小鼠内皮抑素基因的克隆及序列测定
作者：屈延 章翔 吴景文 柴玉波 吴元明 高大宽
单位：第四军医大学西京医院全军神经外科研究所, 陕西 西安 710033
关键词：内皮抑素；基因扩增；序列分析
第四军医大学学报001006 摘 要：目的 获取小鼠内皮抑素(endostatin)基因并进行序列测定，为今后研究其机制及应用创造条件. 方法 以小鼠肝脏总RNA为模板，用RT-PCR法从中扩增endostatin基因，并将所得基因重组入pUC19载体质粒, 采用自动测序仪及荧光素标记引物，测定目的基因序列. 结果 从小鼠肝组织中成功扩增endostatin基因，并成功克隆入pUC19载体. 经酶切鉴定正确后，命名为pUC-Endo. 经测序证实所获基因序列与已知的endostatin基因序列一致. 结论 成功构建小鼠endostatin基因的重组克隆pUC-Endo，为今后利用endostatin进行胶质瘤的抗血管生成治疗研究奠定了实验基础.
, http://www.100md.com
中图号：Q784 文献标识码: A
文章编号：1000-2790(2000)10-1189-03
Cloning and sequencing of mouse endostatin gene
QU Yan, ZHANG Xiang, WU Jing-Wen, CHAI Yu-Bo, WU Yuan-Ming, GAO Da-Kuan
(Neurosurgery Institute of Chinese PLA,Xijing Hospital, Fourth Military Medical University. Xi'an 710033,China)
Abstract: AIM To obtain mouse endostatin gene and to explore its mechanism and application. METHODS cDNA encoding mouse endostatin was amplified from mouse liver by RT-PCR and cloned into the plasmid pUC19. The nucleotide sequence of the target gene was determined by the Perkin Elmer Amplied Biosystems 373 Sequencer with positive and reverse primers. RESULTS Endostatin gene clone was successfully constructed and named pUC-Endo. And the gene sequence cloned into pUC19 was consistent with the known sequence after determination. CONCLUSION The recombinant mouse endostatin gene clone has been established successfully and has provided a basis for further research of the glioma anti-vessel therapy.
, 百拇医药
Keywords:endostatin; gene amplification; sequence analysis
0 引言
脑胶质瘤是严重危害人类生命和健康的常见肿瘤，临床上虽采取积极的治疗，但疗效不佳，死亡率很高，迫切需要研究新的治疗方法. 近年来，脑胶质瘤的抗血管生成基因治疗受到高度重视，原因在于脑胶质瘤的恶性增殖和侵袭生长依赖于大量的血管生成，且肿瘤血管内皮细胞是稳定的血管治疗靶[1].
内皮抑素(endostatin)是O'Reilly等[2] 在治疗实体瘤研究中发现的. 他们在小鼠皮下重复注射该重组表达蛋白后，发现在没有毒性或耐药性的情况下endostatin完全抑制了试验组所有小鼠皮下Lewis肺癌、T241纤维肉瘤和B16F10黑色素瘤生长. 进一步研究表明，endostatin的抑瘤作用是通过其强烈抑制血管内皮细胞增殖的作用来实现的. 因此，endostatin作为一种新的血管生成抑制因子，在脑胶质瘤治疗方面具有广阔应用前景. 我们自行设计引物，从小鼠肝组织中扩增出endostatin基因，并成功地加以克隆，测序. 为今后研究和应用奠定了基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 克隆载体pUC19， E.coli DH5α 由本校生化教研室提供； 限制性内切酶EcoR I和Sal I, T4 DNA ligase，Tag DNA聚合酶, RNaseA 等分别为华美公司、美国Biolabs公司和Promega公司产品. 测序试剂盒、RNA提取试剂盒分别购自美国ABI公司和Gibco公司. 雄性昆明种小白鼠，由本校实验动物中心提供.
