抗凝血酶Ⅲ、纤溶酶原激活剂抑制剂-1在2型糖尿病肾病中的作用
作者：赵晓云 刘文淑 赵秀稳
单位：赵晓云(河北医科大学病理生理学教研室,050081)；刘文淑(河北医科大学第二医院内分泌科)；赵秀稳(电子工业部第54研究所职工医院内科)
关键词：2型糖尿病；糖尿病肾病；纤溶酶原灭活剂；抗凝血酶Ⅲ；白蛋白尿
山东医大基础医学院学报000204 摘要 目的:通过测定糖尿病肾病患者血中抗凝血酶(AT-Ⅲ)含量(AT-Ⅲ:Ag)、抗凝血酶活性(AT-Ⅲ:A)水平、纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)活性水平,并与正常人、糖尿病非肾病患者进行比较,分析研究与白蛋白排泄率(AER)的关系,以冀了解(1)AT-Ⅲ、PAI-1在糖尿病肾病中的状态,探讨它们在糖尿病肾病发病中的可能机理;(2)为临床预防和治疗糖尿病肾病提供理论依据和方法。方法:应用发色底物法测定血浆中PAI-1和AT-Ⅲ:A,应用免疫比浊法测定血清中AT-Ⅲ:Ag含量,应用放射免疫法测定AER。结果:(1)PAI-1、AT-Ⅲ:Ag、AG/A水平以糖尿病肾病组最高,依次为糖尿病非肾病组、对照组;AT-Ⅲ:A以对照组较高,糖尿病非肾病组次之,糖尿病肾病组水平最低;(2)相关性分析显示,糖尿病肾病组中PAI-1与AT-Ⅲ:A呈显著负相关,与Ag/A呈显著正相关,与AT-Ⅲ:Ag无相关,与AER呈显著正相关。AT-Ⅲ:Ag与AT-Ⅲ:A无相关,与Ag/A呈显著正相关。AT-Ⅲ:A与AER、Ag/A呈显著负相关。糖尿病非肾病组中PAI-1,AT-Ⅲ:A,AT-Ⅲ:Ag与Ag/A间的相关性同前。结论:(1)糖尿病存在着高凝、低纤溶状态,并发肾病时进一步加重;(2)AT-Ⅲ:A、PAI-1均与肾脏损害程度密切相关,二者互为关联,共同介导了糖尿病肾病的发生;(3)通过调节凝血、纤溶系统以达到新的动态平衡,有可能延缓或防止糖尿病肾病等微血管并发症的发生或发展。
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中图分类号 R 587.1
Evaluation of AT-Ⅲ,PAI-1 in diabetic nephropathy type 2
Zhao Xiaoyun
(Dept.of Physiology of Hebei Medical University,050081)
Liu Wenshu
(Dept.of Endocrinology of the Second Hospital of Hebei Medical University)
Zhao Xiuwen
(Dept.of Medicine,the Staff ＆.Workers′ Hospital of the 54th Institute of Electronics Industry Department)
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Abstract Objective:To investigate the relationship between PAI-1,AT-Ⅲ:A,AT-Ⅲ:Ag and AER to determine the state of these variations in DN and the effect with the onset and development of nephropathy;and to prevent and treat diabetic nephropathy,the plasma levels of PAI-1,AT-Ⅲ:A and the serum concentration of AT-Ⅲ:Ag,AER with diabetic nephropathy type 2 (DN) were measured,furthermore,compared with those in control subjects and diabetic patients without nephropathy.Methods:PAI-1 and AT-Ⅲ:A were measured by chromogenic substrate method,AT-Ⅲ:Ag was measured by immunity turbidimetry assay,AER was determined using radio-immunity assay.Results:(1)There were the highest levels of PAI-1 activity,AT-Ⅲ:Ag,Ag/A ratio,and the lowest level of AT-Ⅲ:A in DN group;the medium increase of the levels of PAI-1 activity,AT-Ⅲ:A,AT-Ⅲ:Ag,Ag/A ratio in diabetic patients without nephropathy group;the lowest levels of PAI-1 activity, AT-Ⅲ:Ag,Ag/A ratio and the highest level of AT-Ⅲ:A in control subjects.(2)Univarite regression analysis revealed that as follows.In DN group,PAI-1 was significantly negative with AT-Ⅲ:A,positive with Ag/A ratio and AER;AT-Ⅲ:Ag was not correlated with AT-Ⅲ:A and PAI-1 ,significantly positive with Ag/A ratio;AT-Ⅲ:A was significantly negative correlated with AER and Ag/A ratio,there was no correlation between AT-Ⅲ:Ag,Ag/A ratio and AER.In diabetic patients without nephropathy group,univarite regression analysis revealed that as former.Conclusions:(1)There is a hypercoagulable and hypofibri-nolysis state in diabetic mellitus patients,and this state tend to further serious in those with nephropathy.(2)Both of AT-Ⅲ:A and PAⅠ-1 are directly associated with renal damage.Furthermore,they affect each other,and take part in the occurrence and progress of DN together.(3)In some degree,the microvascular diabetic complications,such as nephropathy can be delayed or prevented,through regular the hemostatic and fibrinolysis imbalance.
