反义VEGF165真核表达载体的构建和表达
作者：吴景文 章翔 费舟 高大宽 屈延 粱景文 刘先珍
单位：第四军医大学西京医院全军神经外科研究所，陕西 西安 710033
关键词：血管内皮细胞生长因子；真核表达载体；构建；胶质瘤；表达
第四军医大学学报001002 摘 要： 目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验，构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体. 方法 将VEGF165 cDNA反向克隆入pcDNA3，构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165，用酶切鉴定结果；应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44，G418筛选阳性克隆；Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达. 检测转染前、后瘤细胞的生物学性状. 结果 获得反向构建的pcDNA-AVEGF165真核表达载体，VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达，该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响. 结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体，为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件.
, 百拇医药
中图号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1174-04
Construction and identification of antisense VEGF165 eukaryotic expression vector
WU Jing-Wen, ZHANG Xiang, FEI Zhou, GAO Da-Kuan, QU Yan, LIANG Jing-Wen, LIU Xian-Zhen
(Institute of Neurosurgery of Chinese PLA, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
, http://www.100md.com
Abstract: AIM To construct and to identify eukaryotic expression vector carrying human antisense VEGF165 cDNA to cure human glioma with antiangiogenesis method. METHODS VEGF165 cDNA was inserted into polylinker site of eukaryotic expression vector pcDNA3 to construct pcDNA-AVEGF165, in which restriction enzyme analysis was used to confirm the reverse orientation of the VEGF165cDNA from the individual transformants. The vector was transfected into human gliomas cell and the positive clone was screened by G418. The VEGF expression of SHG44 cells before or after transfection was detected by Western blot and immunohistochemistry. The biological characteristics of SHG44 cells before and after transfection was inspected. RESULTS The pcDNA-AVEGF165 vector was obtained. VEGF165 expression of SHG44 cells was blocked by antisense VEGF165 RNA. The characteristics of the tumor cells were not influenced by expression of the antisense gene. CONCLUSION The successful construction of antisense VEGF165 eukaryotic expression vector is of significance for glioma-specific antisense gene therapy.
, 百拇医药
Keywords： VEGF; eukaryotic expression vector; construction; gliomas, expression
0 引言
血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是非常重要的内皮细胞有丝分裂原，具有强烈促进内皮细胞增殖和增加血管通透性作用[1]. 人体细胞可产生4种VEGF多肽，其中VEGF165属于分泌型多肽，它以旁分泌方式通过内皮细胞膜受体起作用. 正常脑组织很少表达VEGF165，而人脑胶质瘤 随其恶性度增加，其VEGF165表达也显著提高；VEGF165是引起脑胶质瘤血管内皮细胞激增和肿瘤囊液形成的重要因素[1-3]. 为开展人脑胶质瘤的反义基因治疗实验，我们将VEGF165基因反向构建在真核表达载体pcDNA3上，并将其转染入人脑胶质瘤细胞SHG44内进行真核表达鉴定.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 pcDNA3真核表达载体、宿主菌DH5α，SHG44人脑胶质瘤细胞和pBS-VEGF165质粒由本所保存. pBS-VEGF165质粒含600 bp的VEGF165 cDNA，该基因编码具有功能活性的VEGF165，它能诱使血管通透性改变并可与VEGF-R2受体结合. 各种工具酶、试剂盒和兔抗人VEGF165 mAb为Promega，Gibco，Sigma和Dako公司产品.
1.2 方法
1.2.1 pcDNA-AVEGF165的构建与转染人脑胶质瘤细胞 pBS-VEGF165和pUC19质粒分别用XbaI和SalI双酶切，电泳后回收600 bp VEGF165片段，克隆入pUC19的XbaI-SalI位点，转化DH5α，获得重组质粒pUC-VEGF165 ；该重组质粒和pcDNA3用EcoRI和HindⅢ双酶切，将切出的VEGF165片段连接入pcDNA3真核表达载体的EcoRI和HindⅢ位点，转化DH5α，获得正、反向插入的重组质粒. 经双酶切鉴定后，将反向插入的阳性质粒命名为pcDNA-AVEGF165(Fig 1). 参照lipofectamine说明书，将pcDNA-AVEGF165和pcDNA3质粒转染入SHG44细胞，转染pcDNA-AVEGF165和pcDNA3质粒的细胞分别命名为实验组A和空载体组B，未转染瘤细胞称为对照组C. 经G418抗性筛选2 wk后，应用单细胞显微镜操作法选取单细胞阳性克隆，继续在G418抗性培养液内筛选2 wk. G418最初使用量是200 mg*L-1，1 wk后维持在400 mg*L-1.
