牛磺酸防止白内障形成的组织化学研究
作者：闫洪禄 王琇
单位：闫洪禄(青岛市立医院眼科,266011)；王琇(青岛市立医院眼科,266011)
关键词：牛磺酸；晶体；白内障；组织化学
山东医大基础医学院学报000201 摘要 目的:研究牛磺酸对晶体氧化损伤的保护作用。方法:将正常兔晶体分为正常条件培养组(对照组),Feton模型组(氧化损伤组),氧化损伤同时给0.5%和1%牛磺酸保护组。体外培养24h后,检测各组晶体的总抗氧化能力(T-AOC)水平,可溶性蛋白(sol-prot)含量,超氧化歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)及谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,以及脂质过氧化反应产物丙二醛(MDA)含量。结果:和对照组比较,Feton模型组晶体T-AOC水平,SOD、CAT和GSH-PX活性,slo-prot含量明显降低,MDA含量明显升高;和Feton模型组相比,牛磺酸保护组晶体T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX、sol-prot明显升高,MDA明显下降,以1%牛磺酸组最为明显。结论:牛磺酸有保护体外培养的兔晶体免受氧化损伤,抑制其脂质过氧化的作用。
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中图分类号 R 776.1
A histochemical study on the prevention of cataract with taurine
Yan Honglu Wang Xiu
(Dept.of Ophthalmology,Qingdao Municiple Hospital,266011)
Abstract Objective:To evaluate the effect of taurine on protecting lens from oxidative stress.Methods:Rabbits′ lenses cultured in vitro were divided into 4 groups:control group,Feton model(oxidative stress group),the Feton model treated with 0.5% taurine and the Feton model with 1% taurine.The levels of lens′ T-AOC,sol-prot,SOD,CAT,GSH-PX and MDA were tested after incubation for 24h.Results:The levels of lens′ T-AOC,sol-prot,SOD,CAT,GSH-PX were significantly decreased in Feton model group compared with control group,and were significantly increased in the groups treated with 0.5% and 1% taurine compared with Feton model group,and were significantly increased in 1% taurine group compared with 0.5% taurine group.The level of lens′ MDA was significantly increased in Feton model group compared with control group,and markedly decreased in 0.5% and 1% taurine groups,especially in the 1% taurine group.Conclusion:Taurine can protect lens from oxidative stress in vitro.
, 百拇医药
Key words Taurine;Lens,crystalline;Cataract;Histochemistry
白内障形成的自由基氧化损伤机理已为眼科医师所熟知,牛磺酸作为组织中的重要抗氧化物质,也被研究所证实,但它在晶体内的抗氧化及维持晶体正常代谢,防止白内障形成的作用机理,尚缺乏系统研究。我们利用体外培养技术,通过酶组织化学研究,对牛磺酸的抗晶体氧化损伤作用做了进一步探讨。
1 材料与方法
1.1 试剂 199培养基系美国Hyclone公司产;牛磺酸系上海生化试剂厂产; T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX、sol-prot、MDA试剂盒均系南京建成生物工程研究所产。
1.2 实验动物 健康家兔30只由青岛大学医学院动物实验中心提供,体重2.0～2.5kg,雌雄不限。实验前行裂隙灯检查,排除先天性白内障及其他异常。
