抗rhIL-2单克隆抗体高效亲和色谱填料的制备及其应用
作者：郭立安 董建中
单位：郭立安(第四军医大学基础部中心实验室， 陕西 西安 710033)；董建中(河南师范大学,河南 新乡 453002)
关键词：液相色谱；亲和色谱；蛋白质；白细胞介素-2；纯化
第四军医大学学报001008 摘 要：目的 制备抗基因重组人IL-2(rhIL-2)mAb的高效亲和色谱填料并用于rhIL-2的纯化. 方法 以硅胶为基质，使用γ- 缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷对其表面进行化学改性，然后在1,1-碳化二咪唑的作用下，与抗rhIL-2的mAb进行偶联，制备高效亲和色谱填料. 结果 使用该填料对大肠杆菌表达的rhIL-2进行了纯化，纯化后的IL-2经CTLL细胞活性测定和SDS-PAGE的纯度测定，确定其活性回收率为92%，比活为2.0×109 IU.g-1 蛋白质，纯度为95%. 结论 以硅胶为基质制备的抗rhIL-2的mAb高效亲和色谱填料纯化rhIL-2是一个好的方法.
, 百拇医药
中图号：Q511 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1195-02
Preparation of HPAC and purification of rhIL-2
GUO Li-An
(Central Laboratory, Faculty of Preclinical Medicine,Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
DONG Jian-Zhong
(Henan Normal University, Xinxiang 453002)
, 百拇医药
Abstract: AIM To prepare a high-performance liquid affinity chromatographic parking(HPAC) and to purify the recombinant human interlukin 2(rhIL-2). METHODS The preparation HPAC parking was carried out using γ- glycidoxypropyltrimethoxysilaneas reactant to cover the surface of silica gel. The rhIL-2 monoclonal antibody (mAb) was immobilized on diol-silica activated with 1,1'- carbodiimidazole to form HPAC parking. RESULTS The coupling yield of mAb was 85%. rhIL-2 expressed in E.coli was purified by HPAC. The purity of purified rhIL-2 was 95% by SDS-PAGE with Coomassie Blue. The activity recovery and specific activity were 92% and 2.0×109 IU*g-1 respectively. CONCLUSION Purification of rhIL-2 by HPAC is simpler and faster than other chromatographies.
, 百拇医药
Keywords：liquid chromatography；affinity chromatography；protein； interlukin-2；purification
0 引言
高效亲和液相色谱(HPAC)是将经典亲和色谱的高特异性同高效液相色谱的快速、高效相结合产生的一种蛋白质的分离技术. 它使经典亲和色谱原来需要几个小时才能完成的纯化工作缩短为十几分钟或更短，而且纯化倍数高，分离效果好. 因此，HPAC在近年基因重组蛋白质的纯化方面得到了广泛的应用[1]. 人白细胞介素-2(hIL-2)是人体内具有重要生物学功能的细胞因子，它能促进人体T细胞的生长和分化，诱导LAK细胞及TIL细胞的生长. 目前，hIL-2已用基因工程的方法成功地进行了表达[2],但在下游的纯化方法方面仍有许多问题需要进行研究. 我们以硅胶为基质制备了抗rhIL-2 单克隆抗体(mAb)的高效亲和色谱,并用它纯化了大肠杆菌(E.coli) 表达的rhIL-2, 获得了满意的实验结果.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 美国Backman公司的HPLC系统，包括2台114型高压泵，165型紫外可见检测器；日本Chemico公司124型高压匀浆装填机；上海雷磁仪器厂pHs-25型酸度计；日本Shimdzu公司CS-9000型薄层扫描仪；LKB公司2117型电泳仪. 色谱柱，I.D 4.6 mm×100 mm. 硅胶(10 μm,500 A，北京化学试剂研究所)，γ-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(辽宁盖县化工厂)，抗rhIL-2的mAb 和E.coli表达的rhIL-2的包涵体(本校免疫教研室惠赠)，牛血清白蛋白(BSA，上海生化试剂厂)，1,1-碳化二咪唑(1,1'-carbodiimidazole, CDI， Sigma公司)，rhIL-2纯品(上海医药工业研究院惠赠)，其他化学试剂均为分析纯试剂，由北京化学试剂厂生产.
