用LDH释放法判断细胞病变程度确定干扰素生物活性
作者：程伟 顾瑛 李新元 司少艳 刘长暖
单位：解放军306医院实验科，北京 100101 程伟 李新元 司少艳 解放军总医院激光科，北京 100853 顾瑛 中国药物生物制品鉴定所，北京 100050 刘长暖
关键词：干扰素；LDH释放法；生物活性；检测
用LDH释放法判断细胞病变程度确定干扰素生物活性 摘要 目的：应用LDH释放法测定干扰素生物活性。方法：通过检测WISH细胞裂解后释放出的LDH活性判断细胞病变的程度，确定干扰素效价。对LDH释放法进行改进，与结晶紫染色法和MTT比色法进行灵敏度、重复性和相关性比较。结果和结论：该法减少了实验步骤和时间，成本低，敏感性高，重复性好，与其他方法所测结果无显著差异，简便实用，优于结晶紫染色法和MTT比色法。
中国图书资料分类法分类号 R 341.1
, http://www.100md.com
Using LDH release assay to detect cytopathic extent and determine antiviral activity of interferons
Cheng Wei, Gu Ying, Li Xingyuan, Si Shaoyan, Liu Changnuan
(Department of Laboratory, 306th Hospital of PLA, Beijing 100101)
Abstract Objective:Using LDH release assay detect the antiviral activity of Interferons. Methods:On the basis of LDH activity quantified after WISH cells were lysed, cytopathic extent was determined and antiviral activity of interferon detected. LDH release assay was improved and was compared with the crystal violet staining and the MTT colorimetry on sensitivity, repeatability and relateness.Results and Conclusions:The detection procedures, reagent cost and time were reduced in LDH release assay with higher sensitivity and better repeatability. There was no significant difference between LDH release assay, crystal violet stained and MTT colorimetry. LDH release assay was convenient and applicable and was better than crystal violet staining and MTT colorimetry.
, 百拇医药
Key words Interferon；LDH release assay; antiviral activity; detection
测定干扰素效价常用细胞病变抑制(CPE)法〔1〕。依判断细胞病变程度的方式不同，该法分为微量CPE法〔1〕、结晶紫染色法〔2〕和MTT比色法〔3〕等。这些方法均能反映干扰素的抗病毒活性，但尚存在一些问题有待改进。
Korzeniewiski等曾用LDH释放法测定NK细胞活性，该法具有反应迅速、客观，可定量分析等特点〔4〕。本研究对LDH释放法进行了改进，并用于干扰素效价的检测，旨在探索建立一种适用于检测干扰素效价的新方法。
1 材料和方法
1.1 材料 人羊膜细胞WISH株、水泡性口炎病毒(VSV)和干扰素标准品 (12000IU/ml) 由中国药品生物制品鉴定所提供；LDH底物：同文献〔5〕，分装小瓶，-20 ℃ 避光保存。使用时与 2% NP-40 等量混合；终止液： 0.1 mol/L 柠檬酸；酶标仪：BIO-RAD M550美国产。
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1.2 方法
1.2.1 本实验采用CPE法测定干扰素效价，用改进的LDH释放法判断结果，简述如下：将待测和标准干扰素适当稀释，设细胞和病毒对照，分别加入96孔培养板，50μl/孔。加 6×105/ml WISH细胞50 μl/孔，混匀，培养 10～12 h。弃上清，加100TCID50 VSV攻击 100 μl/孔，细胞对照孔加培养液 100μl，继续培养 18～24 h，至病毒对照接近 100% 病变时，弃上清用PBS洗一遍，加入LDH底物 100μl/孔， 5 min 后加入终止液25μl/孔，混匀 1 min 后，测吸光度(A值)，波长为 570 nm，按文献〔2〕方法计算效价。
1.2.2 改进的LDH释放法底物反应时间与细胞浓度的选择 将细胞稀释至 0.1×105/ml、 0.5×105/ml、 1×105/ml、 2×105/ml、 3×105 和 4×105/ml， 100μl/孔，37 ℃， 5% CO2 培养 38 h，按 1.2.1 条件测A值，LDH底物反应时间分别为 1min、3min、 5min、 9 min 和 12 min，各3复孔。结果做反应曲线。
, 百拇医药
1.2.3 测定WISH细胞的灵敏度比较 按 1.2.2 条件处理细胞，LDH底物反应 5 min。同时用结晶紫染色法和MTT比色法检测，各 3 复孔，三法测定波长相同〔2，3〕，结果作回归分析。
1.2.4 测定干扰素效价重复性比较 取1份干扰素样品，按 1.2.1 条件测定效价，用上述三法显示结果，重复10次。分别算出三法的
±s(log IU/ml)和变异系数(CV%)。因攻击病毒的时间影响测定的敏感性，所以选择 10～12 h。