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图1 pcDNA-AVEGF165真核表达载体构建流程图
Fig 1 Flow chart of pcDNA-AVEGF165 eukaryotic expression vector of construction (V=VEGF165)
1.2.2 VEGF165在SHG44细胞的表达检测 Western blot：SHG44瘤细胞在4℃含100 μmol*L-1 CoCl2培养液(诱导缺氧)孵育4～16 h后，从24 h收集各组培养上清液，用50 g*L-1肝磷脂葡聚糖凝胶(100 μL*株-1)浓集和100 mmol*L-1 pH 7.2磷酸钠冲洗，加入2×SDS-PAGE样品缓冲液抽提，装填于变性SDS-PAGE凝胶上. 电泳后，凝胶转移至固定膜. 在室温下，用1∶1000兔抗人VEGF165 mAb孵育1 h，冲去转移膜多余抗体，用1∶2000鼠抗兔酶标抗体稀释液在室温下孵育1 h，冲洗后行显色和照相. 免疫组化： A，B和C组瘤细胞在培养介质内(含100 μmol*L-1 CoCl2)生长至70%，进行胰酶消化和离心计数后，行细胞爬片和固定，用兔抗人VEGF165 mAb，行SABC免疫组化染色.
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1.2.3 SHG44瘤细胞的生物学特性 上述3组瘤细胞以2×104个接种于25 mL培养瓶，各接种7瓶，每日各取1瓶倒置显微镜下观察计数，绘制细胞生长曲线，比较各组细胞的生长速度. 上述3组瘤细胞各约3×106个，用无血清RPMI 1640培养液洗涤2次，2.5 g*L-1胰酶消化后，离心1800 r*min-1 10 min，沿管壁倒入20 g*L-1戊二醛2 mL，固定2 h后，送本校电镜室常规处理观察细胞超微结构. 上述3组瘤细胞在25 mL培养瓶长至70%～80%时，经上述同样洗涤、消化后，反复吹打使细胞混匀，并使每瓶细胞终体积为0.1 mL，将0.1 mL混合液注入700 mL*L-1冷乙醇10 mL中(盛乙醇的烧杯处于振荡状态)，制成单细胞悬液，送本校中心实验室进行细胞周期检测.
2 结果
2.1 pcDNA-AVEGF165的构建和SHG44瘤细胞转染 重组质粒pUC-VEGF165用XbaI和SalI， EcoRI和HindⅢ酶切鉴定构建正确(Fig 2). 重组质粒pcDNA-AVEGF165经EcoRI和HindⅢ， XbaI和HindⅢ双酶切鉴定证实为反向构建(Fig 3). 对照组细胞在200 mg*L-1 G418筛选压力下全部死亡； 实验和空载体组细胞开始呈克隆状生长， 挑出单细胞克隆后， 在400 mg*L-1 G418筛选压力下呈片状生长.
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图2 重组质粒pUC-VEGF165双酶切鉴定
Fig 2 Restriction mapping of recombinant plasmid pUC-VEGF165
A: DNA marker; B: XbaI and SalI restriction; C: EcoRI and HindⅢ restriction.
图3 重组质粒pcDNA-AVEGF165双酶切鉴定
Fig 3 Restriction mapping of recombinant plasmid pcDNA-AVEGF165
A: DNA marker; B: EcoRI and HindⅢ restriction; C: XbaI and HindⅢ restriction.
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2.2 SHG44细胞表达VEGF165 Western blot：A组不表达或弱表达VEGF；B，C组高表达VEGF (Fig 4). 免疫组化：A组不表达VEGF；B，C组高表达VEGF (Fig 5).
图4 Western blot检测SHG44细胞表达VEGF蛋白
Fig 4 Expression of VEGF in SHG44 cells by Western blot
A1:VEGF(-);A2:VEGF(+);B,C:VEGF().
图5 免疫组化检测SHG44细胞的VEGF表达
Fig 5 Expression of VEGF in SHG44 cells by SABC method ×400
, 百拇医药
A:VEGF(-);B:VEGF();C:VEGF().