1.2 方法 硅胶先用0.1 mol*L-1的HCl酸化处理，酸化处理过的硅胶进行真空高温干燥，在氩气保护下与1000 g*L-1的γ-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液反应16 h，110℃常压回流，得环氧基硅烷. 环氧基硅烷在10 mmol*L-1的盐酸溶液中90℃回流2 h，制得含双醇基的硅胶. 双醇基的硅胶在二氧六环溶液中与CDI作用，洗涤干燥后再在磷酸盐缓冲溶液中与抗rhIL-2的mAb偶联[3]. 采用元素分析法测定双醇基硅胶的C和H的含量. 合成好的填料在200 kgf*cm-2压力下，以磷酸盐缓冲溶液为装柱液，高压匀浆装入柱中. 采用CTLL细胞短期培养3H-TdR掺入法测定rhIL-2活性. 蛋白质的含量采用Lowry法，BSA为标准蛋白.
, 百拇医药
1.2.1 rhIL-2的纯化方法 rhIL-2的包涵体, 使用8 mol*L-1的盐酸胍溶解，经Sephacryl-S-200凝胶分离(分离条件为：流动相2 mol*L-1的盐酸胍，柱子2.6 cm×100 cm，流速1 mL*min-1,检测波长280 nm, Fig 1A). 收集对应的活性峰，用亲和色谱的平衡液1∶30倍稀释，使rhIL-2复性，之后再行HPAC分离(Fig 1B, HPAC的色谱条件为平衡液10 mmol*L-1 Tris- HCl, 洗脱液为3 mol*L-1 KSCN). 收集活性峰，对Tris-HCl进行充分的透析，鉴定蛋白质的含量、纯度和生物学活性.
1.2.2 纯度测定 SDS-PAGE对经HPAC纯化后的产品进行纯度测定，考马斯亮蓝染色，使用薄层扫描仪进行斑点扫描测定纯度(Fig 2).
图 1 含rhIL-2 包涵体的凝胶色谱图(A)和rhIL-2 的高效亲和色谱图(B)
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Fig 1 Size exclusion chromatography(A) and HPAC of rhIL-2 of inclusion body containing rhIL-2(B)
图 2 rhIL-2的SDS-PAGE图
Fig 2 SDS-PAGE of rhIL-2
1:crude sample; 2:Mr markers;3:hIL-2 purified by HPAC
2 结果
2.1 HPAC填料的制备 合成的填料经过元素分析仪进行分析测定[结果C (3.16 mmol*g-1硅胶), H (6.79 mmol*g-1 硅胶)，C/H比值为1/2.15 与理论值1/2.16接近]，其C/H的理论值和实验值接近，同时对合成的三批样品进行测试(结果略)，C和H元素含量以及C/H值结果相近，说明合成的方法具有较好的重现性. 用CDI偶联mAb后测定了偶联率,偶联率为85%，达到20 mg*g-1硅胶(2 g*L-1 硅胶)，柱子容量rhIL-2为0.5 g*L-1 硅胶. 柱子重复使用100次后，柱效、rhIL-2的活性回收率和负载量无明显变化.
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2.2 rhIL-2 纯化路线 rhIL-2的包涵体经8 mol*L-1盐酸胍溶解后，上凝胶色谱进行分离，从Fig 2可以看出，rhIL-2得到了初步的分离. 之后收集活性峰，大量稀释复性后进行HPAC分离. 将HPAC分离的rhIL-2进行SDS-PAGE纯度鉴定，得到了单一的一条谱带，经薄层扫描其纯度大于95%，蛋白质比活为2.0×109 IU*g-1. 在HPAC之前，先用凝胶色谱进行分离的目的是为了除去大量的杂蛋白，避免rhIL-2在复性时由于杂蛋白的存在而导致大量沉淀的产生和活性回收率不高的缺点[4].