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Key words Diabetic mellitus type 2;Diabetic nephropathies;Plasminogen inactivators;Antithrombin Ⅲ ;Albuminuria
2型糖尿病肾病(diabetic nephropathy type 2,DN)是糖尿病慢性微血管病变的并发症之一,是糖尿病致残和致死的重要原因,发病机理尚不清楚。目前,凝血、纤溶系统异常在糖尿病肾病发生中的作用日益受到重视。白蛋白尿被认为是诊断糖尿病肾病的主要指标。国内尚未见有关抗凝血酶Ⅲ与白蛋白尿之间关系的报道,国内、外亦未见糖尿病肾病中抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ,AT-Ⅲ )、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor type 1, PAI-1)关系的报道。我们分别测定了正常人、糖尿病无肾病者、糖尿病肾病者血中抗凝血酶Ⅲ抗原含量(antithrombin Ⅲ antigen,AT-Ⅲ:Ag)及抗凝血酶Ⅲ活性(antithrombin Ⅲ activity,AT-Ⅲ:A)水平、PAI-1活性水平,并分析它们在糖尿病肾病中与尿白蛋白排泄率(albumin excretion rate,AER)的关系,以冀了解AT-Ⅲ、PAI-1在糖尿病肾病中的变化,二者之间的相互关系。探讨凝血、纤溶系统机能失常对糖尿病肾病发生的可能机理,为临床诊治糖尿病肾病提供参考依据。
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1 资料与方法
1.1 病例选择 (1)患者均来自1998年9月1日至9月11日某研究所职工普查人群,其中筛选出2型糖尿病肾病(DN)40例(AER>15μg/min),男26例,女14例,53～76岁,平均61.3±6.2岁,病程3个月～30年,平均5.96±7.3年;2型糖尿病无肾病等并发症(DM)40例(AER<15μg/min),男25例,女15例;53～66岁,平均59.2±3.6岁,病程4个月～22年,平均5.64±4.68年。所有患者均符合WHO诊断标准[1]。对照组40例,男25例,女15例;35～77岁,平均61±8.5岁,除外肾脏病变。各观察组均无感染性疾病、血栓、出血、严重心脏、肝脏疾病,2周内未服阿斯匹林,潘生丁,消炎痛等影响凝血纤溶的中西药物;(2)3组的年龄、性别、病程、体重指数、血压、血胆固醇、甘油三酯经配伍并统计学处理后差异均无显著性(P>0.05),见表1。
1.2 标本制备 (1)血浆制备:收集空腹静脉血2ml,置于含有1/10体积抗凝液的硅化管中,3000r/min离心10min收集上清液,置于-20℃保存待测;(2)血清制备:收集空腹静脉血2ml,分离血清后-20℃保存待测;(3)尿样留取:留取糖尿病肾病和非肾病患者的24h尿液,加入含10ml甲苯的储存容器内,量取总量后,取2ml置-20℃保存待测。
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表1 3组患者的临床资料及生化指标(
±s)
对照组
糖尿病组
糖尿病肾病组
男/女(例)
年龄(岁)
病程(年)
体重指数(kg/m2)
血压(kPa)
胆固醇(mmol/L)
甘油三酯(mmol/L)
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25/15
61±8.5
0
22.27±3.31
15.90±2.39
4.17±1.20
1.93±1.00
25/15
59.2±3.6
5.64±5.4*
24.03±2.93*
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4.59±0.90*
1.68±0.93*
26/14
61.3±6.20
5.96±7.30*
26.82±3.47*
17.90±3.92*
4.54±0.86*
1.63±0.80*
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*P<0.05 vs对照组
1.3 观测指标 (1)应用免疫浊度法测定血清中AT-Ⅲ:Ag含量;(2)应用发色底物法测定血浆中AT-Ⅲ:A水平;(3)应用发色底物法测定PAI-1活性水平。以上指标测定由河北医科大学第二医院中心化验室协助完成。试剂盒由上海亚都生物技术公司提供;(4)应用放射免疫法测定白蛋白尿排泄率(AER)。
1.4 统计学处理 各组间PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:A、Ag/A的比较用成组设计的方差分析,然后再行两两比较的q检验;用直线相关和回归分析各组内PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:A、Ag/A间的相关性,糖尿病肾病组中PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:A、Ag/A与AER的相关性,数据均采用SPSS、Poems 统计软件包处理,图表经Excel电子表格处理。
2 结 果
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2.1 糖尿病肾病组、糖尿病非肾病组、对照组的PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:A、Ag/A水平比较 结果显示,PAI-1、AT-Ⅲ:Ag、Ag/A水平以糖尿病肾病组最高,依次为糖尿病非肾病组、对照组(P<0.01～0.05);AT-Ⅲ:A对照组较高,糖尿病非肾病组次之,糖尿病肾病组水平最低(P<0.01～0.05);见表2。
2.2 糖尿病非肾病组中PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:A、Ag/A间的相关性分析显示,PAI-1与AT-Ⅲ:A呈显著负相关,r=-0.5730,P<0.0001,与Ag/A呈显著正相关,r=0.3686,P<0.05,与AT-Ⅲ:Ag无相关。AT-Ⅲ:Ag与AT-Ⅲ:A呈轻度负相关,r=-0.2594,但无统计学差异,P>0.05,与Ag/A呈显著正相关,r=0.7896,P<0.0001,AT-Ⅲ:A与Ag/A呈显著负相关,r=-0.7622,P<0.0001。
表2 对照组、DM组、DN组间各指标均数的比较(±s) 组 别
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PAI-1(AU/ml)
AT-Ⅲ:Ag(mg/L)
AT-Ⅲ:A(%)
Ag/A(mg/L)
对照组
糖尿病组
糖尿病肾病组
0.48±0.116
0.58±0.14**
0.66±0.14**,△
280.15±78.37
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315.95±78.04*
326.22±80.48**,△
102.20±31.87
86.86±21.65**
78.05±17.34**,△
200±118
376±95**
426±100**,△
*P<0.05 **P<0.01 vs对照组 △P<0.05 vs糖尿病组
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2.3 糖尿病肾病组中PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:Ag/A间相关性分析 DN中PAI-1与AT-Ⅲ:A呈显著负相关,r=-0.4119,P<0.01,与Ag/A呈显著正相关,r=0.3984,P<0.05,与AT-Ⅲ:Ag无相关。AT-Ⅲ:Ag与AT-Ⅲ:A无相关,与Ag/A呈显著正相关,r=0.7345,P<0.0001。AT-Ⅲ:A与Ag/A呈显著负相关,r=0.5911,P<0.0001.
