猪血小板衍化生长因子的提取和纯化
作者：张永和 任雨笙 张英起 章翔
单位：张永和 易声禹 章翔 (第四军医大学西京医院全军神经外科研究所，陕西 西安 710033)；任雨笙(第二军医大学长征医院心血管内科)；张英起(第四军医大学生物技术中心)
关键词：血小板衍化生长因子；纯化；离子交换层析
第四军医大学学报001007
摘 要: 目的 建立一种简单、经济的血小板衍化生长因子(PDGF)的纯化方法. 方法 血小板衍化生长因子(PDGF)具有耐酸性(pH 2.5),耐热(100℃)以及耐受2% SDS的特性. 采用酸醇提取、热处理、离子交换层析、分子筛等蛋白分离和纯化技术从猪血小板中提取和纯化PDGF. 结果 猪血小板衍化生长因子(pPDGF)纯化倍数达7582倍, 活性回收率为3%. 结论 本方法简单、经济，纯化的猪血小板衍化生长因子(pPDGF)具有明显的生物学活性.
, 百拇医药
中图号:R331 文献标识码:A
文章编号：1000-2790(2000)10-1192-03
Extraction and purification of porcine platelet-derived growth factor
ZHANG Yong-He,
, ZHANG Xiang
(Neurosurgery Institute of Chinese PLA,Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
REN Yu-Sheng
, 百拇医药
(Department of Cardiovasology,Changzheng Hospital,Second Military Medical University)
ZHANG Ying-Qi
(Center of Biologic Technology,Fourth Military Medical University)
Abstract: AIM To establish a simple and economical method for purification of platelet-derived growth factor. METHODS pPDGF is remarkably stable protein which retains biological activity even after harsh treatments shcu as exposure to acid (pH 2.5), SDS (2%) or heating to 100℃. purification of pPDGF by using serial methods of acid-ethanal extraction,ion-exchange chromatography,heat treatment and gel chromatography. RESULTS The 7582 hold purified pPDGF from porcine platelets registered a rate of recovery of 3%. CONCLUSION This method is simple, economical and the purified pPDGF has potent biological activity.
, http://www.100md.com
Keywords: platelet-derived growth factor(PDGF); purification; ion-exchange chromatography
0 引言
血小板衍化生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)为贮存于血小板α颗粒的一种碱性蛋白, 是一种很强的致丝裂因子[1]. PDGF在创伤修复、动脉粥样硬化、胚胎发生和发育以及肿瘤形成的细胞增殖和细胞定向运动中起着重要的作用. 国外已成功地从人血小板中分离出高纯度的PDGF[2], 但方法复杂, 费用较高. 我们采用较为简单的方法从猪血小板中提取和纯化较高纯度的PDGF, 为研究猪血小板衍化生长因子( porcine PDGF, pPDGF)的理化和生物学特性及其应用打下基础.
1 材料和方法
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1.1 材料 新鲜猪血购自西安市肉联厂，PMSF aprotinin 购自Sigma公司，DMEM细胞培养液购自Gibco公司，牛血清白蛋白购自西安华美生物工程公司，胎牛血清购自杭州四季青生物制品工程公司，3H-TdR购自中科院上海原子能研究所. 自制ACD液(枸橼酸三钠2.20 g, 枸橼酸0.89 g, 葡萄糖2.45 g, 加蒸馏水至100 mL)
1.2 方法 新鲜猪血40 L, 加6 L ACD液抗凝, 800 r*min-1离心10 min, 除去血细胞. 将上清用1500 g离心30 min以沉降血小板, 弃上清, 10 mmol*L-1 PBS洗涤血小板3次, 称湿重. 加入100 mL含蛋白酶抑制剂的PBS， 超声细胞粉碎仪(Sonic Materials,Inc.)破碎血小板. 按每10 g血小板裂解液加入40 mL酸醇液, 用双蒸水将终体积调至60 mL 4℃搅拌过夜. 600 r*min-1离心10 min, 取上清,将沉淀物再用40 mL酸醇液抽提2 h, 离心后取上清[3]. 合并两次上清液, 用氢氧化铵将pH调为5.3后-20℃静置48 h, 离心后取沉淀, 溶于1 mol*L-1 乙酸, 冻干备用.