3 讨论
普通的硅胶表面对蛋白质有非特异性的吸附作用，必须对其表面进行改性才能用于蛋白质的分离. γ-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷是对硅胶表面进行改性最为常用的试剂，用它对硅胶表面进行改性后，硅胶表面的非特异性吸附被大大降低，并生成环氧基团，酸化处理后可得到二元醇，二元醇可以与不同的基团连接，制成离子交换、疏水作用以及各种亲和色谱的填料. 故我们选择了γ-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷作为连接抗rhIL-2 mAb的改性试剂.
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使用上海医药工业研究院惠赠的rhIL-2纯品在合成的HPAC柱上测定的活性回收接近100%，使用rhIL-2包涵体溶解液测定的活性回收率为92%. 说明HPAC是一个好的纯化rhIL-2的方法，它比经典的亲和色谱方法更加快捷，活性回收率更高[5]. 文中的rhIL-2纯化工艺是一个可行的纯化方法.
基金项目：陕西省自然科学基金资助项目(99H09)；高等学校骨干教师资助计划项目
作者简介：郭立安(1962-), 男(汉族), 河南省温县人. 微生物药学博士, 副教授. Tel.(029)3374573 Email.lianguo@fmmu.edu.cn
参考文献:
[1] 郭立安. 高效液相色谱法纯化蛋白质理论与技术[M]. 西安：陕西科学技术出版社，1993：261-301.
, http://www.100md.com
[2] Kato K, Yamada T, Kawahara K et al. Purification and characterization of recombinant human interlukin-2 produced in Escherichia coli[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1985； 130 (2):692-699.
[3] Nilsson K, Larsson PO. High-performance liquid affinity chromatography on silica-bound alcohol dehydrogenase[J]. Anal Biochem,1983; 134 (1):60-65.
[4] 郭立安，朱宝泉，陈代杰. 使用三态模型指导基因重组蛋白质复性条件的选择[J]. 中国医药工业杂志，1999;30(3):141-144.
[5] 王笑利，郑 岚，谢映华et al. 单克隆抗体亲和层析提纯人重组IL-2[J]. 中国免疫学杂志，1993;9(1)：62-66.
收稿日期:1999-12-05; 修回日期:2000-03-14, http://www.100md.com
单位：郭立安(第四军医大学基础部中心实验室， 陕西 西安 710033)；董建中(河南师范大学,河南 新乡 453002)
关键词：液相色谱；亲和色谱；蛋白质；白细胞介素-2；纯化
第四军医大学学报001008 摘 要：目的 制备抗基因重组人IL-2(rhIL-2)mAb的高效亲和色谱填料并用于rhIL-2的纯化. 方法 以硅胶为基质，使用γ- 缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷对其表面进行化学改性，然后在1,1-碳化二咪唑的作用下，与抗rhIL-2的mAb进行偶联，制备高效亲和色谱填料. 结果 使用该填料对大肠杆菌表达的rhIL-2进行了纯化，纯化后的IL-2经CTLL细胞活性测定和SDS-PAGE的纯度测定，确定其活性回收率为92%，比活为2.0×109 IU.g-1 蛋白质，纯度为95%. 结论 以硅胶为基质制备的抗rhIL-2的mAb高效亲和色谱填料纯化rhIL-2是一个好的方法.
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中图号：Q511 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1195-02
Preparation of HPAC and purification of rhIL-2
GUO Li-An
(Central Laboratory, Faculty of Preclinical Medicine,Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
DONG Jian-Zhong
(Henan Normal University, Xinxiang 453002)
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Abstract: AIM To prepare a high-performance liquid affinity chromatographic parking(HPAC) and to purify the recombinant human interlukin 2(rhIL-2). METHODS The preparation HPAC parking was carried out using γ- glycidoxypropyltrimethoxysilaneas reactant to cover the surface of silica gel. The rhIL-2 monoclonal antibody (mAb) was immobilized on diol-silica activated with 1,1'- carbodiimidazole to form HPAC parking. RESULTS The coupling yield of mAb was 85%. rhIL-2 expressed in E.coli was purified by HPAC. The purity of purified rhIL-2 was 95% by SDS-PAGE with Coomassie Blue. The activity recovery and specific activity were 92% and 2.0×109 IU*g-1 respectively. CONCLUSION Purification of rhIL-2 by HPAC is simpler and faster than other chromatographies.