1.2.5 测定干扰素效价相关性比较 按 1.2.1 条件测定11批干扰素样品效价，分别用上述三法显示结果，做方差和复相关(R)分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 改进的LDH释放法最适反应时间和细胞浓度 由附图可见底物反应在5min 时，线性最好，故以此作为反应终止时间。附图可见若 3.0×105/ml 细胞出现 95% 以上病变，即活细胞减少至 0.1×105/ml 时，仍能保持良好线性，所以 3.0×105/ml 为测定细胞浓度。
附图 LDH底物反应时间、细胞浓度曲线
2.2 测定WISH细胞的灵敏度比较 三法所测细胞浓度均在线性范围内，基本一致。改进的LDH释放法为y＝0.1808+0.3065x, r=0.9943；结晶紫染色法y＝0.0882+0.0982x, r=0.9798；MTT比色法y＝0.0587+0.2364x, r=0.9974，前者灵敏度高于后二者。
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2.3 干扰素效价测定重复性比较±s (log IU/ml) 和CV(%)依次为 3.301±0.061， 1.9%； 3.375±0.101， 3.0%； 3.342±0.024，1.2%。符合实验要求。
2.4 测定干扰素效价相关性比较 测定结果见附表，三种方法无显著差异 P>0.05，r＝0.9869 (P<0.01)，相关密切。
附表 3 种方法测定干扰素样品结果
测定日期
批号
检测结果(IU/ml)
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LDH释放法
结晶紫染色法
MTT比色法
98.1.23
880209
67635.5
60297.3
54945.3
98.3.15
880403
171149.9
2000352.5
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198926.3
880405
7716.4
14392.7
10526.7
98.6.26
880510
53545.3
53951.5
52539.4
880516
56319.7
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59152.3
59007.4
98.7.16
880623
55348.6
55920.7
54446.4
880630
26044.3
36990.7
32828.0
880715
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36318.8
25121.0
27026.9
98.9.11
880819
41667.8
48862.1
45042.2
880907
40696.3
38583.5
41180.0
, 百拇医药
880918
38395.0
31636.3
32494.2
3 讨 论
微量CPE法根据细胞形态学变化判断结果，费力耗时，主观误差较大〔2〕。结晶紫染色法是对活细胞染色，特异性和灵敏度都较低。MTT比色法较前者敏感和客观，但需提前4h加入MTT，限制了测定时间，若病变延迟出现，则影响结果判断，且试剂成本较高。
LDH是活细胞浆内酶，正常时不能透过细胞膜，其活性与细胞数量成正比。本研究对LDH释放法进行了如下改进：①用 1% NP-40 裂解细胞可使LDH充分释放，提高了敏感性〔6〕。②将裂解细胞和酶促反应一步进行，简化操作步骤，减少了操作误差。③底物放 -20 ℃ 保存，避免了每次使用需新鲜配制的麻烦，减少了配制误差，存放半年无改变。④将底物稀释 1 倍，降低了用量，成本仅为MTT法的 1/40，与结晶紫染色法相当。⑤显色前漂洗细胞，避免了培养液、pH及病变细胞等对反应的干扰，提高了稳定性〔7〕。三法结果比较表明，经上述改进的LDH释放法测定干扰素效价是可行的。
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WISH细胞的良好生长状态与细胞的接种密度和生长时间有关，根据本研究在 96 孔培养板中培养 38 ～ 40 h 观察，细胞在 3.0×105/ml 浓度时，状态最佳，呈均匀单层生长略显透明，基本铺满孔底 (95%～98%)，与附图结果一致。
本方法底物反应速度较快，为减少加液时间延长所致的误差，建议用 8 道或 12 道加液器。
综上所述，改进的LDH释放法操作简便，敏感性、客观性、试剂成本及测定速度等均优于结晶紫染色法和MTT比色法。 参考文献
1 杜平主编.医用干扰素学.上海：上海微生物学会干扰素组，1985.172
2 肖成祖，李广善，张吟庵等.一种快速简便的人干扰素微量板染色测定法.中华微生物学和免疫学杂志，1985，5(3)：181
, http://www.100md.com
3 尹纯德，金伯泉，黄传书等.应用MTT法测定干扰素的生物活性效价.上海免疫学杂志，1990，10(4)：247
4 Korzeniewski C, Callewaert DM. An enzyme-release assay for natral cytotoxicity. J Immu Meth, 1983,64:313
5 何金生，宗庭益.LDH释放法检测NK细胞活性的方法学研究.中国实验临床免疫学杂志，1996，8(2)：10
6 何金生，李少芬，宗庭益等.检测NK细胞活性的三种方法的比较分析.中国实验临床免疫学杂志，1997，9(2)：8
7 李秀森，刘晓丹，柯志勇等.MTT比色法在LAK和NK细胞毒活性检测中的应用.中国实验临床免疫学杂志，1997，9(6)：1
(1999—03—08收稿，1999—05—05修回), http://www.100md.com
单位：解放军306医院实验科，北京 100101 程伟 李新元 司少艳 解放军总医院激光科，北京 100853 顾瑛 中国药物生物制品鉴定所，北京 100050 刘长暖
