IL-1β和IL-2对大鼠脑片视上核神经元膜电特性的影响
作者：王晓斌 胡三觉 鞠躬
单位：第四军医大学全军神经科学研究所，陕西 西安 710033
关键词：视上核；脑片；全细胞记录；细胞因子；白细胞介素-1；白细胞介素-2
第四军医大学学报001001 摘 要: 目的 研究细胞因子IL-1β和IL-2对大鼠视上核(supraoptic nucleus， SON)神经元膜电特性的影响, 并探讨其细胞机制. 方法 采用脑片全细胞膜片钳记录技术, 分别在电流钳和电压钳状态下记录大鼠SON神经元的膜电位和全细胞电流. 结果 100 000 U.L-1的IL-1β可使大鼠SON神经元超极化(3.4±1.3) mV, 且伴自发放电频率下降, 在电压钳状态下可记录到一外向电流; 100 000 U.-1的IL-2可使大部分SON神经元超极化(2.9±1.2) mV, 伴自发放电频率下降, 电压钳状态下可记录到一外向电流. 结论 细胞因子IL-1β和IL-2可抑制大鼠SON神经元的膜电活动.
, 百拇医药
中图号：Q423 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1171-03
ytokine IL-1β and IL-2 inhibits rat SON neurons in brain slices
WANG Xiao-Bin, HU San-Jue, JU Gong
(Institute of Neuroscience of Chinese PLA, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To observe the effects of cytokine IL-1β and IL-2 on the membrane electrophysiological characteristics of rat supraoptic nucleus (SON) neurons and to determine its preliminary mechanism. METHODS Using whole-cell recording technique in brain slices, recorded the membrane potentials and whole-cell currents of rat SON neurons were recorded respectively. RESULTS Rat SON neurons were hyperpolarized (3.4±1.3 mV) by 100 000 U.L-1 IL-1β, accompanied with the decreasing of spontaneous firing. An outward current was recorded in every neuron in voltage clamp condition. Most of the rat SON neurons were hyperpolarized (2.9±1.2 mV) by 100 000 U.L-1 IL-2, accompanied with the decreasing of spontaneous firing. Outward currents could also be observed. CONCLUSION Cytokine IL-1β and IL-2 can inhibit the rat SON neurons.
, 百拇医药
Keywords:supraoptic nucleus; brain slice; whole-cell recording; cytokine; interleukin-1; interleukin-2
0 引言
传统意义上的细胞因子是一类介入免疫系统的激活和感染反应的异源多肽调质，近年来越来越多的证据显示,它们中的多数作用于各种各样的组织，包括外周和中枢神经系统，神经组织表达细胞因子和它们的受体. 尽管有许多有关细胞因子介入诸如运动，心理紧张甚至睡眠等一般生理事件，但它们在其中所起的作用尚存在很大争议[1]，有证据显示IL-1β和IL-2作用于下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴[2,3]，对神经内分泌活动起调节作用. 我们采用离体脑薄片全细胞膜片钳记录方式，观察了IL-1β和IL-2对大鼠视上核(SON)神经元膜电位的影响，并对其细胞机制进行初步探讨.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 出生30 d的本校SD雄性大鼠，体重约50 g. 蔗糖ACSF的成分为(mmol*L-1): 蔗糖 250, KCl 2.5, CaCl2 2, MgSO4 2, NaH2PO4 1.25, NaHCO2 25. ACSF的成分为(mmol*L-1): NaCl 125, KCl 3, CaCl2 2, MgSO4 2, NaH2PO4 1.25, NaHCO2 25, 葡萄糖 10. 蔗糖ACSF电极内液的成分(mmol*L-1): K-Gluconate 140, MgCl2 2, Hepes 10, ATP 2, KOH调至pH为7.2. IL-1β和IL-2(Sigma 产品)在实验前溶解于ACSF.
