金匮肾气丸抗自由基和细胞凋亡的作用
作者：王新玲 李月彩 侯颖春
单位：第四军医大学西京医院老年病科,陕西 西安 710033
关键词：中药；抗衰老；自由基；细胞凋亡
第四军医大学学报001013 摘 要: 目的 探讨中药经方金匮肾气丸的抗衰老作用及其机制. 方法 15 mo龄SD大鼠被随机分为2组，实验组大鼠口饲金匮肾气丸浓缩制剂3 mo. 以大鼠血液SOD活性水平和MDA含量以及肾上腺和脑垂体组织的细胞凋亡率作为检测指标进行检测. 结果 连续用药24 d后，实验组大鼠血液SOD活性水平明显高于对照组(P<0.05). 实验组大鼠血液MDA水平在用药32 d后明显低于对照组(P<0.05). 以上变化随用药时间的延长呈更显著趋势(至48 d时均为P<0.01). 用药90 d后实验组大鼠肾上腺、脑垂体组织细胞凋亡率明显低于对照组(肾上腺：P<0.01；脑垂体：P<0.01). 结论 金匮肾气丸能够显著提高大鼠血液SOD活性，抑制自由基生成并降低MDA水平，细胞凋亡率显著降低. 这些作用可能是金匮肾气丸抗衰老作用的重要的机制之一.
, http://www.100md.com
中图号:R242 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1209-03
Jingguishenqi pill has anti-aging effect
WANG Xin-Ling, LI Yue-Cai, HOU Ying-Chun
(Departmnt of Geriatrics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
Abstract:AIM To find the role and mechanism of jingguishenqi pill in anti-aging. METHODS 15-month old SD rats were randomly divided into two groups. The experimental group was treated by traditional Chinese medicine drug“jingguishenqi pill”for 3 mo. The parameters of blood levels of MDA and SOD in rats were observed. The rate of apoptosis adrenal gland and pituitary tissues of rats were examined. RESULTS Blood SOD activity blood of experimental group was higher than in control group 24 d after having Chinese medicine to rats(P<0.05). MDA level was lower after 32 days (P<0.05). The changes became much more obvious with the time of feeding jingguishenqi pill (after 48 d:P<0.01). Three months after feeding the Chinese drug, the apoptosis rat adrenal gland and pituitary was lower than that of control group(adrenal gland: P<0.01; pituitary: P<0.01). CONCLUSION Jingguishenqi pill can increase SOD level and inhibit the forming of free radicals. The apoptosis rate of cells in some important organs can be decreased. Jingguishenqi pill has its role of anti-aging.
, 百拇医药
Keywords:traditional Chinese drug; anti-aging; free radicals; apoptosis
0 引言
国内外大量研究已经证实补肾药物具有抗衰老作用. 金匮肾气丸是中国传统的温补肾阳抗衰老的代表方剂，临床广泛应用于伴衰老症状的改善，但至今其抗衰老的机制仍不十分清楚. 在自由基、自由基清除剂与细胞凋亡(apoptosis)以及相互关系[1，2]与金匮肾气丸抗衰老的作用国内尚未见报告. 我们旨在研究探讨自由基、自由基清除剂及细胞凋亡在金匮肾气丸抗衰老作用中是否起了某种作用.
1 材料和方法
1.1 材料 金匮肾气丸制剂按经典方剂自本院中药房取药并煎制成浓缩汤剂，大约含生药3 g*L-1. 选择15 mo龄雌性老年前期SD大鼠50只，体质量(300±25)g(由本校实验动物中心提供)，随机分成2组，各组25只.