2.4 糖尿病肾病组中PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:Ag/A分别与AER的相关性分析 DN中PAI-1与AER呈显著正相关,r=0.4596,P=0.003。AT-Ⅲ:A与AER呈显著负相关,r=-0.3385,P=0.03。AT-Ⅲ:Ag、Ag/A与AER无相关。
3 讨 论
3.1 抗凝血酶Ⅲ与糖尿病肾病 抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)是一种多功能的丝氨酸蛋白酶抑制剂,有活性的AT-Ⅲ分子可通过其精氨酸反应中心与凝血酶的丝氨酸活性中心以1:1的比例结合,形成不具备凝血活性的复合物。除凝血酶外,AT-Ⅲ对凝血系统中几乎所有的丝氨酸蛋白酶都有抑制作用,如激活的凝血因子Ⅶa、Ⅸa、Ⅹa、Ⅺa、Ⅹ Ⅱ a及胰蛋白酶、纤溶蛋白酶、激肽释放酶、尿激酶等。AT-Ⅲ是血浆中主要的抗凝血物质,约占血浆总抗凝血活性的75%～80%,生理条件下血中AT-Ⅲ抗原含量(AT-Ⅲ:Ag)很低,仅为150mg/L,故AT-Ⅲ的含量和活性的改变可反映出体内凝血系统的高凝状态,当其生成减少或耗竭时,均可促进血栓形成。糖尿病肾病(DN)是糖尿病重要的以微血管病变为主的并发症之一,2型糖尿病发病率较高,其主要的病理变化包括肾小球基底膜肥厚、微血栓形成和血管内膜增殖等。微量白蛋白尿(microalbuminuria,MAU)是判断早期糖尿病肾病的重要和主要指标,作为其产生基础和背景之一,血液凝固和纤溶系统的机能异常对糖尿病肾病的发生和发展有着重要的影响。本研究结果显示,对照组AT-Ⅲ:A最高,依次为糖尿病非肾病组,糖尿病肾病组最低;AT-Ⅲ:Ag以糖尿病肾病组较高,其次为糖尿病非肾病组,对照组最低。推测其原因可能是(1)在糖尿病时即存在着凝血系统的激活和抗凝血酶的消耗。有学者[2]认为,AT-Ⅲ抗原与活性比值(Ag/A)增高可反应凝血激活情况。本资料中糖尿病组Ag/A比值显著增高,糖尿病肾病组此比值进一步升高,提示发生肾病时,凝血激活更明显,AT-Ⅲ被继续消耗,AT-Ⅲ:A进一步降低,二者结果一致;(2)除抗凝血酶消耗外,个体间AT-Ⅲ代偿能力不同,即部分血小板功能亢进,这有助于微血管病变的形成,出现肾脏病变。本资料中,AER与AT-Ⅲ:A呈显著负相关,而与AT-Ⅲ:Ag无相关,证实AT-Ⅲ:A异常参与了糖尿病肾病的发生,而AER与Ag/A比值无相关,提示AT-Ⅲ:A水平降低是导致肾病的重要因素,而非唯一因素。Avellone[3]每日为糖尿病伴微血管病变者皮下注射1250U肝素,连续10d后测定其凝血功能,显示AT-Ⅲ:A水平明显升高,改善了高凝血状态,延缓了微血管并发症的进程,进一步证实AT-Ⅲ:A降低是肾病发生的重要原因,为临床提供了防治糖尿病肾病的重要途径。
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3.2 PAI-1与糖尿病肾病 PAI-1能快速作用于组织型纤溶酶原激活剂(tissuetype plasminogen activator,tPA),并与之形成1:1分子比的复合物,从而使tPA快速灭活。生理情况下机体通过纤溶活性清除体内形成的纤维蛋白,但又通过抗纤溶使血液中的纤溶酶不至处于过高状态,从而使纤溶和抗纤溶处于动态平衡。近年,学者们逐渐认识到,PAI-1是决定血管病变发展的重要因素[4]。PAI-1作用增加或tPA作用降低,或者二者均存在时,局部纤溶减弱,降低了排除血管内纤维蛋白的功能,易造成血管狭窄闭塞,使血流灌注不足,血管壁出现小的缺血区域,导致继发性血栓形成,引起并加重血管内皮损伤。血浆中PAI活性主要通过PAI-1表现,直接评估血浆中PAI-1水平变化可反映纤溶系统的功能状态。文献指出[5],糖尿病肾病可出现纤溶系统功能的变化,即低纤溶状态,主要系PAI-1活性增高所致,且这一变化在患者的尿微量白蛋白稍增高时即可发生,但纤溶异常在糖尿病肾病发病中的确切机制尚不清楚。高甘油三酯血症和胰岛素抵抗可能是导致PAI-1升高的主要原因,而与肥胖和体重指数关系不大,高胰岛素血症可刺激肝细胞合成PAI-1增多。Hirano[6]等则持不同的观点,指出临床肾病中血浆PAI-1水平明显高于早期肾病和无肾病的糖尿病患者,但后两组间无差异。临床肾病中AER的对数值与PAI-1、甘油三酯均呈明显正相关,PAI-1与甘油三酯亦呈正相关,空腹血糖、糖化血红蛋白 、血压与PAI-1均无相关性,以AER的对数值为自变量进行多元回归分析时,PAI-1与甘油三酯的相关性不复存在,表明糖尿病肾病时,PAI-1的增加不仅是由于甘油三酯的升高,也可能是因胰岛素抵抗进一步加重共同引起,提示PAI-1水平与肾脏损害程度直接相关,凝血系统失衡介导了糖尿病肾病的发生,而胰岛素抵抗则广泛调节着凝血因子的变化,不仅限于糖尿病肾病时[6]。我们在配比了各组体重指数、血胆固醇、甘油三酯水平的情况下,糖尿病非肾病组PAI-1活性水平增高,而在糖尿病肾病组其水平进一步升高,说明胰岛素抵抗与肾病时伴有的微血管内皮结构和功能受损是导致PAI-1水平升高的主要原因,高胰岛素血症可刺激肝细胞合成PAI-1增多,除了内皮下层血管内皮细胞合成分泌外,在内皮下层储存亦较多,内皮细胞的损害使内皮下层暴露,PAI-1释放增多。因此,在胰岛素抵抗综合征中出现纤溶系统活性降低也就可以理解了。