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1.3 晶体培养及实验分组 气栓处死动物后,立即摘取眼球,置于含500U/ml青霉素的生理盐水中冲洗,然后在无菌无损伤条件下取出晶体,置入下列不同条件培养液的6孔培养板中。
(1)对照组:199培养液10ml,内含青霉素100U/ml,链霉素0.1mg/ml。
(2)Feton模型组:除199培养液10ml外,另加30% HO 0.2ml,FeCl 2mg,形成氧化损伤的条件。
(3)0.5% 牛磺酸组:除Feton模型组各成分外,另加牛磺酸0.05g。
(4)1% 牛磺酸组:除Feton模型组各成分外,另加牛磺酸0.1g。
在37℃、湿度95%、含5%CO2的培养箱内培养24h后,取出行组织化学检查。
, 百拇医药
1.4 组织化学检查 将各组晶体从培养液中用圈匙托出,在0.85%氯化钠内漂洗后,加入pH值7.2的PBS液,冰浴下匀浆5min,制成10%匀浆,以10 000r/min4℃离心10min,取出上清液,测定各晶体的SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC、MDA和sol-prot含量。将各组晶体各项指标的均值行组间t检验。
2 结 果
2.1 牛磺酸对晶体总抗氧化能力(T-AOC)的影响 晶体的T-AOC包括酶促和非酶促两个系统,前者包括SOD、CAT、GDH-PX等;后者包括维生素、氨基酸、含金属蛋白等。不同条件下培养24h后各组晶体T-AOC的检测结果见表1。
表1 培养24h后各组晶体T-AOC检测结果 组 别
n
T-AOC水平(U/ml)
, 百拇医药
对照组
Feton模型组
0.5%牛磺酸组
1%牛磺酸组
12
12
12
12
4.4018±1.2506
0.7072±0.2054
3.1034±0.7818
4.3216±0.7991
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由表1可见,Feton 模型组T-AOC水平明显低于对照组(P<0.001),0.5%和1%牛磺酸组T-AOC明显高于Feton模型组(P<0.001);但二者与对照组相比,前者差异有显著性(P<0.01),后者差异无显著性(P>0.05)。
2.2 牛磺酸对晶体抗氧化酶活性的影响 见表2。表2 各组晶体SOD、CAT、GSH-PX检测结果 组 别
n
SOD(μU/ml)
CAT(U/ml)
GSH-PX(U/ml)
对照组
Feton模型组
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0.5%牛磺酸组
1%牛磺酸组
12
12
12
12
107.6011±8.3897
33.2507±11.5006
46.9032±13.6287
64.6714±12.5488
5.5187±0.4520
1.7954±0.3700
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1.9647±0.1902
2.4616±0.2307
119.4257±44.2386
47.1283±14.5435
60.4730±6.1015
84.6284±10.7651
由表2可见,Feton模型组3种抗氧化酶活性均明显低于正常对照组(P<0.001)。1%牛磺酸组和Feton模型组相比,3种酶活性均显著增强(P<0.001);0.5%牛磺酸组与Feton模型组相比,SOD和GSH-PX检测值差异有高度显著性(P<0.001),CAT检测值差异有显著性(P<0.05)。0.5%牛磺酸组与1%浓度组相比,3种酶活性差异有高度显著性(P<0.001)。
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2.3 对晶体丙二醛(MDA)含量的影响 见表3。表3 各组晶体MDA含量测定结果 组 别
n
MDA(nmol/ml)
对照组
Feton模型组
0.5%牛磺酸组
1%牛磺酸组
12
12
12
12
1.6580±0.2552
, http://www.100md.com
3.3199±0.5648
2.0905±0.3298
1.7048±0.2173
由表3可见,Feton模型组MDA含量显著高于正常对照组(P<0.001)。0.5%和1%牛磺酸组显著低于Feton模型组(P<0.001)。但前者所测数值仍显著高于正常对照组(P<0.01),后者则无统计学意义(P>0.05)。
2.4 牛磺酸对晶体蛋白成分的影响 见表4。表4 不同培养条件下各组晶体可溶性蛋白的含量 组 别
n
sol-prot(mg/ml)
对照组
, 百拇医药
Feton模型组
0.5%牛磺酸组
1%牛磺酸组
12
12
12
12
18.1781±0.9268
4.6895±0.7974
5.9886±0.6442
8.6520±0.8690