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1.2.1 离子交换层析 阴离子交换基质DEAE-Sepharose FF (Pharmacia CO.)装柱2.6 cm×9.0 cm, 用磷酸缓冲液(pH 7.2)平衡层析, 将酸醇提取物用0.1 mol*L-1乙酸溶解, 对PB透析, 离心后上样，平衡液洗出穿过峰, 用0.25 mol*L-1和0.50 mol*L-1NaCl洗脱, 分别收集穿过峰和洗脱峰, 测活性及蛋白含量. 将上一步骤收集的活性物质100℃水浴10 min, 1500 r*min-1离心，4℃，1 h除去变性蛋白. 上清用分子质量截留值为10 000的超滤膜浓缩, 测活性及蛋白含量. 阳离子交换基质CM-Sepharose FF(Pharmacia CO.)装柱2.6 cm×11.0 cm, 用磷酸缓冲液pH 7.2平衡层析柱, 将超滤浓缩液上样, 用PB液洗出不结合蛋白, 以0.5 mol*L-1和1.0 mol*L-1 NaCl阶梯洗脱, 收集活性部分, 测活性及蛋白含量. Sepharcyl S-100HR(Pharmacia CO.) 装柱1 cm×72 cm,预先用1 mol*L-1乙酸(pH 3.5)平衡. 将上一步骤的活性物质对1 mol*L-1乙酸透析, 离心取上清, 上样后用平衡液进行洗脱, 收集活性部分, 测活性及蛋白含量.
, 百拇医药
1.2.2 活性检测 NIH 3T3细胞用含100 mL*L-1NBS的DMEM调至1×108*L-1, 接种于96孔板,每孔接种200 μL细胞悬液. CO2孵箱中培养24 h, 换用无血清培养液继续培养24 h, 待测样品用含10 g*L-1小牛白蛋白的10 mmol*L-1乙酸稀释后加入，每孔10 μL，再培养16 h,在培养结束前8 h换入含3H-TdR的培养液, 使每孔终浓度为3.7×104Bq. 培养结束后用多头细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维纸上, 三氯醋酸、无水乙醇、乙醚洗涤, 干燥后置于液闪瓶中, 每瓶加入5 mL闪烁液(PPO 4.0 g, PPOP 0.4 g, 二甲苯1 L). 在LS6500型闪烁计数仪(Beckman)上进行计数,结果用cpm表示, 以引起半最大刺激量3H-TdR掺入值所需的样品含量为一个pPDGF活性单位.
, 百拇医药
1.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 按Leammli法[4]将最终分离出的样品进行150 g*L-1 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 其中部分样品用2-巯基乙醇还原后再进行150 g*L-1 SDS-PAGE, 考马斯亮蓝R250染色. 蛋白质含量测定采用Lowrys'法[5], 以牛血清白蛋白为标准品.
2 结果
2.1 pPDGF的提取和纯化 血小板裂解液经酸醇抽提比活提高了86倍, 活性回收率为51%, 经阴离子交换层析、热处理及超滤浓缩，阳离子交换层析其纯化倍数分别提高了296,299,352倍, 活性回收率分别为34%,5%和4%; 经S-100HR凝胶层析纯化倍数进一步提高为7582倍, 活性回收率为3%(Tab 1, Fig 1～3). 样品经100℃水浴10 min, 仍保持其生物学活性, 表明其热稳定性良好.
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表 1 猪血小板衍化生长因子纯化步骤
Tab 1 Porcine platelet-derived growth factor purification protocol
Step
Total protein/mg
Total activity/IU
Specific activity/(IU*mg-1)
Fold of purification
Recovery/%
Platlet lysate
, 百拇医药
39 800
1.8×106
45
1
100
Acid-ethanol extraction
237.32
9.2×105
3876
86
51
DEAE-Sepharose FF
, 百拇医药
45.83
6.1×105
13 310
296
34
Heat treatment
6.25
8.4×104
13 440
299
5
CM- Sepharose FF
, 百拇医药
4.35
6.9×104
15 862
352
4
Sepharcyl-100HR
0.17
5.8×104
341 176
7582
3
图 1 DEAE-Sepharose FF离子交换层析
, http://www.100md.com
Fig 1 Chromatography of purified pPDGF through DEAE-Sepharose FF
Chromatographic condition: DEAE-Sepharose FF 2.6 cm×9 cm, flow rate 3 mL*min-1, 5 mL*tub-1.