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3.3 AT-Ⅲ与PAI-1在糖尿病肾病中的共同作用 如前所述,肾病时AT-Ⅲ:A进一步降低,PAI-1活性进一步升高,表明存在着严重的凝血、纤溶系统失常,PAI-1作用增加,局部纤溶活性受抑,诱发血栓形成,凝血酶或其他促凝血蛋白混杂在血栓内,以及血小板相关生长因子β和表皮生长因子均刺激PAI-1的合成,增加了AT-Ⅲ的消耗,进而促使血栓范围扩大,同时使巨噬细胞激活,趋化性增加,增加了血管平滑肌细胞的移行和增殖,同时活化的巨噬细胞释放一些细胞因子—肿瘤坏死因子和白细胞介素-1等,它们可在血管内皮细胞通过抑制tPA mRNA的表达而诱导产生PAI-1;从而引起和加重了血管损伤和内皮细胞增殖。在肾脏则出现肾小球毛细血管循环障碍、微血栓形成、肾小球滤过率降低,进一步引起肾小球基底膜变性、水肿,通透性增高,肾小球毛细血管增殖,AT-Ⅲ进一步降低,最终发展为肾病。本结果显示AT-Ⅲ:A与AER呈显著负相关,与PAI-1呈显著正相关,而后者又与AER呈显著正相关,同样证实AT-Ⅲ:A与PAI-1互为关联,相互作用,共同介导了肾病的发生。Nordt[7]认为,通过锻炼、减肥等可调节胰岛素的敏感性和血胰岛素水平,降低血浆中PAI-1水平。饮食控制、减肥、增加体育锻炼等,以及应用药物,如(1)二甲双胍可以提高胰岛素的敏感性,减轻胰岛素抵抗,降低PAI-1水平;(2)肝素[8]、蝮蛇抗栓酶-3(Svate-3)[9]可调节凝血、纤溶系统,降低PAI-1水平,提高抗凝血酶Ⅲ和tPA水平,达到改善血液流变学异常的目的,使体内凝血、纤溶系统达到新的平衡,以减少血栓形成和血管内皮损伤,从而延缓肾病的发生和进展。
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综上所述,(1)糖尿病存在着高凝、低纤溶状态,并发肾病时进一步加重;(2)AT-Ⅲ:A、PAI-1均与肾脏损害程度密切相关,二者互为关联,共同介导了糖尿病肾病的发生;(3)通过调节凝血、纤溶系统以达到新的动态平衡,有可能延缓或防止糖尿病肾病等微血管并发症的发生或发展。
作者简介：赵晓云(1967—)女,山东莒县人, 河北医科大学医学博士,主要从事糖尿病肾病的研究。
参考文献
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2，胡俊斌,张金枝,宋善俊,等.冠心病患者AT-Ⅲ抗原与活性比值的变化.临床心血管杂志,1995,11:151
3，Avellon G,Vincenzo Di Garbo,Rosamaria Cordova,et al.Effects of heparin treatment on hemostatic abnormalities in obese non-insulin-dependent diabetic patients.Metabolism,1997,46(8):930-934
, 百拇医药
4，Collen D,Juhan Vague Ⅰ.Fibrinolysis and atherosclerosis.Semin Thromb Hemost,1988,14:180-183
5，张钟琪,王亚平,刘持善,等.糖尿病肾病纤溶系统功能的变化.医师进修杂志,1996,19(12):22-23
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8，Gino Avellon,Vincenzo Di Garbo,Rosamaria Cordova,et al.Effects of heparin treatment on hemostatic abnormalities in obese non-insulin-dependent diabetic patients.Metabolism,1997,46(8):930-934
9，陈春燕,张茂宏,徐从高,等.Svate-3对糖尿病高凝状态的疗效探讨.山东医科大学学报,1996,24(3):216-218
(收稿日期 1999-10-18), 百拇医药
单位：赵晓云(河北医科大学病理生理学教研室,050081)；刘文淑(河北医科大学第二医院内分泌科)；赵秀稳(电子工业部第54研究所职工医院内科)
关键词：2型糖尿病；糖尿病肾病；纤溶酶原灭活剂；抗凝血酶Ⅲ；白蛋白尿
山东医大基础医学院学报000204 摘要 目的:通过测定糖尿病肾病患者血中抗凝血酶(AT-Ⅲ)含量(AT-Ⅲ:Ag)、抗凝血酶活性(AT-Ⅲ:A)水平、纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)活性水平,并与正常人、糖尿病非肾病患者进行比较,分析研究与白蛋白排泄率(AER)的关系,以冀了解(1)AT-Ⅲ、PAI-1在糖尿病肾病中的状态,探讨它们在糖尿病肾病发病中的可能机理;(2)为临床预防和治疗糖尿病肾病提供理论依据和方法。方法:应用发色底物法测定血浆中PAI-1和AT-Ⅲ:A,应用免疫比浊法测定血清中AT-Ⅲ:Ag含量,应用放射免疫法测定AER。结果:(1)PAI-1、AT-Ⅲ:Ag、AG/A水平以糖尿病肾病组最高,依次为糖尿病非肾病组、对照组;AT-Ⅲ:A以对照组较高,糖尿病非肾病组次之,糖尿病肾病组水平最低;(2)相关性分析显示,糖尿病肾病组中PAI-1与AT-Ⅲ:A呈显著负相关,与Ag/A呈显著正相关,与AT-Ⅲ:Ag无相关,与AER呈显著正相关。AT-Ⅲ:Ag与AT-Ⅲ:A无相关,与Ag/A呈显著正相关。AT-Ⅲ:A与AER、Ag/A呈显著负相关。糖尿病非肾病组中PAI-1,AT-Ⅲ:A,AT-Ⅲ:Ag与Ag/A间的相关性同前。结论:(1)糖尿病存在着高凝、低纤溶状态,并发肾病时进一步加重;(2)AT-Ⅲ:A、PAI-1均与肾脏损害程度密切相关,二者互为关联,共同介导了糖尿病肾病的发生;(3)通过调节凝血、纤溶系统以达到新的动态平衡,有可能延缓或防止糖尿病肾病等微血管并发症的发生或发展。