, 百拇医药
1.2 方法 脑薄片的制备方法如前[4]. 大鼠经ip氯胺酮(100 mg*kg-1)麻醉后，断头并迅速取脑, 快速置于0～4℃经950 mL*L-1 O2和50 mL*L-1 CO2饱和的蔗糖人工脑脊液中(artificial cerebrospinal fluid, ACSF). 待脑完全冷却后, 对视上核所在脑区进行修块, 然后在震动切片机(美国Campden公司)上制备厚度为300 μm的含SON的水平下丘脑脑片，并置于26℃的充以950 mL*L-1 O2和50 mL*L-1 CO2的ACSF中孵育.
实验记录脑片在26℃的ACSF中孵育至少2 h后，移至记录槽, 用尼龙网及U形铂丝框加以固定，并以1～2 mL*min-1的速度灌流26℃的充以950 mL*L-1 O2和50 mL*L-1 CO2的ASCF. 在解剖镜(×15)下根据大鼠脑定位图谱分辨SON, 采用“盲插”方法对SON神经元进行全细胞记录. 玻璃微电极由PP-83电极拉制器(日本Narishige公司)拉制, 尖端开口约2 μm，充以电极内液. 封接前微电极阻抗为3～7 MΩ, 封接电阻为2～6 GΩ，串联电阻在20 MΩ以下. 在形成全细胞记录方式后, 单细胞的生物电信号经膜片钳放大器Axopatch 200A 放大, 并由DigiData 1200 板进行A/D转换后, 输入计算机, 由软件包Pclamp 6.0.2(美国Axon 公司)进行数据采集和分析, 对细胞的指令信号由计算机经D/A转换后给出. 采样频率为10 kHz，电信号均低通贝塞尔滤波(Lowpass Bessel Filter), -3 d频率为2 kHz.
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统计学处理：实验数据以
±s表示.
2 结果
在全细胞电流钳记录方式下测得52个SON神经元的静息膜电位为(-56±10) mV. 大部分SON神经元都有自发的动作电位发放，放电分为两种，一种为位相型放电，一种为非位相型放电，这可能和神经元的类型有关(加压素神经元和催产素神经元). 另外还可记录到自发的突触后电位(postsynaptic potentials, PSPs)，包括兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potentials, EPSPs)和抑制性突触后电位(inhibitory postsynaptic potentials, IPSPs). SON神经元膜的输入阻抗为(550±115) MΩ，膜的时间常数为(35±12) ms.
2.1 IL-1β对大鼠SON神经元膜电位的影响 在全细胞电流钳记录方式下，记录了25个SON神经元. 在不给予任何钳制电流(I=0)时，在灌流液中加入IL-1β(100 000 U*L-1)后，所有的SON神经元均表现为超极化(3.4±1.3) mV且伴有自发放电频率下降(31.6±6.3)%,(P<0.05)，在冲洗后基本恢复到原来的膜电位和自发放电水平(Fig 1).
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2.2 IL-2对大鼠SON神经元膜电位的影响 在全细胞电流钳记录方式下，27个大鼠SON神经元在给予100 000 U*L-1的IL-2后，其中22个表现为不同程度的超极化(2.9±1.2)mV，伴有自发放电减少(28.6±5.6)%,(P<0.05)，具有冲洗效应(Fig 2)，另外5个变化不明显.
图 1 IL-1β对大鼠SON神经元膜电位的影响
Fig 1 Effects of IL-1β on membrane potential of SON neurons in rat
图 2 IL-2对大鼠SON神经元膜电位的影响
Fig 2 Effects of IL-2 on membrane potential of SON neurons in rat
, 百拇医药
2.3 IL-1β和IL-2对大鼠SON神经元的全细胞电流的影响 把记录方式转换为全细胞电压钳状态，并把膜电位钳制在接近正常静息膜电位水平(钳制电位为-60 mV)时，从灌流液中加入100 000 U*L-1 的IL-1β，可引所记录的12个大鼠SON神经元产生一个外向电流，平均幅度为(66±23) pA; 同样，100 000 U*L-1 的IL-2 可诱发所记录的11个SON神经元产生一个平均幅度为(59±19) pA的外向电流(Fig 3).
图 3 IL-1β和IL-2对大鼠SON神经元的全细胞电流的影响
Fig 3 Effects of IL-1β and IL-2 on whole-cell currents of SON neurons in rat
Outward currents induced by IL-1β and IL-2 were shown in A and B, respectively. The holding potential was -60 mV.