关键词：干扰素；LDH释放法；生物活性；检测
用LDH释放法判断细胞病变程度确定干扰素生物活性 摘要 目的：应用LDH释放法测定干扰素生物活性。方法：通过检测WISH细胞裂解后释放出的LDH活性判断细胞病变的程度，确定干扰素效价。对LDH释放法进行改进，与结晶紫染色法和MTT比色法进行灵敏度、重复性和相关性比较。结果和结论：该法减少了实验步骤和时间，成本低，敏感性高，重复性好，与其他方法所测结果无显著差异，简便实用，优于结晶紫染色法和MTT比色法。
中国图书资料分类法分类号 R 341.1
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Using LDH release assay to detect cytopathic extent and determine antiviral activity of interferons
Cheng Wei, Gu Ying, Li Xingyuan, Si Shaoyan, Liu Changnuan
(Department of Laboratory, 306th Hospital of PLA, Beijing 100101)
Abstract Objective:Using LDH release assay detect the antiviral activity of Interferons. Methods:On the basis of LDH activity quantified after WISH cells were lysed, cytopathic extent was determined and antiviral activity of interferon detected. LDH release assay was improved and was compared with the crystal violet staining and the MTT colorimetry on sensitivity, repeatability and relateness.Results and Conclusions:The detection procedures, reagent cost and time were reduced in LDH release assay with higher sensitivity and better repeatability. There was no significant difference between LDH release assay, crystal violet stained and MTT colorimetry. LDH release assay was convenient and applicable and was better than crystal violet staining and MTT colorimetry.
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Key words Interferon；LDH release assay; antiviral activity; detection
测定干扰素效价常用细胞病变抑制(CPE)法〔1〕。依判断细胞病变程度的方式不同，该法分为微量CPE法〔1〕、结晶紫染色法〔2〕和MTT比色法〔3〕等。这些方法均能反映干扰素的抗病毒活性，但尚存在一些问题有待改进。
Korzeniewiski等曾用LDH释放法测定NK细胞活性，该法具有反应迅速、客观，可定量分析等特点〔4〕。本研究对LDH释放法进行了改进，并用于干扰素效价的检测，旨在探索建立一种适用于检测干扰素效价的新方法。
1 材料和方法
1.1 材料 人羊膜细胞WISH株、水泡性口炎病毒(VSV)和干扰素标准品 (12000IU/ml) 由中国药品生物制品鉴定所提供；LDH底物：同文献〔5〕，分装小瓶，-20 ℃ 避光保存。使用时与 2% NP-40 等量混合；终止液： 0.1 mol/L 柠檬酸；酶标仪：BIO-RAD M550美国产。
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1.2 方法
1.2.1 本实验采用CPE法测定干扰素效价，用改进的LDH释放法判断结果，简述如下：将待测和标准干扰素适当稀释，设细胞和病毒对照，分别加入96孔培养板，50μl/孔。加 6×105/ml WISH细胞50 μl/孔，混匀，培养 10～12 h。弃上清，加100TCID50 VSV攻击 100 μl/孔，细胞对照孔加培养液 100μl，继续培养 18～24 h，至病毒对照接近 100% 病变时，弃上清用PBS洗一遍，加入LDH底物 100μl/孔， 5 min 后加入终止液25μl/孔，混匀 1 min 后，测吸光度(A值)，波长为 570 nm，按文献〔2〕方法计算效价。
1.2.2 改进的LDH释放法底物反应时间与细胞浓度的选择 将细胞稀释至 0.1×105/ml、 0.5×105/ml、 1×105/ml、 2×105/ml、 3×105 和 4×105/ml， 100μl/孔，37 ℃， 5% CO2 培养 38 h，按 1.2.1 条件测A值，LDH底物反应时间分别为 1min、3min、 5min、 9 min 和 12 min，各3复孔。结果做反应曲线。
, 百拇医药
1.2.3 测定WISH细胞的灵敏度比较 按 1.2.2 条件处理细胞，LDH底物反应 5 min。同时用结晶紫染色法和MTT比色法检测，各 3 复孔，三法测定波长相同〔2，3〕，结果作回归分析。
1.2.4 测定干扰素效价重复性比较 取1份干扰素样品，按 1.2.1 条件测定效价，用上述三法显示结果，重复10次。分别算出三法的