由表4可见,Feton模型组可溶性蛋白含量显著低于正常对照组(P<0.001)。0.5%和1%牛磺酸组显著高于Feton模型组(P<0.001);二者比较后者sol-prot含量又显著高于前者(P<0.001);和对照组相比,均显著低于正常培养条件的sol-prot含量(P<0.001)。
, 百拇医药
3 讨 论
自由基氧化损伤可致白内障形成[1-3]和晶体细胞蛋白质分子构型改变,致其SH-外露,含碳氨基酸互相连接形成二硫键聚合物,致高分子不溶性蛋白增多[4]。细胞膜内及膜外蛋白的二硫键聚合物的形成,可致晶体纤维崩解[1]。这一过程伴有Na、K-ATP酶活性降低,共同促成白内障形成。因此,应用抗氧化剂保护晶体免受氧化损伤,成为防止白内障的主要研究课题。
牛磺酸是晶体内的主要抗氧化成分之一。该物质含磺基β—氨基酸,它在晶体内的含量占游离氨基酸的50%以上[5],平均为0.79mmol/ml晶体水,为房水浓度的26.3倍,对维持晶体透明性有重要作用。在白内障晶体,牛磺酸含量明显降低[6]。
据研究,牛磺酸能维持晶体的透明状态,可能是通过其抗氧化和调节渗透压双重机制完成的[7]。其抗氧化作用主要以抑制脂质过氧化发挥效能。研究发现,人白内障晶体中的脂质过氧化产物MDA含量比同年龄组正常晶体高20%～30%[6]。MDA的羧基可与蛋白质和磷脂的氨基反应,形成shiff-碱基共轭化合物。实验研究发现,加入牛磺酸体外培养的兔晶体,MDA含量明显降低,且每个晶体内MDA含量与牛磺酸含量呈负相关[8]。
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本研究显示,加入牛磺酸培养的晶体,不仅晶体透明维持时间长[3],而且总抗氧化能力(T-AOC)显著高于Feton模型组(P<0.001);尤其是1%牛磺酸组,其T-AOC测定值(4.3216±0.7991U/ml)和正常对照组(4.4018±1.2506U/ml)基本相当(P>0.05)。而其MDA测定值又明显低于Feton模型组(P<0.001)。1%牛磺酸组的MDA测定值(1.7084±0.2173mmol/ml)和正常培养的晶体测定值(1.6850±0.2552mmol/ml)无显著差异(P>0.05)。表明体外补充牛磺酸可明显提高晶体的抗氧化能力,抑制脂质过氧化作用。
牛磺酸的抗氧化作用还体现在抗氧化酶活性的提高上。本研究检测的晶体重要抗氧化酶SOD、CAT和GSH-PX活性,牛磺酸保护组均明显高于氧化损伤组(P<0.001),1%牛磺酸组效果更为明显,进一步验证了牛磺酸的抗氧化及防止白内障形成的作用。但就sol-prot测定结果看,抗氧化损伤组,不论是0.5%或1%牛磺酸,均未能使其sol-prot含量恢复到正常水平,表明牛磺酸仅能对氧化损伤所致的蛋白损害起到部分保护作用。
, 百拇医药
本研究显示,体外补充牛磺酸可提高晶体的抗氧化能力,防止或延缓白内障的形成。
作者简介：闫洪禄(1944-)男,河北省馆陶人,青岛市市立医院眼科主任,青岛大学医学院眼科教研室主任,教授,硕士研究生导师,主要研究早期白内障的药物治疗.
参考文献
1，Frederikse PH,Carland D,Zigler Js Jr,et al.Oxidative stress increase production of beta-amyloid precorsor protein and beta-amyloid(Abeta) in mammalian lenses,and Abetahas toxic effects on lens epithelial cells.J Biol Chem,1996,271:10174
, 百拇医药 2，Babizhayer MA,Costa EB.Lipid peroxide and reactive oxygen species generating systems of the crystalline lens.Biochem Biophys Acta,1994,1225:326337
3，Mibu H,Nagata M,Hikida M.A study on lipid peroxide induced lens damage in vitro.Exp Eye Res,1994,58:8590
4，Devamanoharan PS. Prevention of lens protein glycation by taurine.Mol Cell Biochem.1997,177(1-2):245-250
5，Barber GW.Free amino acids in senile cataractous lens:Possible osmoticetiology.Invest Ophthalmol,1968,7:564-583
6，张伟.牛磺酸防治白内障的实验研究.国外医学眼科学分册,1995,19(5):293
7，徐尚志.氧化应激与白内障.国外医学眼科学分册,1996,22(5):296-302
8，闫洪禄,王琇.牛磺酸抗白内障作用的实验研究(在排印中).