1.2 方法 参照文献[3]方法，从小鼠肝组织提取总RNA，反转录获得cDNA. 根据小鼠endostatin基因编码序列设计一对引物，在上下游引物5′端分别引入EcoR I和Sal I酶切位点. 引物由北京赛百盛生物工程公司合成. E1：5′ ATGAATTCATGCATACTCA
TCAGGACTTTC;E2： 5′ ATGTCGACTTATTTG
, 百拇医药
GAGAAAGAGGTCATG. PCR反应条件为94℃ 30s，58℃ 45s和72 ℃ 30 s，循环30次. PCR总反应体系为小鼠肝组织cDNA模板5 μL，20 pmol*L-1引物各1 μL，10 mmol*L-1 dNTP 2 μL，10×PCR 反应缓冲液5 μL和Taq DNA 聚合酶33.34 pmol*s-1，加水至总体积50 μL. 扩增产物用Clontech DNA纯化试剂盒回收纯化. 基因重组及序列测定用纯化扩增产物和pUC19载体以EcoR I和Sal I双酶切，T4 DNA ligase连接后，转化DH5α中；加入X-gal, IPTG，挑选白色阳性克隆. 碱裂解法小量提取质粒. 用EcoR I和Sal I双酶切鉴定. ABI 373自动测序仪测定DNA序列.
2 结果
2.1 PCR扩增目的基因序列 以小鼠肝脏cDNA为模板，PCR扩增获取目的基因片段，在15 g*L-1琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物大小为500～750 bp, 与预期552 bp大小基本一致(Fig 1).
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2.2 Endostatin编码基因的克隆 上述基因片段和质粒pUC19经EcoR I和Sal I双酶切，经连接后转化DH5α，挑选白色克隆进行上述双酶切鉴定. 15 g*L-1琼脂糖凝胶电泳显示所获片段为552 bp(Fig 2).
图 1 目的基因的PCR扩增
Fig 1 PCR amplification of target gene
1:PCR product;2:Marker.
图 2 pUC19-endostatin重组克隆酶切鉴定
Fig 2 Restriction mapping of recombinant pUC19-endostatin
, http://www.100md.com 1:Marker; 2:Recombinant plasmid pUC19-endostatin;3:pUC19.
2.3 Endostatin基因的序列测定 pUC19重组质粒经ABI 373自动测序仪测定DNA序列. 结果显示目的基因序列两端具有EcoR I和Sal I酶切位点，与已知序列相比完全一致如下:
GAATTCATGCATACTCATCAGGACTTTCAGC
CAGTGCTCCACCTGGTGGCACTGAACACCCC
CCTGTCTGGAGGCATGCGTGGTATCCGTGGA
GCAGATTTCCAGTGCTTCCAGCAAGCCCGAG
CCGTGGGGCTGTCGGGCACCTTCCGGGCTTT
, 百拇医药
CCTGTCCTCTAGGCTGCAGGATCTCTATAGC
ATCGTGCGCCGTGCTGACCGGGGGTCTGTGC
CCATCGTCAACCTGAAGGACGAGGTGCTATC
TCCCAGCTGGGACTCCCTGTTTTCTGGCTCC
CAGGGTAACTGCAACCCGGGGCCCGCATCTT
TTCTTTTGACGGCAGAGATGTCCTGAGACAC
CCAGCCTGGCCGCAGAAGAGCGTATGGCACG
GCTCGGACCCCAGTGGGCGGAGGCTGATGGA
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GAGTTACTGTGAGACATGGCGAACTGAAACT
ACTGGGGCTACAGGTCAGGCCTCCTCCCTGC
TGTCAGGCAGGCTCCTGGAACAGAAAGCTGC
GAGCTGCCACAACAGCTACATCGTCCTGTGC
ATTGAGAATAGCTTCATGACCTCTTTCTCCA
AATAAGTCGAC
3 讨论
许多研究发现，血管生成是恶性肿瘤侵袭生长的必要条件. 为了刺激血管生成，恶性肿瘤能产生多种促血管生长因子，如成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)等[4]. 少数恶性肿瘤还能产生血管生成抑制因子[5]，如血管抑素(angiostatin)和血小板反应素(thrombospondin)等[6]. 这些研究证实，肿瘤的血管生成是上述因子相互作用的结果[7，8].