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中图分类号 R 587.1
Evaluation of AT-Ⅲ,PAI-1 in diabetic nephropathy type 2
Zhao Xiaoyun
(Dept.of Physiology of Hebei Medical University,050081)
Liu Wenshu
(Dept.of Endocrinology of the Second Hospital of Hebei Medical University)
Zhao Xiuwen
(Dept.of Medicine,the Staff ＆.Workers′ Hospital of the 54th Institute of Electronics Industry Department)
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Abstract Objective:To investigate the relationship between PAI-1,AT-Ⅲ:A,AT-Ⅲ:Ag and AER to determine the state of these variations in DN and the effect with the onset and development of nephropathy;and to prevent and treat diabetic nephropathy,the plasma levels of PAI-1,AT-Ⅲ:A and the serum concentration of AT-Ⅲ:Ag,AER with diabetic nephropathy type 2 (DN) were measured,furthermore,compared with those in control subjects and diabetic patients without nephropathy.Methods:PAI-1 and AT-Ⅲ:A were measured by chromogenic substrate method,AT-Ⅲ:Ag was measured by immunity turbidimetry assay,AER was determined using radio-immunity assay.Results:(1)There were the highest levels of PAI-1 activity,AT-Ⅲ:Ag,Ag/A ratio,and the lowest level of AT-Ⅲ:A in DN group;the medium increase of the levels of PAI-1 activity,AT-Ⅲ:A,AT-Ⅲ:Ag,Ag/A ratio in diabetic patients without nephropathy group;the lowest levels of PAI-1 activity, AT-Ⅲ:Ag,Ag/A ratio and the highest level of AT-Ⅲ:A in control subjects.(2)Univarite regression analysis revealed that as follows.In DN group,PAI-1 was significantly negative with AT-Ⅲ:A,positive with Ag/A ratio and AER;AT-Ⅲ:Ag was not correlated with AT-Ⅲ:A and PAI-1 ,significantly positive with Ag/A ratio;AT-Ⅲ:A was significantly negative correlated with AER and Ag/A ratio,there was no correlation between AT-Ⅲ:Ag,Ag/A ratio and AER.In diabetic patients without nephropathy group,univarite regression analysis revealed that as former.Conclusions:(1)There is a hypercoagulable and hypofibri-nolysis state in diabetic mellitus patients,and this state tend to further serious in those with nephropathy.(2)Both of AT-Ⅲ:A and PAⅠ-1 are directly associated with renal damage.Furthermore,they affect each other,and take part in the occurrence and progress of DN together.(3)In some degree,the microvascular diabetic complications,such as nephropathy can be delayed or prevented,through regular the hemostatic and fibrinolysis imbalance.