, 百拇医药
1.2 方法 实验组用标准注射器安置灌胃针头,灌服药物2 mL*d-1,含生药0.6 g*d-1(根据文献[3]估算),对照组用同样方法灌服生理盐水2 mL*d-1. 自喂药开始每8 d经大鼠尾部剪尾采血1次，共采血6次,每次采血0.5 mL，迅速置肝素抗凝试管并离心，分别取红细胞和上清液做红细胞超氧化物歧化酶(SOD)和血清丙二醛(MDA)检测. 红细胞SOD活性检测[4]采用南京建成生物工程研究所提供的SOD活性检测试剂盒. 将分离后的红细胞做SOD抽提，取SOD抽提液10 μL 以化学发光法原理按试剂盒要求步骤严格操作，721分光光度仪(四川分析仪器厂生产)550 μm处比色取A值. 同时用XH-血红蛋白仪(国营湖光仪器厂生产)检测大鼠血红蛋白含量. 根据如下公式计算其值. 全血SOD活力(×103 NU*L-1)=(对照管A-测定管A)÷对照管A÷50%×稀释倍数. 红细胞HbSOD活力(NU*g-1)=全血SOD活力(×103 NU*L-1)÷大鼠Hb含量(g*L-1). MDA含量检测[5]使用南京建成生物工程研究所提供的MDA含量检测试剂盒. 取分离的大鼠血清100 μL以硫代巴比妥酸比色法原理按试剂盒要求操作，721分光光度仪532 μm处比色取A值按如下公式计算MDA含量. 丙二醛含量(μmol*L-1)=(测定管A-测定空白管A)÷(标准管A-标准空白管A)×10 μmol*L-1×样品稀释倍数.大鼠喂药90 d时，脱颈处死，取其脑垂体、肾上腺快速置于100 mL*L-1中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm厚切片，60℃烘烤过夜，以备细胞凋亡检测. 原位末端标记法(TUNEL)[6] 检测细胞凋亡试剂盒选自武汉博士德生物工程有限公司，切片脱蜡和水化，以20 mg*L-1蛋白酶K37℃消化15 min，洗涤后，10 μL*片-1标准缓冲液室温5 min后甩掉，取TdT酶和DIG-d-UTP各1 μL与8 μL标准缓冲液混匀，置玻片37℃2 h后TBS冲洗，封闭液50 μL*片-1，30 min后甩掉，Anti-DIG-AP作用30 min TBS洗5 min×5次，BCIP/NBT显色2 h，水洗后封片. 采用日本Olympus公司的光学显微镜对阳性细胞进行细胞凋亡指数(平均每高倍视野的细胞凋亡个数)统计. 同时切片做HE染色.
, 百拇医药
统计学处理：采用t检验对数字处理分析.
2 结果
2.1 大鼠血红细胞SOD活性 大鼠用药24 d时，实验组大鼠红细胞SOD活性水平开始高于对照组(P<0.05). 这种变化随用药时间的延长呈加剧趋势，当用药40,48 d时，与对照组数据差别更显著(P<0.01， Tab 1).
2.2 大鼠血清MDA结果 MDA的变化略迟于SOD，当用药32 d时，实验组大鼠血清MDA含量开始低于对照组(P<0.05)，当用药至40和48 d时，与对照组数据呈现更显著性差别(P<0.01, Tab 2).
表 1 大鼠RBC SOD结果比较
Tab 1 RBC SOD in rats
(NU*g-1，
±s)
, http://www.100md.com
t(taking drug)*d-1
Group
8
16
24
32
40
48
Exp.
26 626±5185a
28 547±8890a
25 951±5285b
, http://www.100md.com
28 159±561330 213±5555c
27 838±4251c
Contr.
25269±4972
22901±7449
21883±4826
21523±4756
24611±3961
19287±3084
aP<0.05,bP<0.01.
, 百拇医药
表 2 大鼠血清MDA
Tab 2 Serum MDA in rats(μmol*L-1，±s)
t(taking drug)*d-1
Group
8
16
24
32
40
48
, 百拇医药
Exp.
2.24±0.78a
2.27±0.95a
2.04±1.07a
2.12±0.92b
3.01±0.57
3.52±0.93c
Contr.
2.05±0.66
1.80±0.47
, 百拇医药 1.99±0.26
2.45±0.79
3.92±0.73
4.66±0.59
aP<0.05,bP<0.01.
