高，LPS诱导淋巴细胞分泌TNF-α和IL-6的作用受到抑制；在动物保护试验中，相对于生理盐水对照组，存活率提高30%～60%. 结论 抗LPS mAb C3A2 和H3D3不仅对众多革兰阴性菌LPS具有广泛交叉反应性,而且具有高保护活性.
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中图号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1234-04
Biologic characters of mAb against LPS
MA Yue-Yun, SU Ming-Quan, DING Zhen-Ruo,YU Win-Bin
(Department of Clinical Laboratory,Xijing Hospital, Fourth Military Medical University,Xi'an 710033, China)
Abstract:AIM To investigate the cross-reactivity and protectivity of mAbs against LPS. METHODS By using inhibition ELISA and Western-blot we identified the cross-reactivity of these McAbs, and by using E.coli O114:B5，S.typhim urium and P.aeruginosa to challenge mice we determined the protective role of these mAbs. RESULTS C3A2 and H2-3D3 mAbs against LPS cross-reacted with all the 18 grem-negative bacterial LPS available in ELISA and the 7 in Western-blot. In the mouse protective test, the rate of survival was enhanced about 30%～60%. CONCLUSION C3A2 and H2-3D3 mAb against LPS have not only broadly cross-reactivity binding to heterologous LPS but also high protectivity.
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Keywords: monoclonal antibody; LPS;bioactivity
0 引言
LPS是革兰阴性细菌(GNB)外膜的主要组成部分，是革兰阴性细菌致病的重要因素. 近20年来的研究不断证实,GNB败血症及感染性休克的发病及致死的主要原因,是由于GNB释放的或从肠道进入体内的LPS所引起[1]. 使用抗生素治疗此类疾患,死亡率仍高达45%[2],目前尚无有效的治疗措施. 抗LPS mAb作为一种有中和活性的免疫制剂，对治疗内毒素血症及其他内毒素引起的疾病有极其重要的临床价值. 但是，由于LPS在众多的不同种属细菌中的抗原性差异，用单一或几个种属细菌的LPS免疫小鼠所制备的抗LPS mAb存在着显著的交叉反应局限性，不能中和其他种属细菌LPS的毒性作用，致使其应用受到限制.
脂多糖高密度脂蛋白(LPS-HDL)复合物是LPS在体内代谢的一种中间产物,90%的LPS在体内形成LPS-HDL[3]，并具有与LPS同样的致休克与DIC活性，因此，LPS-HDL与LPS可能具有共同的抗原决定簇，不同种属的LPS形成的LPS-HDL复合物，也可能具有相同的抗原决定簇. 为了制备具有广泛交叉反应的mAb，我们首先制备了E.coli J5 LPS-HDL复合物，筛选出4株抗LPS mAb,并进一步验证了其抗LPS的性质.
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1 材料和方法
1.1 材料 E.coli J5菌株;S.minisota R3，R4，R5，R60，R595及V.ch95 LPS由第二军医大学焦炳华教授惠赠;酚-氯仿-石油醚法(PCP)提取E.coli J5 LPS；参照Pollack[1]的方法提取类脂A;E.coli O26:B6,E.coli O55:B5,E.coli O111:B4,E.coli O127:B8购自中国生物制品药品检定所;大肠埃希菌、铜绿色假单胞菌、催产克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、豚鼠气单胞菌、鼠伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和变形杆菌为本室保存菌株,以酚-水法分别提取LPS. G7F9细胞株为由单纯LPS筛选所得抗LPS mAb，由本室制备. 内毒素-高密度脂蛋白复合物(LPS-HDL)的制备参照文献[4],取新鲜血浆(含20 mmol*L-1 EDTA) 3 mL,加入100 μg LPS,37℃温育1 h,加入3 mL KBr(d=1.06),100 000 g离心2.5 h,取上清2 mL,经透析去掉KBr后备用. 分别以E.coli J5热杀死菌体2×108和LPS 30 μg按常规法免疫BALB/c鼠并融合制备抗LPS mAb. 取LPS-HDL,以PBS稀释50倍,LPS(10 mg*L-1),分别包被酶联板[5],检测细胞阳性孔上清,ABTS显色,测定A410 nm.