图 2 CM-Sepharose FF离子交换层析
Fig 2 Chromatography of purified pPDGF through CM-Sepharose FF
Chromatographic condition: DEAE-Sepharose FF 2.6 cm×9 cm, flow rate 3 mL*min-1, 5 mL*tub-1.
, 百拇医药
2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE结果显示, 从S-100HR分离的活性物质Mr3×105处出现一条明显的蛋白质染色带, 比活性达341 176 IU*mg-1蛋白. 经2-巯基乙醇还原后，SDS-PAGE显示Mr1.5×105处出现一条蛋白质染色带, 且其生物学活性基本消失(Fig 4).
图 3 Sepharcyl S-100 HR凝胶层析
Fig 3 Chromatography of purified pPDGF through the Sepharcyl S-100 HR
Chromatographic condition: CM-Sepharose FF 1 cm×72 cm, flow rate 0.5 mL*min-1, 5 mL*tub-1.
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图 4 pPDGF的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
Fig 4 SDS-PAGE of pPDGF
A：Sample of purified pPDGF; B：Proteins of standard molecular weights; C：Sample of purified pPDGF treatment with 100 mL*L-1 2-mercaptoethanol.
3 讨论
PDGF是一种耐酸、热稳定的阳离子糖蛋白, 针对其特殊的理化性质, 我们采用酸醇抽提法从猪血小板裂解液中提取粗制pPDGF, 虽然得率不高, 但除去了绝大部分的杂蛋白, 且纯化倍数为86倍, 说明酸醇抽提法是一种有效的提取pPDGF粗制品的方法. 由于PDGF具有热稳定性，经100℃水浴后，基本除去了样品中对热不稳定的蛋白和其他杂蛋白, 再经具有分子筛效应的Sepharryl S-100HR凝胶层析纯化可获得较高纯度的pPDGF. 150 g*L-1 SDS-PAGE分析， pPDGF的Mr 30 000. 经生物学活性检测，pPDGF可明显促进NIH 3T3细胞的DNA合成. 经100 mL*L-1 2-巯基乙醇还原后, pPDGF分解为Mr 15 000的蛋白，它可能是pPDGF 二硫键断裂后分解为两条相同分子量的肽链，经还原后的pPDGF生物学活性基本消失. 说明pPDGF中的二硫键的二聚体结构对保持其生物学活性起着十分重要的作用. 不论是同质或者异质二聚体都具有促进成纤维细胞、平滑肌细胞、胶质细胞等其他细胞的增殖和分化作用[6,7]. PDGF对中性粒细胞、单核细胞、成纤维细胞和胶质细胞有趋化作用.
, 百拇医药
与以往从血小板中提取、纯化PDGF的方法[2,7]相比, 本实验方法简便,只需两步层析过程，使用仪器设备简单，提取纯化的周期较短, 同样得到纯度较高的PDGF. 我们实验采用猪血小板提取纯化PDGF, 猪血来源广泛所需费用较少. 建立一条适合于国内条件的相对简单、高效的纯化途径, 并达到较好的结果, 有利于推动我们对PDGF的生物学研究, 为进一步探索PDGF在生长、发育及相关疾病的发生、发展机制中所起的作用打下良好的基础.
作者简介：张永和(1961-)，男(汉族)，吉林省四平人. 博士，讲师，主治医师. Tel.(029)3375540 Email.zhang-y-h@chinaten.com
参考文献：
[1] Huang JS, Huang SS, Kenedy BB et al. Platelet-derived growth factor: Specific binding to target cell[J]. J Biol Chem, 1982;257:8130-8136.
, http://www.100md.com
[2] Antoniades HN, Scher CD, Stiles CD et al. Purification of human platelet-derived growth factor[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1979;76(4):1809-1813.
[3] Davoren PR. The isolation of insulin from a cat pancreas[J]. Biochem Biophys Acta, 1962;63:150-153.
[4] Leammli UK.Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970;227(5259):680-683.
[5] Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL et al. Protein measurement with folin phenol reagent[J]. J Biol Chem, 1951;193(1):265-275.
, http://www.100md.com
[6] Ross R, Rains EW, Bower-Pope D. The biology of platelet-derived growth factor[J]. Cell, 1986;46(7):155-169.
[7] Poggi A, Rucinski B, James P et al. Partial purification and characterization of porcine platelet-derived growth factor[J]. Exp Cell Res,1984;150(2):436-441.