2.3 肾上腺及脑垂体TUNEL染色 大鼠喂药90 d后，TUNEL染色肾上腺、脑垂体组织细胞，高倍显微镜下细胞形态观察，实验组阳性细胞核固缩，着色较浅，散在分布. 对照组其阳性细胞核呈深蓝色颗粒，均匀致密，部分成簇，部分散在. 对两组进行统计学处理，实验组大鼠脑垂体、肾上腺细胞凋亡指数较对照组明显降低. (P<0.01, Tab 3).标本连续切片后，HE染色,典型的凋亡细胞呈现细胞体积变小，细胞表面扭曲不平，可见出泡现象，细胞核固缩，染色体边集呈现新月体. 表 3 肾上腺与脑垂体TUNEL染色细胞凋亡指数
, 百拇医药
Tab 3 Apoptosis index with TUNEL dye in adrenal and pituitary glands
(
±s) Group
Adrenal
Pituitary
Exp.
23.40±4.28b
17.64±2.10b
Contr.
32.22±4.84
, http://www.100md.com
22.36±2.19
bP<0.01.
3 讨论
体内自由基含量随年龄增长而积累，体内清除自由基的各种酶类的防御功能也随年龄增长而衰减，导致碱基缺失，氢键破坏，蛋白质交联，多肽链断裂，发生脂质过氧化反应，生成丙二醛，加快细胞中DNA、蛋白质、脂膜等损伤，促进细胞凋亡发生，大量组织细胞凋亡的结果使机体老化[7,8]，引发某些退行性疾病[9]. 衰老的实质就是细胞凋亡[10]. 因而自由基、细胞凋亡与衰老具有十分密切的联系.
实验结果表明，连续用药24 d起，SOD活性水平开始升高，32 d后MDA开始下降，用药40和48 d时，这种趋势更加显著，明显提高了血中SOD活性水平，降低了MDA含量，提高了自由基清除能力，降低了脂质过氧化物反应，阻滞了生物分子间的交联反应，老年色素及脂褐素生成减少，用药90 d后，与对照组比较，大鼠肾上腺、脑垂体组织的细胞凋亡指数明显降低，阻遏了蛋白质的溶解、变性，保证了细胞膜结构和功能的完整. 延缓了细胞凋亡的发生. 可以认为金匮肾气丸主要是提高SOD活力，清除自由基，抑制细胞凋亡而起到补肾抗衰老的作用. 国内外许多学者在补肾抗衰老研究中取得举世嘱目的成就. 沈自尹等[11，12]选用补肾中药对雄性动物及临床证效进行观察，他们证实了补肾药物对雄性动物抗衰老作用. 从另一侧面，我们选用雌性老年前期大鼠观察金匮肾气丸抗衰老作用.
, 百拇医药
致 谢 王伯云、晏培松教授、王多宁主管技师对本实验给予了悉心指导.
作者简介:王新玲(1962-)，女(汉族),山东省荣城县人. 主治医师，1997级基金班学员(导师李月彩). Tel.(029)3375243
参考文献:
[1] Wang E, Lee MJ, Pandey S et al. Control of fibroblast senescence and activiation of programmed cell death[J]. J Cell Biochem, 1994;54:432-439.
[2] 赵世民. 医学自由基基础与临床[M]. 济南：山东大学出版社，1993：212-216.
[3] 徐叔云. 药理实验方法学[M]. 北京：人民卫生出版社，1994:1230-1231.
, 百拇医药
[4] 季健平，吴再斌，刘歧山et al. 超氧化物歧化酶超微量快速测定法. 南京铁道医学院学报，1991；10：27-29.
[5] 李建成，吴中立. 硫代巴比妥酸荧光法测定血清及组织过氧化物[J]. 第二军医大学学报，1987；5(8)：371-373.
[6] Nakagawa S, Shiraishi T, Kihara S et al. Detection of DNA strand breaks associated with apoptosis in human brain trumors[J]. Virchows Arch, 1995;427:175.
[7] Cerutti P, Larsson R, Krupitza G et al. Pathophysiological mechanisms of active oxygen[J]. Mutat Res, 1989;214(1):81-88.
, 百拇医药
[8] Albina JE, Cui S, Mateo RB et al. Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritoned macrophages[J]. J Immunol, 1993;150(1):5080-5085.
