RT-PCR法检测急性髓系白血病细胞中bcl-x基因的表达
作者：白庆咸 黄高昇 杨平地 张晓晖 杨岚 陈协群
单位：白庆咸 杨平地 杨岚 陈协群(第四军医大学西京医院血液科)；黄高昇 张晓晖(第四军医大学基础部病理教研室，陕西 西安 710033)
关键词：白血病；急性髓系；bcl-x基因
第四军医大学学报001042 中图号：R733.7 文献标识码：
文章编号：1000-2790(2000)10-封2-01
0 引言 细胞凋亡障碍与肿瘤细胞的多药耐药有关. 一些耐药细胞株表达较高水平的抗凋亡蛋白Bcl-xL. 我们将bcl-xL基因转导入白血病细胞株HL-60中，证实bcl-xL高表达可介导细胞耐药的形成[1]. 用PT-PCR法进一步检测bcl-x基因在16例急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)细胞mRNA水平的表达形式，并探讨抗凋亡基因bcl-xL的表达强度在预测AML化疗效果及预后中的意义.
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1 材料和方法
1.1 试剂 异硫氰酸胍为Sigma产品， M-MLV逆转录酶为Gibco产品，dNTP，Taq DNA聚合酶购自华美公司.
1.2 单个核细胞制备及RT-PCR 16例病例，年龄14～59岁. 予HA，DA方案化疗1～2个疗程，采用1987年苏州全国白血病化疗讨论会疗效判定标准. 全部病例均于化疗前采集骨髓2～3 mL，常规制备单个核细胞，计数后备用. 白血病细胞株HL-60，K562，HEL， Raji于含100 mL*L-1胎牛血清的RPMI1640配养液中常规传代培养. RNA的提取：采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA. RT-PCR： bcl-x引物设计参照文献[2]. cDNA 合成: 逆转录反应体系20 μL，包括细胞总RNA 1 μg，5×逆转录反应缓冲液4 μL ，2.5 mmol*L-1 dNTP 4 μL , oligodt 18 2 μL, M-MLV 反转录酶 200 U, 37℃反应60 min，99℃ 5 min终止反应. PCR反应体系50 μL, 包括逆转录产物4 μL, 寡核苷酸引物各5 pmol, 2.5 mmol*L-1 dNTP 4 μL, 10× PCR反应缓冲液5 μL, Taq DNA聚合酶1.5 U, 在PCR扩增仪上扩增. bcl-x反应条件：94℃ 45s 55℃ 40 s，72℃ 50 s. 35个循环.
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1.3 反应产物检测及结果判定 取10 μL PCR扩增产物在25 g*L-1琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察. bcl-x扩增片断为340 bp 的bcl-xL 及151 bp 的bcl-xS， 内对照β-actin的扩增片断为156 bp. bcl-xL 的PCR产物半定量分析：薄层扫描仪测定bcl-xL 与β-actin的相对比值，二者之比大于1定为强阳性，小于1定为弱阳性.
2 结果和讨论
2.1 bcl-x在白血病细胞mRNA水平的表达形式 RT-PCR结果显示：所有样本的内对照β-actin均为阳性. 4株白血病细胞株在mRNA水平表达bcl-xL,bcl-xS两种形式；16例病例有12例可测及bcl-x 的PCR产物，其中11例可见bcl-xL及bcl-xS片断，1例仅有bcl-xL.(图 1). AML细胞bcl-x表达的不均一性可能与AML在细胞起源、生物学特性方面的异质性(heterogenity)有关.