, 百拇医药
内皮抑素是肿瘤产生的一种血管生成抑制因子，可直接作用于血管内皮细胞，阻断其G1期增殖，而抑制内皮细胞生长. Endostatin优于其他血管形成抑制因子，如VEGF抗体、反义VEGF和反义PDGF基因，因为肿瘤可通过遗传突变产生其他血管形成因子. Endostatin最初是从鼠血管内皮瘤细胞系(EOMA)分离得到的，经证实它是内生性胶原XVⅢ的C末端终末序列[2]，Mr 20 000. 但由于正常机体不存在endostatin，不能直接获取，故难以满足实验研究和临床应用的需要. 采用基因工程技术能大量生产重组内皮抑素，其纯度高、活性稳定和质量易于控制，是内皮抑素研究和发展应用的必然方向.
在本研究中，我们扩增了鼠endostatin基因片段，建立了目的基因克隆，序列测定与已知序列相比完全一致. 该项研究为探讨endostatin抑制血管生成机制，应用endostatin基因，采用抗血管生成方法治疗胶质瘤奠定了基础.
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970752)
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作者简介：屈延(1974-)，男(汉族)，陕西省西安市人. 硕士生(导师章 翔). Tel.(029)3375330 Email.qy1126@fmmu.edu.cn
参考文献:
[1] 章 翔. 基因治疗[A]. 见: 章 翔. 神经系统肿瘤学[M]. 北京: 军事医学科学出版社, 1999:208-218.
[2] O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y et al. Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J]. Cell, 1997; 88(2): 277-285.
[3] Sambrook J, Fritsich EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual[M]. 2nd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 60-87.
, 百拇医药
[4] Kandel J, Bossy-Wetzel E, Radvanyi F et al. Neovascularization is associated with a switch to the export of bFGF in the multistep development of fibrosarcoma[J]. Cell, 1991; 66(6):1095-1104.
[5] Chen C, Parangi S, Tolentino MJ et al. A strategy to discover circulating angiogenesis inhibitors generated by human tumor[J]. Cancer Res, 1995; 55(19): 4230-4233.
[6] Good DJ, Polverini PJ, Rastinejad F et al. A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990; 87(6): 6624-6628.
, 百拇医药
[7] Rastinejad F, Polverini PJ, Bouck NP. Regulation of the activity of a new inhibitor of angiogenesis by a cancer suppressor gene[J]. Cell, 1989; 56(3): 345-355.
[8] Desmit MH, Duin JV. Translational initiation on structured messenger-another role for the shine-dalgarno interaction[J]. J Mol Biol, 1994; 235(1): 173-184.
收稿日期:1999-12-21; 修回日期:2000-03-06, 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院全军神经外科研究所, 陕西 西安 710033
关键词：内皮抑素；基因扩增；序列分析
第四军医大学学报001006 摘 要：目的 获取小鼠内皮抑素(endostatin)基因并进行序列测定，为今后研究其机制及应用创造条件. 方法 以小鼠肝脏总RNA为模板，用RT-PCR法从中扩增endostatin基因，并将所得基因重组入pUC19载体质粒, 采用自动测序仪及荧光素标记引物，测定目的基因序列. 结果 从小鼠肝组织中成功扩增endostatin基因，并成功克隆入pUC19载体. 经酶切鉴定正确后，命名为pUC-Endo. 经测序证实所获基因序列与已知的endostatin基因序列一致. 结论 成功构建小鼠endostatin基因的重组克隆pUC-Endo，为今后利用endostatin进行胶质瘤的抗血管生成治疗研究奠定了实验基础.
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中图号：Q784 文献标识码: A
文章编号：1000-2790(2000)10-1189-03
Cloning and sequencing of mouse endostatin gene
QU Yan, ZHANG Xiang, WU Jing-Wen, CHAI Yu-Bo, WU Yuan-Ming, GAO Da-Kuan
(Neurosurgery Institute of Chinese PLA,Xijing Hospital, Fourth Military Medical University. Xi'an 710033,China)
Abstract: AIM To obtain mouse endostatin gene and to explore its mechanism and application. METHODS cDNA encoding mouse endostatin was amplified from mouse liver by RT-PCR and cloned into the plasmid pUC19. The nucleotide sequence of the target gene was determined by the Perkin Elmer Amplied Biosystems 373 Sequencer with positive and reverse primers. RESULTS Endostatin gene clone was successfully constructed and named pUC-Endo. And the gene sequence cloned into pUC19 was consistent with the known sequence after determination. CONCLUSION The recombinant mouse endostatin gene clone has been established successfully and has provided a basis for further research of the glioma anti-vessel therapy.