[9] Haecker G, Vaux DL. Viral, worm and radical implications for apoptosis[J]. Trends Biochem Sci, 1994;19(3):99-100.
[10] 惠宏襄，赵小宁，金 明et al. 自由基与细胞凋亡[J]. 生物化学与生物物理进展，1996；23(1)：12-15.
[11] 沈自尹. 延缓衰老的研究思路[J]. 中医杂志，1991；32(1)：42.
[12] 沈自尹. 中医肾的古今论[J]. 中国中西医结合杂志，1997；38(1)：49.
收稿日期:1999-12-15; 修回日期:2000-02-17, http://www.100md.com
单位：第四军医大学西京医院老年病科,陕西 西安 710033
关键词：中药；抗衰老；自由基；细胞凋亡
第四军医大学学报001013 摘 要: 目的 探讨中药经方金匮肾气丸的抗衰老作用及其机制. 方法 15 mo龄SD大鼠被随机分为2组，实验组大鼠口饲金匮肾气丸浓缩制剂3 mo. 以大鼠血液SOD活性水平和MDA含量以及肾上腺和脑垂体组织的细胞凋亡率作为检测指标进行检测. 结果 连续用药24 d后，实验组大鼠血液SOD活性水平明显高于对照组(P<0.05). 实验组大鼠血液MDA水平在用药32 d后明显低于对照组(P<0.05). 以上变化随用药时间的延长呈更显著趋势(至48 d时均为P<0.01). 用药90 d后实验组大鼠肾上腺、脑垂体组织细胞凋亡率明显低于对照组(肾上腺：P<0.01；脑垂体：P<0.01). 结论 金匮肾气丸能够显著提高大鼠血液SOD活性，抑制自由基生成并降低MDA水平，细胞凋亡率显著降低. 这些作用可能是金匮肾气丸抗衰老作用的重要的机制之一.
, http://www.100md.com
中图号:R242 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1209-03
Jingguishenqi pill has anti-aging effect
WANG Xin-Ling, LI Yue-Cai, HOU Ying-Chun
(Departmnt of Geriatrics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
Abstract:AIM To find the role and mechanism of jingguishenqi pill in anti-aging. METHODS 15-month old SD rats were randomly divided into two groups. The experimental group was treated by traditional Chinese medicine drug“jingguishenqi pill”for 3 mo. The parameters of blood levels of MDA and SOD in rats were observed. The rate of apoptosis adrenal gland and pituitary tissues of rats were examined. RESULTS Blood SOD activity blood of experimental group was higher than in control group 24 d after having Chinese medicine to rats(P<0.05). MDA level was lower after 32 days (P<0.05). The changes became much more obvious with the time of feeding jingguishenqi pill (after 48 d:P<0.01). Three months after feeding the Chinese drug, the apoptosis rat adrenal gland and pituitary was lower than that of control group(adrenal gland: P<0.01; pituitary: P<0.01). CONCLUSION Jingguishenqi pill can increase SOD level and inhibit the forming of free radicals. The apoptosis rate of cells in some important organs can be decreased. Jingguishenqi pill has its role of anti-aging.
, 百拇医药
Keywords:traditional Chinese drug; anti-aging; free radicals; apoptosis
0 引言
国内外大量研究已经证实补肾药物具有抗衰老作用. 金匮肾气丸是中国传统的温补肾阳抗衰老的代表方剂，临床广泛应用于伴衰老症状的改善，但至今其抗衰老的机制仍不十分清楚. 在自由基、自由基清除剂与细胞凋亡(apoptosis)以及相互关系[1，2]与金匮肾气丸抗衰老的作用国内尚未见报告. 我们旨在研究探讨自由基、自由基清除剂及细胞凋亡在金匮肾气丸抗衰老作用中是否起了某种作用.
1 材料和方法
1.1 材料 金匮肾气丸制剂按经典方剂自本院中药房取药并煎制成浓缩汤剂，大约含生药3 g*L-1. 选择15 mo龄雌性老年前期SD大鼠50只，体质量(300±25)g(由本校实验动物中心提供)，随机分成2组，各组25只.