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图 1 AML病例、白血病细胞株及正常骨髓的bcl-x表达
2.2 bcl-x表达与化疗疗效的关系 RT-PCR结果的半定量分析显示， bcl-x阳性的12例AML中， bcl-xL强阳性表达6例，仅1例获得完全缓解；bcl-xL弱阳性表达6例，4例获得完全缓解. Bcl-x表达与AML预后是否相关，文献存在分歧. Stoezer等[3] 应用免疫组化方法观察14例AML病例白血病细胞凋亡相关蛋白Bcl-x，Bcl-2，Bax与初次化疗反应的关系，结果显示Bcl-2/Bax比值与预后相关，比值<1,易达到缓解(Complete remission, CR)，>1则较耐药；但Bcl-x，p170表达与CR 无相关. Pallis等[4]用流式细胞仪定量检测急性白血病病例中的Bcl-x阳性细胞，发现其阳性表达率与细胞的自主性生长特征有相关性，是预后不良的指标之一. 从我们目前有限的病例资料分析，bcl-xL的阳性强度可能与预后相关，强阳性提示不易达到CR. 但尚需进一步积累病例，以便分析bcl-xL阳性强度与急性白血病类型、初治、复发间的相关性.
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39400057)
作者简介：白庆咸(1962-)，女(汉族)，陕西省西安市人. 博士，讲师，主治医师. Tel(029)2511726
参考文献：
[1] 白庆咸 黄高升 陈协群. bcl-x-l对HL-60细胞凋亡易感性及化疗药物敏感性的影响[J]. 中华血液学杂志，1998 ; 19 (12)：655-656.
[2] Benito A, Silva M, Grillot D et al. Apoptosis induced by erythroid differentiation of human leukemia cell lines is inhibited by Bcl-x-l[J]. Blood,1987;3837-3843.
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[3] Stoezer OJ, Nussler V, Darsow M et al. Association of bcl-2, bax, bcl-xL and interleukin-1 β-converting enzyme expression with initial response to chemotherapy in acute myeloid leukemia[J]. Leukemia, 1996;10(Suppl 3):S18-S22.
[4] Pallis M, Zhu Y-M, Russell NH. Bcl-xL is heterogeneously expressed by acute myeloblastic leukemia cells and is associated with autonomous growth in vitro and with P-glycoprotein expression[J]. Leukemia, 1997,11:945～949.
收稿日期:2000-12-15; 修回日期:2000-03-31, http://www.100md.com
单位：白庆咸 杨平地 杨岚 陈协群(第四军医大学西京医院血液科)；黄高昇 张晓晖(第四军医大学基础部病理教研室，陕西 西安 710033)
关键词：白血病；急性髓系；bcl-x基因
第四军医大学学报001042 中图号：R733.7 文献标识码：
文章编号：1000-2790(2000)10-封2-01
0 引言 细胞凋亡障碍与肿瘤细胞的多药耐药有关. 一些耐药细胞株表达较高水平的抗凋亡蛋白Bcl-xL. 我们将bcl-xL基因转导入白血病细胞株HL-60中，证实bcl-xL高表达可介导细胞耐药的形成[1]. 用PT-PCR法进一步检测bcl-x基因在16例急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)细胞mRNA水平的表达形式，并探讨抗凋亡基因bcl-xL的表达强度在预测AML化疗效果及预后中的意义.
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1 材料和方法
1.1 试剂 异硫氰酸胍为Sigma产品， M-MLV逆转录酶为Gibco产品，dNTP，Taq DNA聚合酶购自华美公司.
1.2 单个核细胞制备及RT-PCR 16例病例，年龄14～59岁. 予HA，DA方案化疗1～2个疗程，采用1987年苏州全国白血病化疗讨论会疗效判定标准. 全部病例均于化疗前采集骨髓2～3 mL，常规制备单个核细胞，计数后备用. 白血病细胞株HL-60，K562，HEL， Raji于含100 mL*L-1胎牛血清的RPMI1640配养液中常规传代培养. RNA的提取：采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA. RT-PCR： bcl-x引物设计参照文献[2]. cDNA 合成: 逆转录反应体系20 μL，包括细胞总RNA 1 μg，5×逆转录反应缓冲液4 μL ，2.5 mmol*L-1 dNTP 4 μL , oligodt 18 2 μL, M-MLV 反转录酶 200 U, 37℃反应60 min，99℃ 5 min终止反应. PCR反应体系50 μL, 包括逆转录产物4 μL, 寡核苷酸引物各5 pmol, 2.5 mmol*L-1 dNTP 4 μL, 10× PCR反应缓冲液5 μL, Taq DNA聚合酶1.5 U, 在PCR扩增仪上扩增. bcl-x反应条件：94℃ 45s 55℃ 40 s，72℃ 50 s. 35个循环.