(收稿日期 1999-11-15), 百拇医药
单位：闫洪禄(青岛市立医院眼科,266011)；王琇(青岛市立医院眼科,266011)
关键词：牛磺酸；晶体；白内障；组织化学
山东医大基础医学院学报000201 摘要 目的:研究牛磺酸对晶体氧化损伤的保护作用。方法:将正常兔晶体分为正常条件培养组(对照组),Feton模型组(氧化损伤组),氧化损伤同时给0.5%和1%牛磺酸保护组。体外培养24h后,检测各组晶体的总抗氧化能力(T-AOC)水平,可溶性蛋白(sol-prot)含量,超氧化歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)及谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-PX)活性,以及脂质过氧化反应产物丙二醛(MDA)含量。结果:和对照组比较,Feton模型组晶体T-AOC水平,SOD、CAT和GSH-PX活性,slo-prot含量明显降低,MDA含量明显升高;和Feton模型组相比,牛磺酸保护组晶体T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX、sol-prot明显升高,MDA明显下降,以1%牛磺酸组最为明显。结论:牛磺酸有保护体外培养的兔晶体免受氧化损伤,抑制其脂质过氧化的作用。
, http://www.100md.com
中图分类号 R 776.1
A histochemical study on the prevention of cataract with taurine
Yan Honglu Wang Xiu
(Dept.of Ophthalmology,Qingdao Municiple Hospital,266011)
Abstract Objective:To evaluate the effect of taurine on protecting lens from oxidative stress.Methods:Rabbits′ lenses cultured in vitro were divided into 4 groups:control group,Feton model(oxidative stress group),the Feton model treated with 0.5% taurine and the Feton model with 1% taurine.The levels of lens′ T-AOC,sol-prot,SOD,CAT,GSH-PX and MDA were tested after incubation for 24h.Results:The levels of lens′ T-AOC,sol-prot,SOD,CAT,GSH-PX were significantly decreased in Feton model group compared with control group,and were significantly increased in the groups treated with 0.5% and 1% taurine compared with Feton model group,and were significantly increased in 1% taurine group compared with 0.5% taurine group.The level of lens′ MDA was significantly increased in Feton model group compared with control group,and markedly decreased in 0.5% and 1% taurine groups,especially in the 1% taurine group.Conclusion:Taurine can protect lens from oxidative stress in vitro.
, 百拇医药
Key words Taurine;Lens,crystalline;Cataract;Histochemistry
白内障形成的自由基氧化损伤机理已为眼科医师所熟知,牛磺酸作为组织中的重要抗氧化物质,也被研究所证实,但它在晶体内的抗氧化及维持晶体正常代谢,防止白内障形成的作用机理,尚缺乏系统研究。我们利用体外培养技术,通过酶组织化学研究,对牛磺酸的抗晶体氧化损伤作用做了进一步探讨。
1 材料与方法
1.1 试剂 199培养基系美国Hyclone公司产;牛磺酸系上海生化试剂厂产; T-AOC、SOD、CAT、GSH-PX、sol-prot、MDA试剂盒均系南京建成生物工程研究所产。
1.2 实验动物 健康家兔30只由青岛大学医学院动物实验中心提供,体重2.0～2.5kg,雌雄不限。实验前行裂隙灯检查,排除先天性白内障及其他异常。
, http://www.100md.com