2.3 SHG44细胞的生物学特性 3组瘤细胞接种后，经1～7 d的计数观察，其体外生长速率一致(Fig 6)；电镜下 A，B和C组瘤细胞均表现为细胞核大、胞质较少和线粒体增多；各组细胞的超微结构无差异. A，B和C组的G1，S 和G2期未见差异性改变.
图6 A，B，C三组瘤细胞的生长速率
Fig 6 Growth rate of tumor cells of group A, B and C
3 讨论
反义基因治疗是肿瘤基因治疗的重要组成部分，它是指应用反义核酸在转录或翻译水平阻断某些异常基因的表达，使肿瘤细胞进入正常分化轨道或导致瘤细胞凋亡. 反义核酸主要包括3类：反义RNA ，寡脱氧核苷酸(ODNs)和核酶(ribozyme)[4]. 有证据表明，人脑胶质瘤存在着内皮细胞的大量扩增和肿瘤的液化坏死，这与其产生的VEGF有密切关系：①胶质瘤坏死区周围的栅状细胞高表达VEGF，缺氧可快速诱导VEGF产生；肿瘤血管床密集分布VEGF-R， VEGF对胶质瘤血管生成具有强烈促进作用；②注射抗VEGF抗体能显著抑制人脑胶质瘤生长；③特异性切割VEGF核酶能阻断胶质瘤血管生成，进而抑制肿瘤增长[5,6]. VEGF及其受体在人脑胶质瘤血管生成过程中起关键作用, 阻断VEGF及其受体途径可为胶质瘤的治疗提供良机.
, http://www.100md.com
我们成功地构建了反义VEGF165真核表达载体并在人脑胶质瘤细胞进行了表达，反义VEGF165 RNA可阻止SHG44胶质瘤细胞表达VEGF. 因为VEGF165 cDNA两端的XbaI和SalI酶切位点不适于克隆入pcDNA3载体中，故此，我们先将其构建在pUC19上，然后再克隆入pcDNA3载体中，经EcoRI和HindⅢ，XbaI和HindⅢ双酶切鉴定证实为反向构建. 该重组质粒转染人脑胶质瘤SHG44细胞后，应用G418成功筛选出携带pcDNA-AVEGF165质粒的胶质瘤细胞. 经Western blot和免疫组化证实，实验组瘤细胞不能表达或低表达VEGF，而对照和空载体组高表达VEGF，这说明实验组瘤细胞的VEGF表达已基本被阻断. 另外，转染反义VEGF165真核表达载体的SHG44瘤细胞的生物学活性不受影响，具体表现在3组瘤细胞的体外生长速率一致，瘤细胞周期和电镜检查未见差异性改变. 我们开展的这项实验为进一步进行人脑胶质瘤的反义基因治疗研究奠定了基础.
, 百拇医药
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970854)； 全军“九五”基金资助项目(97-M-141)
作者简介:吴景文(1966-)，男(汉族)，黑龙江省佳木斯市人. 博士，主治医师，讲师. Tel.(029)3375330 Email. wjwcxl@yahoo.com.cn
参考文献：
[1] 吴景文， 高大宽， 章 翔. 血管内皮生长因子及其受体与脑胶质瘤的抗血管生成治疗的研究进展[J]. 细胞与分子免疫学杂志,1999;15(1):26-28.
[2] Enholm B, Pavonen K, Ristimaki A et al. Comparison of VEGF, VEGF-B, VEGF-C and ang-1 mRNA regulation by serum growth factors, oncoproteins and hypoxia [J]. Oncogene, 1997;14(20): 2475-2483.
, 百拇医药
[3] Muller YA, Christinger HW, Wells JA et al. Vascular endothelial growth factor: Crystal structure and functional mapping of the kinase domain receptor binding site [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997; 94(14): 7192-7197.
[4] Su Z, Goldstein NI, Fisher PB. Antisense inhibition of the PTI-1 oncogene reverses cancer phenotypes [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 95(4): 1764-1769.
[5] Saleh M, Stacker SA, Wilks A. Inhibition of growth of C6 glioma cells in vivo by expression of antisense vascular endothelial growth factor sequence [J]. Cancer Res, 1996; 56:393-401.
[6] Laura E, Benjamin Eli. Keshet. Conditional switching of vascular endothelial growth factor expression in tumors: Induction of endothelial cell shedding and regression of hemangioblastoma-like vessels by VEGE withdrawal [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997; 94:8761-8766.