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1.2 方法
1.2.1 检测方法 间接ELISA:包被不同属细菌LPS，10 μg*mL-1，PBS作空白对照，金黄色葡萄球菌超声粉碎上清做为阴性对照，其余同上文间接ELISA，并用TMB显色，测定A450 nm. Western斑点杂交:用Bio-rad微型垂直电泳仪,将LPS同时行两块SDS-PAGE凝胶电泳,完毕后,一块行银染色,一块行转印电泳,125 mA,7 h,50 g*L-1脱脂奶粉室温封闭2 h,,经PBS洗涤3次,加mAb(腹水10倍稀释), 4℃作用2 h,洗涤后,浸入羊抗鼠HRP-IgG,室温2 h,洗涤,TMB显色.
1.2.2 生物学活性 ①mAb对LPS体外诱导细胞释放TNF-α和IL-6的影响：收集正常人外周抗凝血,按常规法用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,用100 mL*L-1小牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度至5×106*mL-1,加入96孔板,每孔1×106个细胞(200 μL),37℃培养24 h,加入LPS和系列稀释的抗体,继续培养4 h,收集上清. TNF-α和IL-6测定分别按其 ELISA检测试剂盒(购自第四军医大学免疫学教研室)说明书进行； ②mAb对LPS攻击小鼠的保护作用:将昆明小鼠随机分成数目相同的4组,每组10只,分别经尾静脉注入C3A2,H3D3和对照抗LPS mAb G7F9各100 μg,4 h以后,经尾静脉注入E.coli J5 LPS各10 μg,攻击同时一组为生理盐水对照，48 h内统计小鼠死亡情况； ③mAb对革兰阴性菌攻击小鼠的保护作用:参照Appelmelk等[6]建立大肠杆菌、铜绿色假单胞菌和鼠伤寒沙门菌小鼠菌血症模型. 将昆明小鼠随机分成数目相同的12组,每组5只,其中5组分别由腹腔(ip)注入混合毒力促进剂的10倍系列稀释菌液, 另5组注入未加毒力促进剂的10倍系列稀释菌液,其余2组分别由腹腔注入毒力促进剂和生理盐水作为对照,72 h内统计小鼠死亡情况,按改良寇氏法计算LD50. 将18～22 g昆明小鼠随机分成4组,分别由腹腔注入抗LPS C3A2和H3D3 mAb和生理盐水,以及对照抗LPS mAb G7F9. 4 h后,经腹腔攻入混合毒力促进剂的活菌液,其中大肠杆菌和铜绿色假单胞菌注入量均为3×LD50, 鼠伤寒沙门菌注入量为5×LD50. 72 h内统计小鼠死亡情况. 试验组与对照组存活率间差异的显著性用卡方检验进行判定.
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2 结果
2.1 mAb的制备与鉴定 共获得4株抗LPS mAb, 分别命名为C3A2，A11B5，F1F9，H3D3. ELISA结果表明,在与18株不同菌株LPS的反应中,4株mAb表现出明显的交叉反应性,其中C3A2和H3D3与全部试验用LPS均有交叉反应，且反应程度最强(Tab 1). Western印迹试验表明C3A2 mAb与3株光滑型细菌LPS和4株粗糙型细菌LPS均有反应,反应位置多位于LPS电泳条带的底端,即类脂A的位置上(Fig 1).
图 1 mAb与不同种属细菌LPS的交叉反应性Western-blot
Fig 1 Cross-reactivities of mAb to heterologous LPS by Western-blot
Lane 1: Re LPS; Lane 2: Rd LPS; Lane 3: Rc LPS; Lane 4: Ra LPS Lane 5:E.coli O111:B4 LPS; Lane 6:E.coli O127:B8 LPS; Lane 7:E.coli J5 LPS.
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2.2 生物学活性
2.2.1 mAb对细胞释放TNF-α,IL-6的影响 随着mAb浓度的升高,TNF-α和IL-6水平均呈下降趋势，与生理盐水对照组相比,差异显著(P<0.01)，提示C3A2,H3D3 mAb可抑制LPS刺激淋巴细胞释放TNF-α和IL-6的作用(Fig 2).
2.2.2 mAb对LPS攻击的小鼠的保护作用 C3A2和H3D3均对E.coli J5 LPS攻击的小鼠有保护作用，C3A2保护效果最好，于生理盐水对照组比，存活率提高60%, H3D3 mAb稍弱,提高存活率40%,G7F9未显示明显的保护效果(P<0.01,Fig 3).