收稿日期:1999-12-12; 修回日期:2000-07-02, 百拇医药
单位：张永和 易声禹 章翔 (第四军医大学西京医院全军神经外科研究所，陕西 西安 710033)；任雨笙(第二军医大学长征医院心血管内科)；张英起(第四军医大学生物技术中心)
关键词：血小板衍化生长因子；纯化；离子交换层析
第四军医大学学报001007
摘 要: 目的 建立一种简单、经济的血小板衍化生长因子(PDGF)的纯化方法. 方法 血小板衍化生长因子(PDGF)具有耐酸性(pH 2.5),耐热(100℃)以及耐受2% SDS的特性. 采用酸醇提取、热处理、离子交换层析、分子筛等蛋白分离和纯化技术从猪血小板中提取和纯化PDGF. 结果 猪血小板衍化生长因子(pPDGF)纯化倍数达7582倍, 活性回收率为3%. 结论 本方法简单、经济，纯化的猪血小板衍化生长因子(pPDGF)具有明显的生物学活性.
, 百拇医药
中图号:R331 文献标识码:A
文章编号：1000-2790(2000)10-1192-03
Extraction and purification of porcine platelet-derived growth factor
ZHANG Yong-He,
, ZHANG Xiang(Neurosurgery Institute of Chinese PLA,Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
REN Yu-Sheng
, 百拇医药
(Department of Cardiovasology,Changzheng Hospital,Second Military Medical University)
ZHANG Ying-Qi
(Center of Biologic Technology,Fourth Military Medical University)
Abstract: AIM To establish a simple and economical method for purification of platelet-derived growth factor. METHODS pPDGF is remarkably stable protein which retains biological activity even after harsh treatments shcu as exposure to acid (pH 2.5), SDS (2%) or heating to 100℃. purification of pPDGF by using serial methods of acid-ethanal extraction,ion-exchange chromatography,heat treatment and gel chromatography. RESULTS The 7582 hold purified pPDGF from porcine platelets registered a rate of recovery of 3%. CONCLUSION This method is simple, economical and the purified pPDGF has potent biological activity.
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Keywords: platelet-derived growth factor(PDGF); purification; ion-exchange chromatography
0 引言
血小板衍化生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)为贮存于血小板α颗粒的一种碱性蛋白, 是一种很强的致丝裂因子[1]. PDGF在创伤修复、动脉粥样硬化、胚胎发生和发育以及肿瘤形成的细胞增殖和细胞定向运动中起着重要的作用. 国外已成功地从人血小板中分离出高纯度的PDGF[2], 但方法复杂, 费用较高. 我们采用较为简单的方法从猪血小板中提取和纯化较高纯度的PDGF, 为研究猪血小板衍化生长因子( porcine PDGF, pPDGF)的理化和生物学特性及其应用打下基础.
1 材料和方法
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1.1 材料 新鲜猪血购自西安市肉联厂，PMSF aprotinin 购自Sigma公司，DMEM细胞培养液购自Gibco公司，牛血清白蛋白购自西安华美生物工程公司，胎牛血清购自杭州四季青生物制品工程公司，3H-TdR购自中科院上海原子能研究所. 自制ACD液(枸橼酸三钠2.20 g, 枸橼酸0.89 g, 葡萄糖2.45 g, 加蒸馏水至100 mL)
1.2 方法 新鲜猪血40 L, 加6 L ACD液抗凝, 800 r*min-1离心10 min, 除去血细胞. 将上清用1500 g离心30 min以沉降血小板, 弃上清, 10 mmol*L-1 PBS洗涤血小板3次, 称湿重. 加入100 mL含蛋白酶抑制剂的PBS， 超声细胞粉碎仪(Sonic Materials,Inc.)破碎血小板. 按每10 g血小板裂解液加入40 mL酸醇液, 用双蒸水将终体积调至60 mL 4℃搅拌过夜. 600 r*min-1离心10 min, 取上清,将沉淀物再用40 mL酸醇液抽提2 h, 离心后取上清[3]. 合并两次上清液, 用氢氧化铵将pH调为5.3后-20℃静置48 h, 离心后取沉淀, 溶于1 mol*L-1 乙酸, 冻干备用.