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Key words Diabetic mellitus type 2;Diabetic nephropathies;Plasminogen inactivators;Antithrombin Ⅲ ;Albuminuria
2型糖尿病肾病(diabetic nephropathy type 2,DN)是糖尿病慢性微血管病变的并发症之一,是糖尿病致残和致死的重要原因,发病机理尚不清楚。目前,凝血、纤溶系统异常在糖尿病肾病发生中的作用日益受到重视。白蛋白尿被认为是诊断糖尿病肾病的主要指标。国内尚未见有关抗凝血酶Ⅲ与白蛋白尿之间关系的报道,国内、外亦未见糖尿病肾病中抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ,AT-Ⅲ )、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor type 1, PAI-1)关系的报道。我们分别测定了正常人、糖尿病无肾病者、糖尿病肾病者血中抗凝血酶Ⅲ抗原含量(antithrombin Ⅲ antigen,AT-Ⅲ:Ag)及抗凝血酶Ⅲ活性(antithrombin Ⅲ activity,AT-Ⅲ:A)水平、PAI-1活性水平,并分析它们在糖尿病肾病中与尿白蛋白排泄率(albumin excretion rate,AER)的关系,以冀了解AT-Ⅲ、PAI-1在糖尿病肾病中的变化,二者之间的相互关系。探讨凝血、纤溶系统机能失常对糖尿病肾病发生的可能机理,为临床诊治糖尿病肾病提供参考依据。
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1 资料与方法
1.1 病例选择 (1)患者均来自1998年9月1日至9月11日某研究所职工普查人群,其中筛选出2型糖尿病肾病(DN)40例(AER>15μg/min),男26例,女14例,53～76岁,平均61.3±6.2岁,病程3个月～30年,平均5.96±7.3年;2型糖尿病无肾病等并发症(DM)40例(AER<15μg/min),男25例,女15例;53～66岁,平均59.2±3.6岁,病程4个月～22年,平均5.64±4.68年。所有患者均符合WHO诊断标准[1]。对照组40例,男25例,女15例;35～77岁,平均61±8.5岁,除外肾脏病变。各观察组均无感染性疾病、血栓、出血、严重心脏、肝脏疾病,2周内未服阿斯匹林,潘生丁,消炎痛等影响凝血纤溶的中西药物;(2)3组的年龄、性别、病程、体重指数、血压、血胆固醇、甘油三酯经配伍并统计学处理后差异均无显著性(P>0.05),见表1。
1.2 标本制备 (1)血浆制备:收集空腹静脉血2ml,置于含有1/10体积抗凝液的硅化管中,3000r/min离心10min收集上清液,置于-20℃保存待测;(2)血清制备:收集空腹静脉血2ml,分离血清后-20℃保存待测;(3)尿样留取:留取糖尿病肾病和非肾病患者的24h尿液,加入含10ml甲苯的储存容器内,量取总量后,取2ml置-20℃保存待测。
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表1 3组患者的临床资料及生化指标(
±s)对照组
糖尿病组
糖尿病肾病组
男/女(例)
年龄(岁)
病程(年)
体重指数(kg/m2)
血压(kPa)
胆固醇(mmol/L)
甘油三酯(mmol/L)
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25/15
61±8.5
0
22.27±3.31
15.90±2.39
4.17±1.20
1.93±1.00
25/15
59.2±3.6
5.64±5.4*
24.03±2.93*
, http://www.100md.com 16.60±2.06*
4.59±0.90*
1.68±0.93*
26/14
61.3±6.20
5.96±7.30*
26.82±3.47*
17.90±3.92*
4.54±0.86*
1.63±0.80*
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*P<0.05 vs对照组
1.3 观测指标 (1)应用免疫浊度法测定血清中AT-Ⅲ:Ag含量;(2)应用发色底物法测定血浆中AT-Ⅲ:A水平;(3)应用发色底物法测定PAI-1活性水平。以上指标测定由河北医科大学第二医院中心化验室协助完成。试剂盒由上海亚都生物技术公司提供;(4)应用放射免疫法测定白蛋白尿排泄率(AER)。
1.4 统计学处理 各组间PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:A、Ag/A的比较用成组设计的方差分析,然后再行两两比较的q检验;用直线相关和回归分析各组内PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:A、Ag/A间的相关性,糖尿病肾病组中PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:A、Ag/A与AER的相关性,数据均采用SPSS、Poems 统计软件包处理,图表经Excel电子表格处理。
2 结 果
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2.1 糖尿病肾病组、糖尿病非肾病组、对照组的PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:A、Ag/A水平比较 结果显示,PAI-1、AT-Ⅲ:Ag、Ag/A水平以糖尿病肾病组最高,依次为糖尿病非肾病组、对照组(P<0.01～0.05);AT-Ⅲ:A对照组较高,糖尿病非肾病组次之,糖尿病肾病组水平最低(P<0.01～0.05);见表2。
2.2 糖尿病非肾病组中PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:A、Ag/A间的相关性分析显示,PAI-1与AT-Ⅲ:A呈显著负相关,r=-0.5730,P<0.0001,与Ag/A呈显著正相关,r=0.3686,P<0.05,与AT-Ⅲ:Ag无相关。AT-Ⅲ:Ag与AT-Ⅲ:A呈轻度负相关,r=-0.2594,但无统计学差异,P>0.05,与Ag/A呈显著正相关,r=0.7896,P<0.0001,AT-Ⅲ:A与Ag/A呈显著负相关,r=-0.7622,P<0.0001。
表2 对照组、DM组、DN组间各指标均数的比较(
±s) 组 别, http://www.100md.com
PAI-1(AU/ml)
AT-Ⅲ:Ag(mg/L)
AT-Ⅲ:A(%)
Ag/A(mg/L)
对照组
糖尿病组
糖尿病肾病组
0.48±0.116
0.58±0.14**
0.66±0.14**,△
280.15±78.37
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315.95±78.04*
326.22±80.48**,△
102.20±31.87
86.86±21.65**
78.05±17.34**,△
200±118
376±95**
426±100**,△
*P<0.05 **P<0.01 vs对照组 △P<0.05 vs糖尿病组
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2.3 糖尿病肾病组中PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:Ag/A间相关性分析 DN中PAI-1与AT-Ⅲ:A呈显著负相关,r=-0.4119,P<0.01,与Ag/A呈显著正相关,r=0.3984,P<0.05,与AT-Ⅲ:Ag无相关。AT-Ⅲ:Ag与AT-Ⅲ:A无相关,与Ag/A呈显著正相关,r=0.7345,P<0.0001。AT-Ⅲ:A与Ag/A呈显著负相关,r=0.5911,P<0.0001.