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Keywords：liquid chromatography；affinity chromatography；protein； interlukin-2；purification
0 引言
高效亲和液相色谱(HPAC)是将经典亲和色谱的高特异性同高效液相色谱的快速、高效相结合产生的一种蛋白质的分离技术. 它使经典亲和色谱原来需要几个小时才能完成的纯化工作缩短为十几分钟或更短，而且纯化倍数高，分离效果好. 因此，HPAC在近年基因重组蛋白质的纯化方面得到了广泛的应用[1]. 人白细胞介素-2(hIL-2)是人体内具有重要生物学功能的细胞因子，它能促进人体T细胞的生长和分化，诱导LAK细胞及TIL细胞的生长. 目前，hIL-2已用基因工程的方法成功地进行了表达[2],但在下游的纯化方法方面仍有许多问题需要进行研究. 我们以硅胶为基质制备了抗rhIL-2 单克隆抗体(mAb)的高效亲和色谱,并用它纯化了大肠杆菌(E.coli) 表达的rhIL-2, 获得了满意的实验结果.
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1 材料和方法
1.1 材料 美国Backman公司的HPLC系统，包括2台114型高压泵，165型紫外可见检测器；日本Chemico公司124型高压匀浆装填机；上海雷磁仪器厂pHs-25型酸度计；日本Shimdzu公司CS-9000型薄层扫描仪；LKB公司2117型电泳仪. 色谱柱，I.D 4.6 mm×100 mm. 硅胶(10 μm,500 A，北京化学试剂研究所)，γ-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(辽宁盖县化工厂)，抗rhIL-2的mAb 和E.coli表达的rhIL-2的包涵体(本校免疫教研室惠赠)，牛血清白蛋白(BSA，上海生化试剂厂)，1,1-碳化二咪唑(1,1'-carbodiimidazole, CDI， Sigma公司)，rhIL-2纯品(上海医药工业研究院惠赠)，其他化学试剂均为分析纯试剂，由北京化学试剂厂生产.
1.2 方法 硅胶先用0.1 mol*L-1的HCl酸化处理，酸化处理过的硅胶进行真空高温干燥，在氩气保护下与1000 g*L-1的γ-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液反应16 h，110℃常压回流，得环氧基硅烷. 环氧基硅烷在10 mmol*L-1的盐酸溶液中90℃回流2 h，制得含双醇基的硅胶. 双醇基的硅胶在二氧六环溶液中与CDI作用，洗涤干燥后再在磷酸盐缓冲溶液中与抗rhIL-2的mAb偶联[3]. 采用元素分析法测定双醇基硅胶的C和H的含量. 合成好的填料在200 kgf*cm-2压力下，以磷酸盐缓冲溶液为装柱液，高压匀浆装入柱中. 采用CTLL细胞短期培养3H-TdR掺入法测定rhIL-2活性. 蛋白质的含量采用Lowry法，BSA为标准蛋白.
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1.2.1 rhIL-2的纯化方法 rhIL-2的包涵体, 使用8 mol*L-1的盐酸胍溶解，经Sephacryl-S-200凝胶分离(分离条件为：流动相2 mol*L-1的盐酸胍，柱子2.6 cm×100 cm，流速1 mL*min-1,检测波长280 nm, Fig 1A). 收集对应的活性峰，用亲和色谱的平衡液1∶30倍稀释，使rhIL-2复性，之后再行HPAC分离(Fig 1B, HPAC的色谱条件为平衡液10 mmol*L-1 Tris- HCl, 洗脱液为3 mol*L-1 KSCN). 收集活性峰，对Tris-HCl进行充分的透析，鉴定蛋白质的含量、纯度和生物学活性.
1.2.2 纯度测定 SDS-PAGE对经HPAC纯化后的产品进行纯度测定，考马斯亮蓝染色，使用薄层扫描仪进行斑点扫描测定纯度(Fig 2).