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3 讨论
近年来研究发现,神经内分泌系统与免疫系统之间存在双向调节作用. 一方面，神经内分泌系统调控着机体免疫系统的功能，另一方面，免疫系统通过细胞因子作用于神经内分泌系统，调节其一些基本的活动. 细胞因子通过复杂的神经网络来调控神经内分泌系统的活动，但这种调控功能似乎主要还是通过对下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴，特别是对下丘脑的调节来实现.
下丘脑的神经元具有细胞因子IL-1β和IL-2受体[2-6]，近年来已被研究所证实. 尽管对细胞因子如何通过血脑屏障进入脑内仍存在很大争议，但实验已证实中枢神经系统可以表达细胞因子[5]，并且细胞因子可调节下丘脑神经激素的分泌[2,7] ，其作用的电生理机制目前仍不清楚. 我们采用脑片膜片钳全细胞记录技术对细胞因子影响SON神经元的细胞机制进行研究，结果表明，IL-1β和IL-2可以抑制正常大鼠SON神经元的电活动，其可能的机制是IL-1β和IL-2直接作用于SON神经元，直接影响其膜电特性，在全细胞电压钳状态下记录到的由IL-1β和IL-2产生的抑制性外向电流证实了这种可能性. 产生抑制的另一种可能机制是IL-1β和IL-2兴奋SON神经元突触前GABA能中间神经元，从而间接抑制SON神经元的活动[8]. 第二种机制可能对SON神经元的抑制起辅助作用.
, 百拇医药
以往的研究往往集中于行为学和神经内分泌学方面，对细胞因子影响内分泌神经元的细胞机制研究较少. 我们采用离体脑片膜片钳全细胞记录技术，研究了细胞因子IL-1β和IL-2对大鼠SON神经元膜电特性的影响，并对其细胞机制进行了初步的研究，结果显示，IL-1β和IL-2通过引起一个外向电流抑制大鼠SON神经元的膜电活动. 这为神经内分泌系统和免疫系统的双向调节作用提供了直接证据.
作者简介：王晓斌，(1969-)，男(汉族)，河南省郑州市人. 助教，博士生(导师鞠 躬，胡三觉). Tel.(029)3374564 Email.xbwang@fmmu.edu.cn
参考文献：
[1] Hanisch UK, Quirion R. Interleukin-2 as a neuroregulatory cytokine[J]. Brain Res Rev, 1996; 21(3):246-284.
, http://www.100md.com
[2] Saphier D, Ovadia H. Selective facilitation of putative corticotropin-releasing factor-secreting neurones by interleukin-1[J]. Neurosci Lett, 1990; 114(3):283-288.
[3] Raber J, Bloom FE. IL-2 induces vasopressin release from the hypothalamus and the amygdala:Role of nitric oxide-mediated signaling[J]. J Neurosci, 1994; 14(10):6187-6195.
[4] 刘青松, 贾铀生, 谢佐平et al. 大鼠下丘脑离体脑薄片SON神经元的全细胞记录[J]. 生理学报, 1997; 49(4):467-470.
, http://www.100md.com
[5] Hopkins SJ, Rothwell NJ. Cytokines and the nervous system I: Expression and recognition[J]. Trends Neurosci, 1995; 18(2):83-88.
[6] Araujo DM, Lapchak PA, Collier B et al. Localization of interl eukin-2 immunoreactivity and Interleukin-2 receptors in the rat:Interaction with the cholinergic system[J]. Brain Res, 1989; 498(2):257-266.
[7] Kimura T, Yamamoto T, Ota K et al. Central effects of interleukin-1 on blood pressure, thermogenesis, and the release of vasopressin, ACTH, and atrial natriuretic peptide[J]. Ann N Y Acad Sci, 1993; 689:330-345.
[8] Li ZH, Inenaga K, Yamashita H. GABAergic inputs modulate effects of interleukin-1β on supraoptic neurones in vitro[J]. Neuroreport, 1993; 5(2):181-183.