2.4 糖尿病肾病组中PAI-1、AT-Ⅲ:Ag及AT-Ⅲ:Ag/A分别与AER的相关性分析 DN中PAI-1与AER呈显著正相关,r=0.4596,P=0.003。AT-Ⅲ:A与AER呈显著负相关,r=-0.3385,P=0.03。AT-Ⅲ:Ag、Ag/A与AER无相关。
3 讨 论
3.1 抗凝血酶Ⅲ与糖尿病肾病 抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)是一种多功能的丝氨酸蛋白酶抑制剂,有活性的AT-Ⅲ分子可通过其精氨酸反应中心与凝血酶的丝氨酸活性中心以1:1的比例结合,形成不具备凝血活性的复合物。除凝血酶外,AT-Ⅲ对凝血系统中几乎所有的丝氨酸蛋白酶都有抑制作用,如激活的凝血因子Ⅶa、Ⅸa、Ⅹa、Ⅺa、Ⅹ Ⅱ a及胰蛋白酶、纤溶蛋白酶、激肽释放酶、尿激酶等。AT-Ⅲ是血浆中主要的抗凝血物质,约占血浆总抗凝血活性的75%～80%,生理条件下血中AT-Ⅲ抗原含量(AT-Ⅲ:Ag)很低,仅为150mg/L,故AT-Ⅲ的含量和活性的改变可反映出体内凝血系统的高凝状态,当其生成减少或耗竭时,均可促进血栓形成。糖尿病肾病(DN)是糖尿病重要的以微血管病变为主的并发症之一,2型糖尿病发病率较高,其主要的病理变化包括肾小球基底膜肥厚、微血栓形成和血管内膜增殖等。微量白蛋白尿(microalbuminuria,MAU)是判断早期糖尿病肾病的重要和主要指标,作为其产生基础和背景之一,血液凝固和纤溶系统的机能异常对糖尿病肾病的发生和发展有着重要的影响。本研究结果显示,对照组AT-Ⅲ:A最高,依次为糖尿病非肾病组,糖尿病肾病组最低;AT-Ⅲ:Ag以糖尿病肾病组较高,其次为糖尿病非肾病组,对照组最低。推测其原因可能是(1)在糖尿病时即存在着凝血系统的激活和抗凝血酶的消耗。有学者[2]认为,AT-Ⅲ抗原与活性比值(Ag/A)增高可反应凝血激活情况。本资料中糖尿病组Ag/A比值显著增高,糖尿病肾病组此比值进一步升高,提示发生肾病时,凝血激活更明显,AT-Ⅲ被继续消耗,AT-Ⅲ:A进一步降低,二者结果一致;(2)除抗凝血酶消耗外,个体间AT-Ⅲ代偿能力不同,即部分血小板功能亢进,这有助于微血管病变的形成,出现肾脏病变。本资料中,AER与AT-Ⅲ:A呈显著负相关,而与AT-Ⅲ:Ag无相关,证实AT-Ⅲ:A异常参与了糖尿病肾病的发生,而AER与Ag/A比值无相关,提示AT-Ⅲ:A水平降低是导致肾病的重要因素,而非唯一因素。Avellone[3]每日为糖尿病伴微血管病变者皮下注射1250U肝素,连续10d后测定其凝血功能,显示AT-Ⅲ:A水平明显升高,改善了高凝血状态,延缓了微血管并发症的进程,进一步证实AT-Ⅲ:A降低是肾病发生的重要原因,为临床提供了防治糖尿病肾病的重要途径。
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3.2 PAI-1与糖尿病肾病 PAI-1能快速作用于组织型纤溶酶原激活剂(tissuetype plasminogen activator,tPA),并与之形成1:1分子比的复合物,从而使tPA快速灭活。生理情况下机体通过纤溶活性清除体内形成的纤维蛋白,但又通过抗纤溶使血液中的纤溶酶不至处于过高状态,从而使纤溶和抗纤溶处于动态平衡。近年,学者们逐渐认识到,PAI-1是决定血管病变发展的重要因素[4]。PAI-1作用增加或tPA作用降低,或者二者均存在时,局部纤溶减弱,降低了排除血管内纤维蛋白的功能,易造成血管狭窄闭塞,使血流灌注不足,血管壁出现小的缺血区域,导致继发性血栓形成,引起并加重血管内皮损伤。血浆中PAI活性主要通过PAI-1表现,直接评估血浆中PAI-1水平变化可反映纤溶系统的功能状态。文献指出[5],糖尿病肾病可出现纤溶系统功能的变化,即低纤溶状态,主要系PAI-1活性增高所致,且这一变化在患者的尿微量白蛋白稍增高时即可发生,但纤溶异常在糖尿病肾病发病中的确切机制尚不清楚。高甘油三酯血症和胰岛素抵抗可能是导致PAI-1升高的主要原因,而与肥胖和体重指数关系不大,高胰岛素血症可刺激肝细胞合成PAI-1增多。Hirano[6]等则持不同的观点,指出临床肾病中血浆PAI-1水平明显高于早期肾病和无肾病的糖尿病患者,但后两组间无差异。