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1.2.1 离子交换层析 阴离子交换基质DEAE-Sepharose FF (Pharmacia CO.)装柱2.6 cm×9.0 cm, 用磷酸缓冲液(pH 7.2)平衡层析, 将酸醇提取物用0.1 mol*L-1乙酸溶解, 对PB透析, 离心后上样，平衡液洗出穿过峰, 用0.25 mol*L-1和0.50 mol*L-1NaCl洗脱, 分别收集穿过峰和洗脱峰, 测活性及蛋白含量. 将上一步骤收集的活性物质100℃水浴10 min, 1500 r*min-1离心，4℃，1 h除去变性蛋白. 上清用分子质量截留值为10 000的超滤膜浓缩, 测活性及蛋白含量. 阳离子交换基质CM-Sepharose FF(Pharmacia CO.)装柱2.6 cm×11.0 cm, 用磷酸缓冲液pH 7.2平衡层析柱, 将超滤浓缩液上样, 用PB液洗出不结合蛋白, 以0.5 mol*L-1和1.0 mol*L-1 NaCl阶梯洗脱, 收集活性部分, 测活性及蛋白含量. Sepharcyl S-100HR(Pharmacia CO.) 装柱1 cm×72 cm,预先用1 mol*L-1乙酸(pH 3.5)平衡. 将上一步骤的活性物质对1 mol*L-1乙酸透析, 离心取上清, 上样后用平衡液进行洗脱, 收集活性部分, 测活性及蛋白含量.
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1.2.2 活性检测 NIH 3T3细胞用含100 mL*L-1NBS的DMEM调至1×108*L-1, 接种于96孔板,每孔接种200 μL细胞悬液. CO2孵箱中培养24 h, 换用无血清培养液继续培养24 h, 待测样品用含10 g*L-1小牛白蛋白的10 mmol*L-1乙酸稀释后加入，每孔10 μL，再培养16 h,在培养结束前8 h换入含3H-TdR的培养液, 使每孔终浓度为3.7×104Bq. 培养结束后用多头细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维纸上, 三氯醋酸、无水乙醇、乙醚洗涤, 干燥后置于液闪瓶中, 每瓶加入5 mL闪烁液(PPO 4.0 g, PPOP 0.4 g, 二甲苯1 L). 在LS6500型闪烁计数仪(Beckman)上进行计数,结果用cpm表示, 以引起半最大刺激量3H-TdR掺入值所需的样品含量为一个pPDGF活性单位.
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1.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 按Leammli法[4]将最终分离出的样品进行150 g*L-1 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 其中部分样品用2-巯基乙醇还原后再进行150 g*L-1 SDS-PAGE, 考马斯亮蓝R250染色. 蛋白质含量测定采用Lowrys'法[5], 以牛血清白蛋白为标准品.
2 结果
2.1 pPDGF的提取和纯化 血小板裂解液经酸醇抽提比活提高了86倍, 活性回收率为51%, 经阴离子交换层析、热处理及超滤浓缩，阳离子交换层析其纯化倍数分别提高了296,299,352倍, 活性回收率分别为34%,5%和4%; 经S-100HR凝胶层析纯化倍数进一步提高为7582倍, 活性回收率为3%(Tab 1, Fig 1～3). 样品经100℃水浴10 min, 仍保持其生物学活性, 表明其热稳定性良好.
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表 1 猪血小板衍化生长因子纯化步骤
Tab 1 Porcine platelet-derived growth factor purification protocol
Step
Total protein/mg
Total activity/IU
Specific activity/(IU*mg-1)
Fold of purification
Recovery/%
Platlet lysate
, 百拇医药
39 800
1.8×106
45
1
100
Acid-ethanol extraction
237.32
9.2×105
3876
86
51
DEAE-Sepharose FF
, 百拇医药
45.83
6.1×105
13 310
296
34
Heat treatment
6.25
8.4×104
13 440
299
5
CM- Sepharose FF
, 百拇医药
4.35
6.9×104
15 862
352
4
Sepharcyl-100HR
0.17
5.8×104
341 176
7582
3
图 1 DEAE-Sepharose FF离子交换层析
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Fig 1 Chromatography of purified pPDGF through DEAE-Sepharose FF
Chromatographic condition: DEAE-Sepharose FF 2.6 cm×9 cm, flow rate 3 mL*min-1, 5 mL*tub-1.