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Keywords:endostatin; gene amplification; sequence analysis
0 引言
脑胶质瘤是严重危害人类生命和健康的常见肿瘤，临床上虽采取积极的治疗，但疗效不佳，死亡率很高，迫切需要研究新的治疗方法. 近年来，脑胶质瘤的抗血管生成基因治疗受到高度重视，原因在于脑胶质瘤的恶性增殖和侵袭生长依赖于大量的血管生成，且肿瘤血管内皮细胞是稳定的血管治疗靶[1].
内皮抑素(endostatin)是O'Reilly等[2] 在治疗实体瘤研究中发现的. 他们在小鼠皮下重复注射该重组表达蛋白后，发现在没有毒性或耐药性的情况下endostatin完全抑制了试验组所有小鼠皮下Lewis肺癌、T241纤维肉瘤和B16F10黑色素瘤生长. 进一步研究表明，endostatin的抑瘤作用是通过其强烈抑制血管内皮细胞增殖的作用来实现的. 因此，endostatin作为一种新的血管生成抑制因子，在脑胶质瘤治疗方面具有广阔应用前景. 我们自行设计引物，从小鼠肝组织中扩增出endostatin基因，并成功地加以克隆，测序. 为今后研究和应用奠定了基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 克隆载体pUC19， E.coli DH5α 由本校生化教研室提供； 限制性内切酶EcoR I和Sal I, T4 DNA ligase，Tag DNA聚合酶, RNaseA 等分别为华美公司、美国Biolabs公司和Promega公司产品. 测序试剂盒、RNA提取试剂盒分别购自美国ABI公司和Gibco公司. 雄性昆明种小白鼠，由本校实验动物中心提供.
1.2 方法 参照文献[3]方法，从小鼠肝组织提取总RNA，反转录获得cDNA. 根据小鼠endostatin基因编码序列设计一对引物，在上下游引物5′端分别引入EcoR I和Sal I酶切位点. 引物由北京赛百盛生物工程公司合成. E1：5′ ATGAATTCATGCATACTCA
TCAGGACTTTC;E2： 5′ ATGTCGACTTATTTG
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GAGAAAGAGGTCATG. PCR反应条件为94℃ 30s，58℃ 45s和72 ℃ 30 s，循环30次. PCR总反应体系为小鼠肝组织cDNA模板5 μL，20 pmol*L-1引物各1 μL，10 mmol*L-1 dNTP 2 μL，10×PCR 反应缓冲液5 μL和Taq DNA 聚合酶33.34 pmol*s-1，加水至总体积50 μL. 扩增产物用Clontech DNA纯化试剂盒回收纯化. 基因重组及序列测定用纯化扩增产物和pUC19载体以EcoR I和Sal I双酶切，T4 DNA ligase连接后，转化DH5α中；加入X-gal, IPTG，挑选白色阳性克隆. 碱裂解法小量提取质粒. 用EcoR I和Sal I双酶切鉴定. ABI 373自动测序仪测定DNA序列.
2 结果
2.1 PCR扩增目的基因序列 以小鼠肝脏cDNA为模板，PCR扩增获取目的基因片段，在15 g*L-1琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物大小为500～750 bp, 与预期552 bp大小基本一致(Fig 1).
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2.2 Endostatin编码基因的克隆 上述基因片段和质粒pUC19经EcoR I和Sal I双酶切，经连接后转化DH5α，挑选白色克隆进行上述双酶切鉴定. 15 g*L-1琼脂糖凝胶电泳显示所获片段为552 bp(Fig 2).
图 1 目的基因的PCR扩增
Fig 1 PCR amplification of target gene
1:PCR product;2:Marker.