, 百拇医药
1.2 方法 实验组用标准注射器安置灌胃针头,灌服药物2 mL*d-1,含生药0.6 g*d-1(根据文献[3]估算),对照组用同样方法灌服生理盐水2 mL*d-1. 自喂药开始每8 d经大鼠尾部剪尾采血1次，共采血6次,每次采血0.5 mL，迅速置肝素抗凝试管并离心，分别取红细胞和上清液做红细胞超氧化物歧化酶(SOD)和血清丙二醛(MDA)检测. 红细胞SOD活性检测[4]采用南京建成生物工程研究所提供的SOD活性检测试剂盒. 将分离后的红细胞做SOD抽提，取SOD抽提液10 μL 以化学发光法原理按试剂盒要求步骤严格操作，721分光光度仪(四川分析仪器厂生产)550 μm处比色取A值. 同时用XH-血红蛋白仪(国营湖光仪器厂生产)检测大鼠血红蛋白含量. 根据如下公式计算其值. 全血SOD活力(×103 NU*L-1)=(对照管A-测定管A)÷对照管A÷50%×稀释倍数. 红细胞HbSOD活力(NU*g-1)=全血SOD活力(×103 NU*L-1)÷大鼠Hb含量(g*L-1). MDA含量检测[5]使用南京建成生物工程研究所提供的MDA含量检测试剂盒. 取分离的大鼠血清100 μL以硫代巴比妥酸比色法原理按试剂盒要求操作，721分光光度仪532 μm处比色取A值按如下公式计算MDA含量. 丙二醛含量(μmol*L-1)=(测定管A-测定空白管A)÷(标准管A-标准空白管A)×10 μmol*L-1×样品稀释倍数.大鼠喂药90 d时，脱颈处死，取其脑垂体、肾上腺快速置于100 mL*L-1中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm厚切片，60℃烘烤过夜，以备细胞凋亡检测. 原位末端标记法(TUNEL)[6] 检测细胞凋亡试剂盒选自武汉博士德生物工程有限公司，切片脱蜡和水化，以20 mg*L-1蛋白酶K37℃消化15 min，洗涤后，10 μL*片-1标准缓冲液室温5 min后甩掉，取TdT酶和DIG-d-UTP各1 μL与8 μL标准缓冲液混匀，置玻片37℃2 h后TBS冲洗，封闭液50 μL*片-1，30 min后甩掉，Anti-DIG-AP作用30 min TBS洗5 min×5次，BCIP/NBT显色2 h，水洗后封片. 采用日本Olympus公司的光学显微镜对阳性细胞进行细胞凋亡指数(平均每高倍视野的细胞凋亡个数)统计. 同时切片做HE染色.
, 百拇医药
统计学处理：采用t检验对数字处理分析.
2 结果
2.1 大鼠血红细胞SOD活性 大鼠用药24 d时，实验组大鼠红细胞SOD活性水平开始高于对照组(P<0.05). 这种变化随用药时间的延长呈加剧趋势，当用药40,48 d时，与对照组数据差别更显著(P<0.01， Tab 1).
2.2 大鼠血清MDA结果 MDA的变化略迟于SOD，当用药32 d时，实验组大鼠血清MDA含量开始低于对照组(P<0.05)，当用药至40和48 d时，与对照组数据呈现更显著性差别(P<0.01, Tab 2).
表 1 大鼠RBC SOD结果比较
Tab 1 RBC SOD in rats
(NU*g-1，
±s), http://www.100md.com
t(taking drug)*d-1
Group
8
16
24
32
40
48
Exp.
26 626±5185a
28 547±8890a
25 951±5285b
, http://www.100md.com
28 159±561330 213±5555c
27 838±4251c
Contr.
25269±4972
22901±7449
21883±4826
21523±4756
24611±3961
19287±3084
aP<0.05,bP<0.01.
, 百拇医药
表 2 大鼠血清MDA
Tab 2 Serum MDA in rats(μmol*L-1，
±s)t(taking drug)*d-1
Group
8
16
24
32
40
48
, 百拇医药
Exp.