收稿日期：1999-12-03； 修回日期：2000-03-31, 百拇医药
单位：第四军医大学全军神经科学研究所，陕西 西安 710033
关键词：视上核；脑片；全细胞记录；细胞因子；白细胞介素-1；白细胞介素-2
第四军医大学学报001001 摘 要: 目的 研究细胞因子IL-1β和IL-2对大鼠视上核(supraoptic nucleus， SON)神经元膜电特性的影响, 并探讨其细胞机制. 方法 采用脑片全细胞膜片钳记录技术, 分别在电流钳和电压钳状态下记录大鼠SON神经元的膜电位和全细胞电流. 结果 100 000 U.L-1的IL-1β可使大鼠SON神经元超极化(3.4±1.3) mV, 且伴自发放电频率下降, 在电压钳状态下可记录到一外向电流; 100 000 U.-1的IL-2可使大部分SON神经元超极化(2.9±1.2) mV, 伴自发放电频率下降, 电压钳状态下可记录到一外向电流. 结论 细胞因子IL-1β和IL-2可抑制大鼠SON神经元的膜电活动.
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中图号：Q423 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1171-03
ytokine IL-1β and IL-2 inhibits rat SON neurons in brain slices
WANG Xiao-Bin, HU San-Jue, JU Gong
(Institute of Neuroscience of Chinese PLA, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To observe the effects of cytokine IL-1β and IL-2 on the membrane electrophysiological characteristics of rat supraoptic nucleus (SON) neurons and to determine its preliminary mechanism. METHODS Using whole-cell recording technique in brain slices, recorded the membrane potentials and whole-cell currents of rat SON neurons were recorded respectively. RESULTS Rat SON neurons were hyperpolarized (3.4±1.3 mV) by 100 000 U.L-1 IL-1β, accompanied with the decreasing of spontaneous firing. An outward current was recorded in every neuron in voltage clamp condition. Most of the rat SON neurons were hyperpolarized (2.9±1.2 mV) by 100 000 U.L-1 IL-2, accompanied with the decreasing of spontaneous firing. Outward currents could also be observed. CONCLUSION Cytokine IL-1β and IL-2 can inhibit the rat SON neurons.
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Keywords:supraoptic nucleus; brain slice; whole-cell recording; cytokine; interleukin-1; interleukin-2
0 引言
传统意义上的细胞因子是一类介入免疫系统的激活和感染反应的异源多肽调质，近年来越来越多的证据显示,它们中的多数作用于各种各样的组织，包括外周和中枢神经系统，神经组织表达细胞因子和它们的受体. 尽管有许多有关细胞因子介入诸如运动，心理紧张甚至睡眠等一般生理事件，但它们在其中所起的作用尚存在很大争议[1]，有证据显示IL-1β和IL-2作用于下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴[2,3]，对神经内分泌活动起调节作用. 我们采用离体脑薄片全细胞膜片钳记录方式，观察了IL-1β和IL-2对大鼠视上核(SON)神经元膜电位的影响，并对其细胞机制进行初步探讨.
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1 材料和方法
1.1 材料 出生30 d的本校SD雄性大鼠，体重约50 g. 蔗糖ACSF的成分为(mmol*L-1): 蔗糖 250, KCl 2.5, CaCl2 2, MgSO4 2, NaH2PO4 1.25, NaHCO2 25. ACSF的成分为(mmol*L-1): NaCl 125, KCl 3, CaCl2 2, MgSO4 2, NaH2PO4 1.25, NaHCO2 25, 葡萄糖 10. 蔗糖ACSF电极内液的成分(mmol*L-1): K-Gluconate 140, MgCl2 2, Hepes 10, ATP 2, KOH调至pH为7.2. IL-1β和IL-2(Sigma 产品)在实验前溶解于ACSF.