收稿日期：2000-05-02； 修回日期：2000-06-18, 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院全军神经外科研究所，陕西 西安 710033
关键词：血管内皮细胞生长因子；真核表达载体；构建；胶质瘤；表达
第四军医大学学报001002 摘 要： 目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验，构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体. 方法 将VEGF165 cDNA反向克隆入pcDNA3，构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165，用酶切鉴定结果；应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44，G418筛选阳性克隆；Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达. 检测转染前、后瘤细胞的生物学性状. 结果 获得反向构建的pcDNA-AVEGF165真核表达载体，VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达，该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响. 结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体，为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件.
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中图号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1174-04
Construction and identification of antisense VEGF165 eukaryotic expression vector
WU Jing-Wen, ZHANG Xiang, FEI Zhou, GAO Da-Kuan, QU Yan, LIANG Jing-Wen, LIU Xian-Zhen
(Institute of Neurosurgery of Chinese PLA, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
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Abstract: AIM To construct and to identify eukaryotic expression vector carrying human antisense VEGF165 cDNA to cure human glioma with antiangiogenesis method. METHODS VEGF165 cDNA was inserted into polylinker site of eukaryotic expression vector pcDNA3 to construct pcDNA-AVEGF165, in which restriction enzyme analysis was used to confirm the reverse orientation of the VEGF165cDNA from the individual transformants. The vector was transfected into human gliomas cell and the positive clone was screened by G418. The VEGF expression of SHG44 cells before or after transfection was detected by Western blot and immunohistochemistry. The biological characteristics of SHG44 cells before and after transfection was inspected. RESULTS The pcDNA-AVEGF165 vector was obtained. VEGF165 expression of SHG44 cells was blocked by antisense VEGF165 RNA. The characteristics of the tumor cells were not influenced by expression of the antisense gene. CONCLUSION The successful construction of antisense VEGF165 eukaryotic expression vector is of significance for glioma-specific antisense gene therapy.
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Keywords： VEGF; eukaryotic expression vector; construction; gliomas, expression
0 引言
血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是非常重要的内皮细胞有丝分裂原，具有强烈促进内皮细胞增殖和增加血管通透性作用[1]. 人体细胞可产生4种VEGF多肽，其中VEGF165属于分泌型多肽，它以旁分泌方式通过内皮细胞膜受体起作用. 正常脑组织很少表达VEGF165，而人脑胶质瘤 随其恶性度增加，其VEGF165表达也显著提高；VEGF165是引起脑胶质瘤血管内皮细胞激增和肿瘤囊液形成的重要因素[1-3]. 为开展人脑胶质瘤的反义基因治疗实验，我们将VEGF165基因反向构建在真核表达载体pcDNA3上，并将其转染入人脑胶质瘤细胞SHG44内进行真核表达鉴定.
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1 材料和方法
1.1 材料 pcDNA3真核表达载体、宿主菌DH5α，SHG44人脑胶质瘤细胞和pBS-VEGF165质粒由本所保存. pBS-VEGF165质粒含600 bp的VEGF165 cDNA，该基因编码具有功能活性的VEGF165，它能诱使血管通透性改变并可与VEGF-R2受体结合. 各种工具酶、试剂盒和兔抗人VEGF165 mAb为Promega，Gibco，Sigma和Dako公司产品.
1.2 方法
1.2.1 pcDNA-AVEGF165的构建与转染人脑胶质瘤细胞 pBS-VEGF165和pUC19质粒分别用XbaI和SalI双酶切，电泳后回收600 bp VEGF165片段，克隆入pUC19的XbaI-SalI位点，转化DH5α，获得重组质粒pUC-VEGF165 ；该重组质粒和pcDNA3用EcoRI和HindⅢ双酶切，将切出的VEGF165片段连接入pcDNA3真核表达载体的EcoRI和HindⅢ位点，转化DH5α，获得正、反向插入的重组质粒. 经双酶切鉴定后，将反向插入的阳性质粒命名为pcDNA-AVEGF165(Fig 1). 参照lipofectamine说明书，将pcDNA-AVEGF165和pcDNA3质粒转染入SHG44细胞，转染pcDNA-AVEGF165和pcDNA3质粒的细胞分别命名为实验组A和空载体组B，未转染瘤细胞称为对照组C. 经G418抗性筛选2 wk后，应用单细胞显微镜操作法选取单细胞阳性克隆，继续在G418抗性培养液内筛选2 wk. G418最初使用量是200 mg*L-1，1 wk后维持在400 mg*L-1.