±s(log IU/ml)和变异系数(CV%)。因攻击病毒的时间影响测定的敏感性，所以选择 10～12 h。1.2.5 测定干扰素效价相关性比较 按 1.2.1 条件测定11批干扰素样品效价，分别用上述三法显示结果，做方差和复相关(R)分析。
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2 结 果
2.1 改进的LDH释放法最适反应时间和细胞浓度 由附图可见底物反应在5min 时，线性最好，故以此作为反应终止时间。附图可见若 3.0×105/ml 细胞出现 95% 以上病变，即活细胞减少至 0.1×105/ml 时，仍能保持良好线性，所以 3.0×105/ml 为测定细胞浓度。
附图 LDH底物反应时间、细胞浓度曲线
2.2 测定WISH细胞的灵敏度比较 三法所测细胞浓度均在线性范围内，基本一致。改进的LDH释放法为y＝0.1808+0.3065x, r=0.9943；结晶紫染色法y＝0.0882+0.0982x, r=0.9798；MTT比色法y＝0.0587+0.2364x, r=0.9974，前者灵敏度高于后二者。
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2.3 干扰素效价测定重复性比较
±s (log IU/ml) 和CV(%)依次为 3.301±0.061， 1.9%； 3.375±0.101， 3.0%； 3.342±0.024，1.2%。符合实验要求。2.4 测定干扰素效价相关性比较 测定结果见附表，三种方法无显著差异 P>0.05，r＝0.9869 (P<0.01)，相关密切。
附表 3 种方法测定干扰素样品结果
测定日期
批号
检测结果(IU/ml)
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LDH释放法
结晶紫染色法
MTT比色法
98.1.23
880209
67635.5
60297.3
54945.3
98.3.15
880403
171149.9
2000352.5
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198926.3
880405
7716.4
14392.7
10526.7
98.6.26
880510
53545.3
53951.5
52539.4
880516
56319.7
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59152.3
59007.4
98.7.16
880623
55348.6
55920.7
54446.4
880630
26044.3
36990.7
32828.0
880715
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36318.8
25121.0
27026.9
98.9.11
880819
41667.8
48862.1
45042.2
880907
40696.3
38583.5
41180.0
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880918
38395.0
31636.3
32494.2
3 讨 论
微量CPE法根据细胞形态学变化判断结果，费力耗时，主观误差较大〔2〕。结晶紫染色法是对活细胞染色，特异性和灵敏度都较低。MTT比色法较前者敏感和客观，但需提前4h加入MTT，限制了测定时间，若病变延迟出现，则影响结果判断，且试剂成本较高。
LDH是活细胞浆内酶，正常时不能透过细胞膜，其活性与细胞数量成正比。本研究对LDH释放法进行了如下改进：①用 1% NP-40 裂解细胞可使LDH充分释放，提高了敏感性〔6〕。②将裂解细胞和酶促反应一步进行，简化操作步骤，减少了操作误差。③底物放 -20 ℃ 保存，避免了每次使用需新鲜配制的麻烦，减少了配制误差，存放半年无改变。④将底物稀释 1 倍，降低了用量，成本仅为MTT法的 1/40，与结晶紫染色法相当。⑤显色前漂洗细胞，避免了培养液、pH及病变细胞等对反应的干扰，提高了稳定性〔7〕。三法结果比较表明，经上述改进的LDH释放法测定干扰素效价是可行的。
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WISH细胞的良好生长状态与细胞的接种密度和生长时间有关，根据本研究在 96 孔培养板中培养 38 ～ 40 h 观察，细胞在 3.0×105/ml 浓度时，状态最佳，呈均匀单层生长略显透明，基本铺满孔底 (95%～98%)，与附图结果一致。
本方法底物反应速度较快，为减少加液时间延长所致的误差，建议用 8 道或 12 道加液器。
综上所述，改进的LDH释放法操作简便，敏感性、客观性、试剂成本及测定速度等均优于结晶紫染色法和MTT比色法。 参考文献
1 杜平主编.医用干扰素学.上海：上海微生物学会干扰素组，1985.172
2 肖成祖，李广善，张吟庵等.一种快速简便的人干扰素微量板染色测定法.中华微生物学和免疫学杂志，1985，5(3)：181
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3 尹纯德，金伯泉，黄传书等.应用MTT法测定干扰素的生物活性效价.上海免疫学杂志，1990，10(4)：247
4 Korzeniewski C, Callewaert DM. An enzyme-release assay for natral cytotoxicity. J Immu Meth, 1983,64:313
5 何金生，宗庭益.LDH释放法检测NK细胞活性的方法学研究.中国实验临床免疫学杂志，1996，8(2)：10
6 何金生，李少芬，宗庭益等.检测NK细胞活性的三种方法的比较分析.中国实验临床免疫学杂志，1997，9(2)：8
7 李秀森，刘晓丹，柯志勇等.MTT比色法在LAK和NK细胞毒活性检测中的应用.中国实验临床免疫学杂志，1997，9(6)：1
(1999—03—08收稿，1999—05—05修回), http://www.100md.com