图 2 CM-Sepharose FF离子交换层析
Fig 2 Chromatography of purified pPDGF through CM-Sepharose FF
Chromatographic condition: DEAE-Sepharose FF 2.6 cm×9 cm, flow rate 3 mL*min-1, 5 mL*tub-1.
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2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE结果显示, 从S-100HR分离的活性物质Mr3×105处出现一条明显的蛋白质染色带, 比活性达341 176 IU*mg-1蛋白. 经2-巯基乙醇还原后，SDS-PAGE显示Mr1.5×105处出现一条蛋白质染色带, 且其生物学活性基本消失(Fig 4).
图 3 Sepharcyl S-100 HR凝胶层析
Fig 3 Chromatography of purified pPDGF through the Sepharcyl S-100 HR
Chromatographic condition: CM-Sepharose FF 1 cm×72 cm, flow rate 0.5 mL*min-1, 5 mL*tub-1.
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图 4 pPDGF的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
Fig 4 SDS-PAGE of pPDGF
A：Sample of purified pPDGF; B：Proteins of standard molecular weights; C：Sample of purified pPDGF treatment with 100 mL*L-1 2-mercaptoethanol.
3 讨论
PDGF是一种耐酸、热稳定的阳离子糖蛋白, 针对其特殊的理化性质, 我们采用酸醇抽提法从猪血小板裂解液中提取粗制pPDGF, 虽然得率不高, 但除去了绝大部分的杂蛋白, 且纯化倍数为86倍, 说明酸醇抽提法是一种有效的提取pPDGF粗制品的方法. 由于PDGF具有热稳定性，经100℃水浴后，基本除去了样品中对热不稳定的蛋白和其他杂蛋白, 再经具有分子筛效应的Sepharryl S-100HR凝胶层析纯化可获得较高纯度的pPDGF. 150 g*L-1 SDS-PAGE分析， pPDGF的Mr 30 000. 经生物学活性检测，pPDGF可明显促进NIH 3T3细胞的DNA合成. 经100 mL*L-1 2-巯基乙醇还原后, pPDGF分解为Mr 15 000的蛋白，它可能是pPDGF 二硫键断裂后分解为两条相同分子量的肽链，经还原后的pPDGF生物学活性基本消失. 说明pPDGF中的二硫键的二聚体结构对保持其生物学活性起着十分重要的作用. 不论是同质或者异质二聚体都具有促进成纤维细胞、平滑肌细胞、胶质细胞等其他细胞的增殖和分化作用[6,7]. PDGF对中性粒细胞、单核细胞、成纤维细胞和胶质细胞有趋化作用.
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与以往从血小板中提取、纯化PDGF的方法[2,7]相比, 本实验方法简便,只需两步层析过程，使用仪器设备简单，提取纯化的周期较短, 同样得到纯度较高的PDGF. 我们实验采用猪血小板提取纯化PDGF, 猪血来源广泛所需费用较少. 建立一条适合于国内条件的相对简单、高效的纯化途径, 并达到较好的结果, 有利于推动我们对PDGF的生物学研究, 为进一步探索PDGF在生长、发育及相关疾病的发生、发展机制中所起的作用打下良好的基础.
作者简介：张永和(1961-)，男(汉族)，吉林省四平人. 博士，讲师，主治医师. Tel.(029)3375540 Email.zhang-y-h@chinaten.com
参考文献：
[1] Huang JS, Huang SS, Kenedy BB et al. Platelet-derived growth factor: Specific binding to target cell[J]. J Biol Chem, 1982;257:8130-8136.
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[2] Antoniades HN, Scher CD, Stiles CD et al. Purification of human platelet-derived growth factor[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1979;76(4):1809-1813.
[3] Davoren PR. The isolation of insulin from a cat pancreas[J]. Biochem Biophys Acta, 1962;63:150-153.
[4] Leammli UK.Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970;227(5259):680-683.
[5] Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL et al. Protein measurement with folin phenol reagent[J]. J Biol Chem, 1951;193(1):265-275.
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[6] Ross R, Rains EW, Bower-Pope D. The biology of platelet-derived growth factor[J]. Cell, 1986;46(7):155-169.
[7] Poggi A, Rucinski B, James P et al. Partial purification and characterization of porcine platelet-derived growth factor[J]. Exp Cell Res,1984;150(2):436-441.
收稿日期:1999-12-12; 修回日期:2000-07-02, 百拇医药