2.24±0.78a
2.27±0.95a
2.04±1.07a
2.12±0.92b
3.01±0.57
3.52±0.93c
Contr.
2.05±0.66
1.80±0.47
, 百拇医药 1.99±0.26
2.45±0.79
3.92±0.73
4.66±0.59
aP<0.05,bP<0.01.
2.3 肾上腺及脑垂体TUNEL染色 大鼠喂药90 d后，TUNEL染色肾上腺、脑垂体组织细胞，高倍显微镜下细胞形态观察，实验组阳性细胞核固缩，着色较浅，散在分布. 对照组其阳性细胞核呈深蓝色颗粒，均匀致密，部分成簇，部分散在. 对两组进行统计学处理，实验组大鼠脑垂体、肾上腺细胞凋亡指数较对照组明显降低. (P<0.01, Tab 3).标本连续切片后，HE染色,典型的凋亡细胞呈现细胞体积变小，细胞表面扭曲不平，可见出泡现象，细胞核固缩，染色体边集呈现新月体. 表 3 肾上腺与脑垂体TUNEL染色细胞凋亡指数
, 百拇医药
Tab 3 Apoptosis index with TUNEL dye in adrenal and pituitary glands
(
±s) GroupAdrenal
Pituitary
Exp.
23.40±4.28b
17.64±2.10b
Contr.
32.22±4.84
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22.36±2.19
bP<0.01.
3 讨论
体内自由基含量随年龄增长而积累，体内清除自由基的各种酶类的防御功能也随年龄增长而衰减，导致碱基缺失，氢键破坏，蛋白质交联，多肽链断裂，发生脂质过氧化反应，生成丙二醛，加快细胞中DNA、蛋白质、脂膜等损伤，促进细胞凋亡发生，大量组织细胞凋亡的结果使机体老化[7,8]，引发某些退行性疾病[9]. 衰老的实质就是细胞凋亡[10]. 因而自由基、细胞凋亡与衰老具有十分密切的联系.
实验结果表明，连续用药24 d起，SOD活性水平开始升高，32 d后MDA开始下降，用药40和48 d时，这种趋势更加显著，明显提高了血中SOD活性水平，降低了MDA含量，提高了自由基清除能力，降低了脂质过氧化物反应，阻滞了生物分子间的交联反应，老年色素及脂褐素生成减少，用药90 d后，与对照组比较，大鼠肾上腺、脑垂体组织的细胞凋亡指数明显降低，阻遏了蛋白质的溶解、变性，保证了细胞膜结构和功能的完整. 延缓了细胞凋亡的发生. 可以认为金匮肾气丸主要是提高SOD活力，清除自由基，抑制细胞凋亡而起到补肾抗衰老的作用. 国内外许多学者在补肾抗衰老研究中取得举世嘱目的成就. 沈自尹等[11，12]选用补肾中药对雄性动物及临床证效进行观察，他们证实了补肾药物对雄性动物抗衰老作用. 从另一侧面，我们选用雌性老年前期大鼠观察金匮肾气丸抗衰老作用.
, 百拇医药
致 谢 王伯云、晏培松教授、王多宁主管技师对本实验给予了悉心指导.
作者简介:王新玲(1962-)，女(汉族),山东省荣城县人. 主治医师，1997级基金班学员(导师李月彩). Tel.(029)3375243
参考文献:
[1] Wang E, Lee MJ, Pandey S et al. Control of fibroblast senescence and activiation of programmed cell death[J]. J Cell Biochem, 1994;54:432-439.
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, 百拇医药
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[10] 惠宏襄，赵小宁，金 明et al. 自由基与细胞凋亡[J]. 生物化学与生物物理进展，1996；23(1)：12-15.
[11] 沈自尹. 延缓衰老的研究思路[J]. 中医杂志，1991；32(1)：42.
[12] 沈自尹. 中医肾的古今论[J]. 中国中西医结合杂志，1997；38(1)：49.
收稿日期:1999-12-15; 修回日期:2000-02-17, http://www.100md.com