临床肾病中AER的对数值与PAI-1、甘油三酯均呈明显正相关,PAI-1与甘油三酯亦呈正相关,空腹血糖、糖化血红蛋白 、血压与PAI-1均无相关性,以AER的对数值为自变量进行多元回归分析时,PAI-1与甘油三酯的相关性不复存在,表明糖尿病肾病时,PAI-1的增加不仅是由于甘油三酯的升高,也可能是因胰岛素抵抗进一步加重共同引起,提示PAI-1水平与肾脏损害程度直接相关,凝血系统失衡介导了糖尿病肾病的发生,而胰岛素抵抗则广泛调节着凝血因子的变化,不仅限于糖尿病肾病时[6]。我们在配比了各组体重指数、血胆固醇、甘油三酯水平的情况下,糖尿病非肾病组PAI-1活性水平增高,而在糖尿病肾病组其水平进一步升高,说明胰岛素抵抗与肾病时伴有的微血管内皮结构和功能受损是导致PAI-1水平升高的主要原因,高胰岛素血症可刺激肝细胞合成PAI-1增多,除了内皮下层血管内皮细胞合成分泌外,在内皮下层储存亦较多,内皮细胞的损害使内皮下层暴露,PAI-1释放增多。因此,在胰岛素抵抗综合征中出现纤溶系统活性降低也就可以理解了。
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3.3 AT-Ⅲ与PAI-1在糖尿病肾病中的共同作用 如前所述,肾病时AT-Ⅲ:A进一步降低,PAI-1活性进一步升高,表明存在着严重的凝血、纤溶系统失常,PAI-1作用增加,局部纤溶活性受抑,诱发血栓形成,凝血酶或其他促凝血蛋白混杂在血栓内,以及血小板相关生长因子β和表皮生长因子均刺激PAI-1的合成,增加了AT-Ⅲ的消耗,进而促使血栓范围扩大,同时使巨噬细胞激活,趋化性增加,增加了血管平滑肌细胞的移行和增殖,同时活化的巨噬细胞释放一些细胞因子—肿瘤坏死因子和白细胞介素-1等,它们可在血管内皮细胞通过抑制tPA mRNA的表达而诱导产生PAI-1;从而引起和加重了血管损伤和内皮细胞增殖。在肾脏则出现肾小球毛细血管循环障碍、微血栓形成、肾小球滤过率降低,进一步引起肾小球基底膜变性、水肿,通透性增高,肾小球毛细血管增殖,AT-Ⅲ进一步降低,最终发展为肾病。本结果显示AT-Ⅲ:A与AER呈显著负相关,与PAI-1呈显著正相关,而后者又与AER呈显著正相关,同样证实AT-Ⅲ:A与PAI-1互为关联,相互作用,共同介导了肾病的发生。Nordt[7]认为,通过锻炼、减肥等可调节胰岛素的敏感性和血胰岛素水平,降低血浆中PAI-1水平。饮食控制、减肥、增加体育锻炼等,以及应用药物,如(1)二甲双胍可以提高胰岛素的敏感性,减轻胰岛素抵抗,降低PAI-1水平;(2)肝素[8]、蝮蛇抗栓酶-3(Svate-3)[9]可调节凝血、纤溶系统,降低PAI-1水平,提高抗凝血酶Ⅲ和tPA水平,达到改善血液流变学异常的目的,使体内凝血、纤溶系统达到新的平衡,以减少血栓形成和血管内皮损伤,从而延缓肾病的发生和进展。
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综上所述,(1)糖尿病存在着高凝、低纤溶状态,并发肾病时进一步加重;(2)AT-Ⅲ:A、PAI-1均与肾脏损害程度密切相关,二者互为关联,共同介导了糖尿病肾病的发生;(3)通过调节凝血、纤溶系统以达到新的动态平衡,有可能延缓或防止糖尿病肾病等微血管并发症的发生或发展。
作者简介：赵晓云(1967—)女,山东莒县人, 河北医科大学医学博士,主要从事糖尿病肾病的研究。
参考文献
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7，Nordt DK,Klassen KJ,Schneider DJ,et al.Augmentation of synthesis of plasminogen activator inhibitor type-1 in arterial endothelial cells by glucose and its implications for local fibrinolysis.Arterio Scler Thromb,1993,13:1822-1828
8，Gino Avellon,Vincenzo Di Garbo,Rosamaria Cordova,et al.Effects of heparin treatment on hemostatic abnormalities in obese non-insulin-dependent diabetic patients.Metabolism,1997,46(8):930-934
9，陈春燕,张茂宏,徐从高,等.Svate-3对糖尿病高凝状态的疗效探讨.山东医科大学学报,1996,24(3):216-218
(收稿日期 1999-10-18), 百拇医药