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1.3 反应产物检测及结果判定 取10 μL PCR扩增产物在25 g*L-1琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察. bcl-x扩增片断为340 bp 的bcl-xL 及151 bp 的bcl-xS， 内对照β-actin的扩增片断为156 bp. bcl-xL 的PCR产物半定量分析：薄层扫描仪测定bcl-xL 与β-actin的相对比值，二者之比大于1定为强阳性，小于1定为弱阳性.
2 结果和讨论
2.1 bcl-x在白血病细胞mRNA水平的表达形式 RT-PCR结果显示：所有样本的内对照β-actin均为阳性. 4株白血病细胞株在mRNA水平表达bcl-xL,bcl-xS两种形式；16例病例有12例可测及bcl-x 的PCR产物，其中11例可见bcl-xL及bcl-xS片断，1例仅有bcl-xL.(图 1). AML细胞bcl-x表达的不均一性可能与AML在细胞起源、生物学特性方面的异质性(heterogenity)有关.
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图 1 AML病例、白血病细胞株及正常骨髓的bcl-x表达
2.2 bcl-x表达与化疗疗效的关系 RT-PCR结果的半定量分析显示， bcl-x阳性的12例AML中， bcl-xL强阳性表达6例，仅1例获得完全缓解；bcl-xL弱阳性表达6例，4例获得完全缓解. Bcl-x表达与AML预后是否相关，文献存在分歧. Stoezer等[3] 应用免疫组化方法观察14例AML病例白血病细胞凋亡相关蛋白Bcl-x，Bcl-2，Bax与初次化疗反应的关系，结果显示Bcl-2/Bax比值与预后相关，比值<1,易达到缓解(Complete remission, CR)，>1则较耐药；但Bcl-x，p170表达与CR 无相关. Pallis等[4]用流式细胞仪定量检测急性白血病病例中的Bcl-x阳性细胞，发现其阳性表达率与细胞的自主性生长特征有相关性，是预后不良的指标之一. 从我们目前有限的病例资料分析，bcl-xL的阳性强度可能与预后相关，强阳性提示不易达到CR. 但尚需进一步积累病例，以便分析bcl-xL阳性强度与急性白血病类型、初治、复发间的相关性.
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39400057)
作者简介：白庆咸(1962-)，女(汉族)，陕西省西安市人. 博士，讲师，主治医师. Tel(029)2511726
参考文献：
[1] 白庆咸 黄高升 陈协群. bcl-x-l对HL-60细胞凋亡易感性及化疗药物敏感性的影响[J]. 中华血液学杂志，1998 ; 19 (12)：655-656.
[2] Benito A, Silva M, Grillot D et al. Apoptosis induced by erythroid differentiation of human leukemia cell lines is inhibited by Bcl-x-l[J]. Blood,1987;3837-3843.
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[3] Stoezer OJ, Nussler V, Darsow M et al. Association of bcl-2, bax, bcl-xL and interleukin-1 β-converting enzyme expression with initial response to chemotherapy in acute myeloid leukemia[J]. Leukemia, 1996;10(Suppl 3):S18-S22.
[4] Pallis M, Zhu Y-M, Russell NH. Bcl-xL is heterogeneously expressed by acute myeloblastic leukemia cells and is associated with autonomous growth in vitro and with P-glycoprotein expression[J]. Leukemia, 1997,11:945～949.
收稿日期:2000-12-15; 修回日期:2000-03-31, http://www.100md.com