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1.2 方法 脑薄片的制备方法如前[4]. 大鼠经ip氯胺酮(100 mg*kg-1)麻醉后，断头并迅速取脑, 快速置于0～4℃经950 mL*L-1 O2和50 mL*L-1 CO2饱和的蔗糖人工脑脊液中(artificial cerebrospinal fluid, ACSF). 待脑完全冷却后, 对视上核所在脑区进行修块, 然后在震动切片机(美国Campden公司)上制备厚度为300 μm的含SON的水平下丘脑脑片，并置于26℃的充以950 mL*L-1 O2和50 mL*L-1 CO2的ACSF中孵育.
实验记录脑片在26℃的ACSF中孵育至少2 h后，移至记录槽, 用尼龙网及U形铂丝框加以固定，并以1～2 mL*min-1的速度灌流26℃的充以950 mL*L-1 O2和50 mL*L-1 CO2的ASCF. 在解剖镜(×15)下根据大鼠脑定位图谱分辨SON, 采用“盲插”方法对SON神经元进行全细胞记录. 玻璃微电极由PP-83电极拉制器(日本Narishige公司)拉制, 尖端开口约2 μm，充以电极内液. 封接前微电极阻抗为3～7 MΩ, 封接电阻为2～6 GΩ，串联电阻在20 MΩ以下. 在形成全细胞记录方式后, 单细胞的生物电信号经膜片钳放大器Axopatch 200A 放大, 并由DigiData 1200 板进行A/D转换后, 输入计算机, 由软件包Pclamp 6.0.2(美国Axon 公司)进行数据采集和分析, 对细胞的指令信号由计算机经D/A转换后给出. 采样频率为10 kHz，电信号均低通贝塞尔滤波(Lowpass Bessel Filter), -3 d频率为2 kHz.
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统计学处理：实验数据以
±s表示.2 结果
在全细胞电流钳记录方式下测得52个SON神经元的静息膜电位为(-56±10) mV. 大部分SON神经元都有自发的动作电位发放，放电分为两种，一种为位相型放电，一种为非位相型放电，这可能和神经元的类型有关(加压素神经元和催产素神经元). 另外还可记录到自发的突触后电位(postsynaptic potentials, PSPs)，包括兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potentials, EPSPs)和抑制性突触后电位(inhibitory postsynaptic potentials, IPSPs). SON神经元膜的输入阻抗为(550±115) MΩ，膜的时间常数为(35±12) ms.
2.1 IL-1β对大鼠SON神经元膜电位的影响 在全细胞电流钳记录方式下，记录了25个SON神经元. 在不给予任何钳制电流(I=0)时，在灌流液中加入IL-1β(100 000 U*L-1)后，所有的SON神经元均表现为超极化(3.4±1.3) mV且伴有自发放电频率下降(31.6±6.3)%,(P<0.05)，在冲洗后基本恢复到原来的膜电位和自发放电水平(Fig 1).
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2.2 IL-2对大鼠SON神经元膜电位的影响 在全细胞电流钳记录方式下，27个大鼠SON神经元在给予100 000 U*L-1的IL-2后，其中22个表现为不同程度的超极化(2.9±1.2)mV，伴有自发放电减少(28.6±5.6)%,(P<0.05)，具有冲洗效应(Fig 2)，另外5个变化不明显.
图 1 IL-1β对大鼠SON神经元膜电位的影响
Fig 1 Effects of IL-1β on membrane potential of SON neurons in rat
图 2 IL-2对大鼠SON神经元膜电位的影响
Fig 2 Effects of IL-2 on membrane potential of SON neurons in rat
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2.3 IL-1β和IL-2对大鼠SON神经元的全细胞电流的影响 把记录方式转换为全细胞电压钳状态，并把膜电位钳制在接近正常静息膜电位水平(钳制电位为-60 mV)时，从灌流液中加入100 000 U*L-1 的IL-1β，可引所记录的12个大鼠SON神经元产生一个外向电流，平均幅度为(66±23) pA; 同样，100 000 U*L-1 的IL-2 可诱发所记录的11个SON神经元产生一个平均幅度为(59±19) pA的外向电流(Fig 3).
图 3 IL-1β和IL-2对大鼠SON神经元的全细胞电流的影响
Fig 3 Effects of IL-1β and IL-2 on whole-cell currents of SON neurons in rat
Outward currents induced by IL-1β and IL-2 were shown in A and B, respectively. The holding potential was -60 mV.