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图1 pcDNA-AVEGF165真核表达载体构建流程图
Fig 1 Flow chart of pcDNA-AVEGF165 eukaryotic expression vector of construction (V=VEGF165)
1.2.2 VEGF165在SHG44细胞的表达检测 Western blot：SHG44瘤细胞在4℃含100 μmol*L-1 CoCl2培养液(诱导缺氧)孵育4～16 h后，从24 h收集各组培养上清液，用50 g*L-1肝磷脂葡聚糖凝胶(100 μL*株-1)浓集和100 mmol*L-1 pH 7.2磷酸钠冲洗，加入2×SDS-PAGE样品缓冲液抽提，装填于变性SDS-PAGE凝胶上. 电泳后，凝胶转移至固定膜. 在室温下，用1∶1000兔抗人VEGF165 mAb孵育1 h，冲去转移膜多余抗体，用1∶2000鼠抗兔酶标抗体稀释液在室温下孵育1 h，冲洗后行显色和照相. 免疫组化： A，B和C组瘤细胞在培养介质内(含100 μmol*L-1 CoCl2)生长至70%，进行胰酶消化和离心计数后，行细胞爬片和固定，用兔抗人VEGF165 mAb，行SABC免疫组化染色.
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1.2.3 SHG44瘤细胞的生物学特性 上述3组瘤细胞以2×104个接种于25 mL培养瓶，各接种7瓶，每日各取1瓶倒置显微镜下观察计数，绘制细胞生长曲线，比较各组细胞的生长速度. 上述3组瘤细胞各约3×106个，用无血清RPMI 1640培养液洗涤2次，2.5 g*L-1胰酶消化后，离心1800 r*min-1 10 min，沿管壁倒入20 g*L-1戊二醛2 mL，固定2 h后，送本校电镜室常规处理观察细胞超微结构. 上述3组瘤细胞在25 mL培养瓶长至70%～80%时，经上述同样洗涤、消化后，反复吹打使细胞混匀，并使每瓶细胞终体积为0.1 mL，将0.1 mL混合液注入700 mL*L-1冷乙醇10 mL中(盛乙醇的烧杯处于振荡状态)，制成单细胞悬液，送本校中心实验室进行细胞周期检测.
2 结果
2.1 pcDNA-AVEGF165的构建和SHG44瘤细胞转染 重组质粒pUC-VEGF165用XbaI和SalI， EcoRI和HindⅢ酶切鉴定构建正确(Fig 2). 重组质粒pcDNA-AVEGF165经EcoRI和HindⅢ， XbaI和HindⅢ双酶切鉴定证实为反向构建(Fig 3). 对照组细胞在200 mg*L-1 G418筛选压力下全部死亡； 实验和空载体组细胞开始呈克隆状生长， 挑出单细胞克隆后， 在400 mg*L-1 G418筛选压力下呈片状生长.
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图2 重组质粒pUC-VEGF165双酶切鉴定
Fig 2 Restriction mapping of recombinant plasmid pUC-VEGF165
A: DNA marker; B: XbaI and SalI restriction; C: EcoRI and HindⅢ restriction.
图3 重组质粒pcDNA-AVEGF165双酶切鉴定
Fig 3 Restriction mapping of recombinant plasmid pcDNA-AVEGF165
A: DNA marker; B: EcoRI and HindⅢ restriction; C: XbaI and HindⅢ restriction.
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2.2 SHG44细胞表达VEGF165 Western blot：A组不表达或弱表达VEGF；B，C组高表达VEGF (Fig 4). 免疫组化：A组不表达VEGF；B，C组高表达VEGF (Fig 5).
图4 Western blot检测SHG44细胞表达VEGF蛋白
Fig 4 Expression of VEGF in SHG44 cells by Western blot
A1:VEGF(-);A2:VEGF(+);B,C:VEGF().
图5 免疫组化检测SHG44细胞的VEGF表达
Fig 5 Expression of VEGF in SHG44 cells by SABC method ×400
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A:VEGF(-);B:VEGF();C:VEGF().