图 1 含rhIL-2 包涵体的凝胶色谱图(A)和rhIL-2 的高效亲和色谱图(B)
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Fig 1 Size exclusion chromatography(A) and HPAC of rhIL-2 of inclusion body containing rhIL-2(B)
图 2 rhIL-2的SDS-PAGE图
Fig 2 SDS-PAGE of rhIL-2
1:crude sample; 2:Mr markers;3:hIL-2 purified by HPAC
2 结果
2.1 HPAC填料的制备 合成的填料经过元素分析仪进行分析测定[结果C (3.16 mmol*g-1硅胶), H (6.79 mmol*g-1 硅胶)，C/H比值为1/2.15 与理论值1/2.16接近]，其C/H的理论值和实验值接近，同时对合成的三批样品进行测试(结果略)，C和H元素含量以及C/H值结果相近，说明合成的方法具有较好的重现性. 用CDI偶联mAb后测定了偶联率,偶联率为85%，达到20 mg*g-1硅胶(2 g*L-1 硅胶)，柱子容量rhIL-2为0.5 g*L-1 硅胶. 柱子重复使用100次后，柱效、rhIL-2的活性回收率和负载量无明显变化.
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2.2 rhIL-2 纯化路线 rhIL-2的包涵体经8 mol*L-1盐酸胍溶解后，上凝胶色谱进行分离，从Fig 2可以看出，rhIL-2得到了初步的分离. 之后收集活性峰，大量稀释复性后进行HPAC分离. 将HPAC分离的rhIL-2进行SDS-PAGE纯度鉴定，得到了单一的一条谱带，经薄层扫描其纯度大于95%，蛋白质比活为2.0×109 IU*g-1. 在HPAC之前，先用凝胶色谱进行分离的目的是为了除去大量的杂蛋白，避免rhIL-2在复性时由于杂蛋白的存在而导致大量沉淀的产生和活性回收率不高的缺点[4].
3 讨论
普通的硅胶表面对蛋白质有非特异性的吸附作用，必须对其表面进行改性才能用于蛋白质的分离. γ-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷是对硅胶表面进行改性最为常用的试剂，用它对硅胶表面进行改性后，硅胶表面的非特异性吸附被大大降低，并生成环氧基团，酸化处理后可得到二元醇，二元醇可以与不同的基团连接，制成离子交换、疏水作用以及各种亲和色谱的填料. 故我们选择了γ-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷作为连接抗rhIL-2 mAb的改性试剂.
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使用上海医药工业研究院惠赠的rhIL-2纯品在合成的HPAC柱上测定的活性回收接近100%，使用rhIL-2包涵体溶解液测定的活性回收率为92%. 说明HPAC是一个好的纯化rhIL-2的方法，它比经典的亲和色谱方法更加快捷，活性回收率更高[5]. 文中的rhIL-2纯化工艺是一个可行的纯化方法.
基金项目：陕西省自然科学基金资助项目(99H09)；高等学校骨干教师资助计划项目
作者简介：郭立安(1962-), 男(汉族), 河南省温县人. 微生物药学博士, 副教授. Tel.(029)3374573 Email.lianguo@fmmu.edu.cn
参考文献:
[1] 郭立安. 高效液相色谱法纯化蛋白质理论与技术[M]. 西安：陕西科学技术出版社，1993：261-301.
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[2] Kato K, Yamada T, Kawahara K et al. Purification and characterization of recombinant human interlukin-2 produced in Escherichia coli[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1985； 130 (2):692-699.
[3] Nilsson K, Larsson PO. High-performance liquid affinity chromatography on silica-bound alcohol dehydrogenase[J]. Anal Biochem,1983; 134 (1):60-65.
[4] 郭立安，朱宝泉，陈代杰. 使用三态模型指导基因重组蛋白质复性条件的选择[J]. 中国医药工业杂志，1999;30(3):141-144.
[5] 王笑利，郑 岚，谢映华et al. 单克隆抗体亲和层析提纯人重组IL-2[J]. 中国免疫学杂志，1993;9(1)：62-66.
收稿日期:1999-12-05; 修回日期:2000-03-14, http://www.100md.com