表 1 mAb与各种细菌LPS的ELISA交叉反应性
Tab 1 Cross-reactivities of mAb to heterologous LPS
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LPS
C3-A2
All-B5
F1-F9
H2-3D3
Smooth LPS
E.coli O26:B6
+
E.coli O55:B5
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E.coli O111:B4
E.coli O127:B8
-
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E.coli
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Ps.aeruginosa
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K.oxytoca
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K.pneumoniae
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A.caviae
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S.typhi-murium
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S.paratyphi B
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Proteus
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+
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Rough LPS
E.coli J5
+
S.minisota R60
R3
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+
R4
+
R5
-
R595
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-
LPS-HDL
E.coli J5
S.minisota R60
, 百拇医药
R3
+
R4
+
R5
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R595
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图 2 mAb对hPMBC分泌TNF-α和IL-6的抑制作用
Fig 2 Inhibition of mAb C3A2 and H3D3 on TNF-αand IL-6 secreted by S.typhi R4 LPS-stimulating human PBMC
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2.2.3 C3A2对被致死剂量细菌攻击的小鼠的保护作用 C3A2 mAb不仅对E.coli菌株攻击的小鼠有保护作用,而且对铜绿色假单胞菌和鼠伤寒沙门菌攻击的小鼠有保护作用,C3A2各试验组与对照组比较,存活率均存在明显差异(P<0.01,Fig 4).
图 3 mAb对E.coli J5 LPS攻击小鼠的保护
Fig 3 Protection of mAb on mice challenged by E.coli J5 LPS
图 4 C3A2对被致死剂量细菌攻击的小鼠的保护
Fig 4 Protective effects of mAb on survival rate of mice challenged by GNB of lethal dose
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3 讨论
影响抗LPS mAb广泛交叉反应的因素大体可分为3类，即种属差异、提取和溶解因素及非特异性因素[7],为了避免这些因素的影响,特别是种属差异和非特异性因素的影响,我们采取了以LPS-HDL复合物筛选mAb的方法,因各种属细菌的LPS在体内均形成LPS-HDL复合物. 该复合物除没有热原作用及致白细胞减少、血小板减少等作用有所减低外,完全保留了LPS的致休克与DIC的生物学活性[3],说明LPS激活机体关键系统的位点同样存在于LPS-HDL复合物上. 由于LPS-HDL的形成,使LPS的密度由1.38 g*cm-3降低到1.2 g*cm-3以下,从而明显减少和改变了抗原位点[8],因此,LPS的某些作用位点可能比从静态菌中提取的LPS更加突出,使得LPS因种属差异而造成的多糖侧链及其他成分遮蔽作用的限制明显减弱. 我们的试验由LPS-HDL筛选得到的4株单抗,2株具有广泛交叉反应性,另2株推测可能是由于亲和力较低而未能表现广泛交叉反应性.
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实验证明,C3A2和H3D3 mAb有明显延长小鼠存活率的作用,由大肠J5菌LPS攻击的小鼠中, 预先注入mAb组的存活率分别为70%和50%,明显高于对照组的10%,用E.coli O111∶B4、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿色假单胞菌攻击的小鼠中,预先注入mAb组的存活率也明显高于对照组；而以单纯LPS筛选得到的G7F9 mAb却不具备明显的保护作用；显示了C3A2和H3D3 mAb的交叉保护活性，提示以LPS-HDL制备广谱抗LPS mAb具有积极的意义，LPS-HDL可能是LPS在体内发挥毒性作用的重要和共同结构形式.
尽管该mAb保护作用与输入剂量和时间等的关系，以及在体内发挥作用的机制尚须研究,但广谱抗内毒素单克隆抗体作为诊断和免疫治疗一种新的手段,在早期诊断和补充、 调整抗菌药物治疗GNB感染中的重要性正为多数人所公认. 随着对抗LPS mAb研究的不断深入, 有望可能应用到临床治疗.
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800154)
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作者简介：马越云(1968-)，男(汉族)， 河北省唐山市. 微生物专业博士生(导师马文煜)，主要研究领域感染与免疫，获军队科技进步三等奖2项. Tel.(029)3375572 Email.mayueyun@163.net
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收稿日期:2000-03-10; 修回日期:2000-06-05, http://www.100md.com