2.3 SHG44细胞的生物学特性 3组瘤细胞接种后，经1～7 d的计数观察，其体外生长速率一致(Fig 6)；电镜下 A，B和C组瘤细胞均表现为细胞核大、胞质较少和线粒体增多；各组细胞的超微结构无差异. A，B和C组的G1，S 和G2期未见差异性改变.
图6 A，B，C三组瘤细胞的生长速率
Fig 6 Growth rate of tumor cells of group A, B and C
3 讨论
反义基因治疗是肿瘤基因治疗的重要组成部分，它是指应用反义核酸在转录或翻译水平阻断某些异常基因的表达，使肿瘤细胞进入正常分化轨道或导致瘤细胞凋亡. 反义核酸主要包括3类：反义RNA ，寡脱氧核苷酸(ODNs)和核酶(ribozyme)[4]. 有证据表明，人脑胶质瘤存在着内皮细胞的大量扩增和肿瘤的液化坏死，这与其产生的VEGF有密切关系：①胶质瘤坏死区周围的栅状细胞高表达VEGF，缺氧可快速诱导VEGF产生；肿瘤血管床密集分布VEGF-R， VEGF对胶质瘤血管生成具有强烈促进作用；②注射抗VEGF抗体能显著抑制人脑胶质瘤生长；③特异性切割VEGF核酶能阻断胶质瘤血管生成，进而抑制肿瘤增长[5,6]. VEGF及其受体在人脑胶质瘤血管生成过程中起关键作用, 阻断VEGF及其受体途径可为胶质瘤的治疗提供良机.
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我们成功地构建了反义VEGF165真核表达载体并在人脑胶质瘤细胞进行了表达，反义VEGF165 RNA可阻止SHG44胶质瘤细胞表达VEGF. 因为VEGF165 cDNA两端的XbaI和SalI酶切位点不适于克隆入pcDNA3载体中，故此，我们先将其构建在pUC19上，然后再克隆入pcDNA3载体中，经EcoRI和HindⅢ，XbaI和HindⅢ双酶切鉴定证实为反向构建. 该重组质粒转染人脑胶质瘤SHG44细胞后，应用G418成功筛选出携带pcDNA-AVEGF165质粒的胶质瘤细胞. 经Western blot和免疫组化证实，实验组瘤细胞不能表达或低表达VEGF，而对照和空载体组高表达VEGF，这说明实验组瘤细胞的VEGF表达已基本被阻断. 另外，转染反义VEGF165真核表达载体的SHG44瘤细胞的生物学活性不受影响，具体表现在3组瘤细胞的体外生长速率一致，瘤细胞周期和电镜检查未见差异性改变. 我们开展的这项实验为进一步进行人脑胶质瘤的反义基因治疗研究奠定了基础.
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970854)； 全军“九五”基金资助项目(97-M-141)
作者简介:吴景文(1966-)，男(汉族)，黑龙江省佳木斯市人. 博士，主治医师，讲师. Tel.(029)3375330 Email. wjwcxl@yahoo.com.cn
参考文献：
[1] 吴景文， 高大宽， 章 翔. 血管内皮生长因子及其受体与脑胶质瘤的抗血管生成治疗的研究进展[J]. 细胞与分子免疫学杂志,1999;15(1):26-28.
[2] Enholm B, Pavonen K, Ristimaki A et al. Comparison of VEGF, VEGF-B, VEGF-C and ang-1 mRNA regulation by serum growth factors, oncoproteins and hypoxia [J]. Oncogene, 1997;14(20): 2475-2483.
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[3] Muller YA, Christinger HW, Wells JA et al. Vascular endothelial growth factor: Crystal structure and functional mapping of the kinase domain receptor binding site [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997; 94(14): 7192-7197.
[4] Su Z, Goldstein NI, Fisher PB. Antisense inhibition of the PTI-1 oncogene reverses cancer phenotypes [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 95(4): 1764-1769.
[5] Saleh M, Stacker SA, Wilks A. Inhibition of growth of C6 glioma cells in vivo by expression of antisense vascular endothelial growth factor sequence [J]. Cancer Res, 1996; 56:393-401.
[6] Laura E, Benjamin Eli. Keshet. Conditional switching of vascular endothelial growth factor expression in tumors: Induction of endothelial cell shedding and regression of hemangioblastoma-like vessels by VEGE withdrawal [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997; 94:8761-8766.
收稿日期：2000-05-02； 修回日期：2000-06-18, 百拇医药