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3 讨论
近年来研究发现,神经内分泌系统与免疫系统之间存在双向调节作用. 一方面，神经内分泌系统调控着机体免疫系统的功能，另一方面，免疫系统通过细胞因子作用于神经内分泌系统，调节其一些基本的活动. 细胞因子通过复杂的神经网络来调控神经内分泌系统的活动，但这种调控功能似乎主要还是通过对下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴，特别是对下丘脑的调节来实现.
下丘脑的神经元具有细胞因子IL-1β和IL-2受体[2-6]，近年来已被研究所证实. 尽管对细胞因子如何通过血脑屏障进入脑内仍存在很大争议，但实验已证实中枢神经系统可以表达细胞因子[5]，并且细胞因子可调节下丘脑神经激素的分泌[2,7] ，其作用的电生理机制目前仍不清楚. 我们采用脑片膜片钳全细胞记录技术对细胞因子影响SON神经元的细胞机制进行研究，结果表明，IL-1β和IL-2可以抑制正常大鼠SON神经元的电活动，其可能的机制是IL-1β和IL-2直接作用于SON神经元，直接影响其膜电特性，在全细胞电压钳状态下记录到的由IL-1β和IL-2产生的抑制性外向电流证实了这种可能性. 产生抑制的另一种可能机制是IL-1β和IL-2兴奋SON神经元突触前GABA能中间神经元，从而间接抑制SON神经元的活动[8]. 第二种机制可能对SON神经元的抑制起辅助作用.
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以往的研究往往集中于行为学和神经内分泌学方面，对细胞因子影响内分泌神经元的细胞机制研究较少. 我们采用离体脑片膜片钳全细胞记录技术，研究了细胞因子IL-1β和IL-2对大鼠SON神经元膜电特性的影响，并对其细胞机制进行了初步的研究，结果显示，IL-1β和IL-2通过引起一个外向电流抑制大鼠SON神经元的膜电活动. 这为神经内分泌系统和免疫系统的双向调节作用提供了直接证据.
作者简介：王晓斌，(1969-)，男(汉族)，河南省郑州市人. 助教，博士生(导师鞠 躬，胡三觉). Tel.(029)3374564 Email.xbwang@fmmu.edu.cn
参考文献：
[1] Hanisch UK, Quirion R. Interleukin-2 as a neuroregulatory cytokine[J]. Brain Res Rev, 1996; 21(3):246-284.
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[2] Saphier D, Ovadia H. Selective facilitation of putative corticotropin-releasing factor-secreting neurones by interleukin-1[J]. Neurosci Lett, 1990; 114(3):283-288.
[3] Raber J, Bloom FE. IL-2 induces vasopressin release from the hypothalamus and the amygdala:Role of nitric oxide-mediated signaling[J]. J Neurosci, 1994; 14(10):6187-6195.
[4] 刘青松, 贾铀生, 谢佐平et al. 大鼠下丘脑离体脑薄片SON神经元的全细胞记录[J]. 生理学报, 1997; 49(4):467-470.
, http://www.100md.com
[5] Hopkins SJ, Rothwell NJ. Cytokines and the nervous system I: Expression and recognition[J]. Trends Neurosci, 1995; 18(2):83-88.
[6] Araujo DM, Lapchak PA, Collier B et al. Localization of interl eukin-2 immunoreactivity and Interleukin-2 receptors in the rat:Interaction with the cholinergic system[J]. Brain Res, 1989; 498(2):257-266.
[7] Kimura T, Yamamoto T, Ota K et al. Central effects of interleukin-1 on blood pressure, thermogenesis, and the release of vasopressin, ACTH, and atrial natriuretic peptide[J]. Ann N Y Acad Sci, 1993; 689:330-345.
[8] Li ZH, Inenaga K, Yamashita H. GABAergic inputs modulate effects of interleukin-1β on supraoptic neurones in vitro[J]. Neuroreport, 1993; 5(2):181-183.
收稿日期：1999-12-03； 修回日期：2000-03-31, 百拇医药