图 2 pUC19-endostatin重组克隆酶切鉴定
Fig 2 Restriction mapping of recombinant pUC19-endostatin
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2.3 Endostatin基因的序列测定 pUC19重组质粒经ABI 373自动测序仪测定DNA序列. 结果显示目的基因序列两端具有EcoR I和Sal I酶切位点，与已知序列相比完全一致如下:
GAATTCATGCATACTCATCAGGACTTTCAGC
CAGTGCTCCACCTGGTGGCACTGAACACCCC
CCTGTCTGGAGGCATGCGTGGTATCCGTGGA
GCAGATTTCCAGTGCTTCCAGCAAGCCCGAG
CCGTGGGGCTGTCGGGCACCTTCCGGGCTTT
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CCTGTCCTCTAGGCTGCAGGATCTCTATAGC
ATCGTGCGCCGTGCTGACCGGGGGTCTGTGC
CCATCGTCAACCTGAAGGACGAGGTGCTATC
TCCCAGCTGGGACTCCCTGTTTTCTGGCTCC
CAGGGTAACTGCAACCCGGGGCCCGCATCTT
TTCTTTTGACGGCAGAGATGTCCTGAGACAC
CCAGCCTGGCCGCAGAAGAGCGTATGGCACG
GCTCGGACCCCAGTGGGCGGAGGCTGATGGA
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GAGTTACTGTGAGACATGGCGAACTGAAACT
ACTGGGGCTACAGGTCAGGCCTCCTCCCTGC
TGTCAGGCAGGCTCCTGGAACAGAAAGCTGC
GAGCTGCCACAACAGCTACATCGTCCTGTGC
ATTGAGAATAGCTTCATGACCTCTTTCTCCA
AATAAGTCGAC
3 讨论
许多研究发现，血管生成是恶性肿瘤侵袭生长的必要条件. 为了刺激血管生成，恶性肿瘤能产生多种促血管生长因子，如成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)等[4]. 少数恶性肿瘤还能产生血管生成抑制因子[5]，如血管抑素(angiostatin)和血小板反应素(thrombospondin)等[6]. 这些研究证实，肿瘤的血管生成是上述因子相互作用的结果[7，8].
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内皮抑素是肿瘤产生的一种血管生成抑制因子，可直接作用于血管内皮细胞，阻断其G1期增殖，而抑制内皮细胞生长. Endostatin优于其他血管形成抑制因子，如VEGF抗体、反义VEGF和反义PDGF基因，因为肿瘤可通过遗传突变产生其他血管形成因子. Endostatin最初是从鼠血管内皮瘤细胞系(EOMA)分离得到的，经证实它是内生性胶原XVⅢ的C末端终末序列[2]，Mr 20 000. 但由于正常机体不存在endostatin，不能直接获取，故难以满足实验研究和临床应用的需要. 采用基因工程技术能大量生产重组内皮抑素，其纯度高、活性稳定和质量易于控制，是内皮抑素研究和发展应用的必然方向.
在本研究中，我们扩增了鼠endostatin基因片段，建立了目的基因克隆，序列测定与已知序列相比完全一致. 该项研究为探讨endostatin抑制血管生成机制，应用endostatin基因，采用抗血管生成方法治疗胶质瘤奠定了基础.
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970752)
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作者简介：屈延(1974-)，男(汉族)，陕西省西安市人. 硕士生(导师章 翔). Tel.(029)3375330 Email.qy1126@fmmu.edu.cn
参考文献:
[1] 章 翔. 基因治疗[A]. 见: 章 翔. 神经系统肿瘤学[M]. 北京: 军事医学科学出版社, 1999:208-218.
[2] O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y et al. Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J]. Cell, 1997; 88(2): 277-285.
[3] Sambrook J, Fritsich EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual[M]. 2nd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 60-87.
, 百拇医药
[4] Kandel J, Bossy-Wetzel E, Radvanyi F et al. Neovascularization is associated with a switch to the export of bFGF in the multistep development of fibrosarcoma[J]. Cell, 1991; 66(6):1095-1104.
[5] Chen C, Parangi S, Tolentino MJ et al. A strategy to discover circulating angiogenesis inhibitors generated by human tumor[J]. Cancer Res, 1995; 55(19): 4230-4233.
[6] Good DJ, Polverini PJ, Rastinejad F et al. A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990; 87(6): 6624-6628.
, 百拇医药
[7] Rastinejad F, Polverini PJ, Bouck NP. Regulation of the activity of a new inhibitor of angiogenesis by a cancer suppressor gene[J]. Cell, 1989; 56(3): 345-355.
[8] Desmit MH, Duin JV. Translational initiation on structured messenger-another role for the shine-dalgarno interaction[J]. J Mol Biol, 1994; 235(1): 173-184.
收稿日期:1999-12-21; 修回日期:2000-03-06, 百拇医药