1.3 晶体培养及实验分组 气栓处死动物后,立即摘取眼球,置于含500U/ml青霉素的生理盐水中冲洗,然后在无菌无损伤条件下取出晶体,置入下列不同条件培养液的6孔培养板中。
(1)对照组:199培养液10ml,内含青霉素100U/ml,链霉素0.1mg/ml。
(2)Feton模型组:除199培养液10ml外,另加30% HO 0.2ml,FeCl 2mg,形成氧化损伤的条件。
(3)0.5% 牛磺酸组:除Feton模型组各成分外,另加牛磺酸0.05g。
(4)1% 牛磺酸组:除Feton模型组各成分外,另加牛磺酸0.1g。
在37℃、湿度95%、含5%CO2的培养箱内培养24h后,取出行组织化学检查。
, 百拇医药
1.4 组织化学检查 将各组晶体从培养液中用圈匙托出,在0.85%氯化钠内漂洗后,加入pH值7.2的PBS液,冰浴下匀浆5min,制成10%匀浆,以10 000r/min4℃离心10min,取出上清液,测定各晶体的SOD、CAT、GSH-PX、T-AOC、MDA和sol-prot含量。将各组晶体各项指标的均值行组间t检验。
2 结 果
2.1 牛磺酸对晶体总抗氧化能力(T-AOC)的影响 晶体的T-AOC包括酶促和非酶促两个系统,前者包括SOD、CAT、GDH-PX等;后者包括维生素、氨基酸、含金属蛋白等。不同条件下培养24h后各组晶体T-AOC的检测结果见表1。
表1 培养24h后各组晶体T-AOC检测结果 组 别
n
T-AOC水平(U/ml)
, 百拇医药
对照组
Feton模型组
0.5%牛磺酸组
1%牛磺酸组
12
12
12
12
4.4018±1.2506
0.7072±0.2054
3.1034±0.7818
4.3216±0.7991
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由表1可见,Feton 模型组T-AOC水平明显低于对照组(P<0.001),0.5%和1%牛磺酸组T-AOC明显高于Feton模型组(P<0.001);但二者与对照组相比,前者差异有显著性(P<0.01),后者差异无显著性(P>0.05)。
2.2 牛磺酸对晶体抗氧化酶活性的影响 见表2。表2 各组晶体SOD、CAT、GSH-PX检测结果 组 别
n
SOD(μU/ml)
CAT(U/ml)
GSH-PX(U/ml)
对照组
Feton模型组
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0.5%牛磺酸组
1%牛磺酸组
12
12
12
12
107.6011±8.3897
33.2507±11.5006
46.9032±13.6287
64.6714±12.5488
5.5187±0.4520
1.7954±0.3700
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1.9647±0.1902
2.4616±0.2307
119.4257±44.2386
47.1283±14.5435
60.4730±6.1015
84.6284±10.7651
由表2可见,Feton模型组3种抗氧化酶活性均明显低于正常对照组(P<0.001)。1%牛磺酸组和Feton模型组相比,3种酶活性均显著增强(P<0.001);0.5%牛磺酸组与Feton模型组相比,SOD和GSH-PX检测值差异有高度显著性(P<0.001),CAT检测值差异有显著性(P<0.05)。0.5%牛磺酸组与1%浓度组相比,3种酶活性差异有高度显著性(P<0.001)。
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2.3 对晶体丙二醛(MDA)含量的影响 见表3。表3 各组晶体MDA含量测定结果 组 别
n
MDA(nmol/ml)
对照组
Feton模型组
0.5%牛磺酸组
1%牛磺酸组
12
12
12
12
1.6580±0.2552
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3.3199±0.5648
2.0905±0.3298
1.7048±0.2173
由表3可见,Feton模型组MDA含量显著高于正常对照组(P<0.001)。0.5%和1%牛磺酸组显著低于Feton模型组(P<0.001)。但前者所测数值仍显著高于正常对照组(P<0.01),后者则无统计学意义(P>0.05)。
2.4 牛磺酸对晶体蛋白成分的影响 见表4。表4 不同培养条件下各组晶体可溶性蛋白的含量 组 别
n
sol-prot(mg/ml)
对照组
, 百拇医药
Feton模型组
0.5%牛磺酸组
1%牛磺酸组
12
12
12
12
18.1781±0.9268
4.6895±0.7974
5.9886±0.6442
8.6520±0.8690
由表4可见,Feton模型组可溶性蛋白含量显著低于正常对照组(P<0.001)。0.5%和1%牛磺酸组显著高于Feton模型组(P<0.001);二者比较后者sol-prot含量又显著高于前者(P<0.001);和对照组相比,均显著低于正常培养条件的sol-prot含量(P<0.001)。
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3 讨 论
自由基氧化损伤可致白内障形成[1-3]和晶体细胞蛋白质分子构型改变,致其SH-外露,含碳氨基酸互相连接形成二硫键聚合物,致高分子不溶性蛋白增多[4]。细胞膜内及膜外蛋白的二硫键聚合物的形成,可致晶体纤维崩解[1]。这一过程伴有Na、K-ATP酶活性降低,共同促成白内障形成。因此,应用抗氧化剂保护晶体免受氧化损伤,成为防止白内障的主要研究课题。
牛磺酸是晶体内的主要抗氧化成分之一。该物质含磺基β—氨基酸,它在晶体内的含量占游离氨基酸的50%以上[5],平均为0.79mmol/ml晶体水,为房水浓度的26.3倍,对维持晶体透明性有重要作用。在白内障晶体,牛磺酸含量明显降低[6]。
据研究,牛磺酸能维持晶体的透明状态,可能是通过其抗氧化和调节渗透压双重机制完成的[7]。其抗氧化作用主要以抑制脂质过氧化发挥效能。研究发现,人白内障晶体中的脂质过氧化产物MDA含量比同年龄组正常晶体高20%～30%[6]。MDA的羧基可与蛋白质和磷脂的氨基反应,形成shiff-碱基共轭化合物。实验研究发现,加入牛磺酸体外培养的兔晶体,MDA含量明显降低,且每个晶体内MDA含量与牛磺酸含量呈负相关[8]。
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本研究显示,加入牛磺酸培养的晶体,不仅晶体透明维持时间长[3],而且总抗氧化能力(T-AOC)显著高于Feton模型组(P<0.001);尤其是1%牛磺酸组,其T-AOC测定值(4.3216±0.7991U/ml)和正常对照组(4.4018±1.2506U/ml)基本相当(P>0.05)。而其MDA测定值又明显低于Feton模型组(P<0.001)。1%牛磺酸组的MDA测定值(1.7084±0.2173mmol/ml)和正常培养的晶体测定值(1.6850±0.2552mmol/ml)无显著差异(P>0.05)。表明体外补充牛磺酸可明显提高晶体的抗氧化能力,抑制脂质过氧化作用。
牛磺酸的抗氧化作用还体现在抗氧化酶活性的提高上。本研究检测的晶体重要抗氧化酶SOD、CAT和GSH-PX活性,牛磺酸保护组均明显高于氧化损伤组(P<0.001),1%牛磺酸组效果更为明显,进一步验证了牛磺酸的抗氧化及防止白内障形成的作用。但就sol-prot测定结果看,抗氧化损伤组,不论是0.5%或1%牛磺酸,均未能使其sol-prot含量恢复到正常水平,表明牛磺酸仅能对氧化损伤所致的蛋白损害起到部分保护作用。
, 百拇医药
本研究显示,体外补充牛磺酸可提高晶体的抗氧化能力,防止或延缓白内障的形成。
作者简介：闫洪禄(1944-)男,河北省馆陶人,青岛市市立医院眼科主任,青岛大学医学院眼科教研室主任,教授,硕士研究生导师,主要研究早期白内障的药物治疗.
参考文献
1，Frederikse PH,Carland D,Zigler Js Jr,et al.Oxidative stress increase production of beta-amyloid precorsor protein and beta-amyloid(Abeta) in mammalian lenses,and Abetahas toxic effects on lens epithelial cells.J Biol Chem,1996,271:10174
, 百拇医药 2，Babizhayer MA,Costa EB.Lipid peroxide and reactive oxygen species generating systems of the crystalline lens.Biochem Biophys Acta,1994,1225:326337
3，Mibu H,Nagata M,Hikida M.A study on lipid peroxide induced lens damage in vitro.Exp Eye Res,1994,58:8590
4，Devamanoharan PS. Prevention of lens protein glycation by taurine.Mol Cell Biochem.1997,177(1-2):245-250
5，Barber GW.Free amino acids in senile cataractous lens:Possible osmoticetiology.Invest Ophthalmol,1968,7:564-583
6，张伟.牛磺酸防治白内障的实验研究.国外医学眼科学分册,1995,19(5):293
7，徐尚志.氧化应激与白内障.国外医学眼科学分册,1996,22(5):296-302
8，闫洪禄,王琇.牛磺酸抗白内障作用的实验研究(在排印中).
(收稿日期 1999-11-15), 百拇医药