模拟运动负荷电刺激对蟾蜍骨骼肌肌球蛋白分解代谢影响的免疫印迹观察
作者：倪成志
单位：航天医学工程研究所，北京100094
关键词：肌球蛋白；电刺激；免疫印迹；蟾蜍
航天医学与医学工程990609摘要：目的 探讨运动员体育训练中运动负荷的合理安排。方法 通过SDS-PAGE垂直板电泳和和免疫印迹方法观察不同强度电刺激后蟾蜍腓肠肌肌球蛋白变化情况。结果 (1)大强度电刺激后蟾蜍腓肠肌蛋白分解加强。(2)两次大强度电刺激后，出现分子量分别为43KD、38KD的肌球蛋白降解片段。(3)大强度电刺激后施加小强度电刺激，已出现的分子量为43KD的肌球蛋白降解片段消失。结论 在体育训练中，连续大强度负荷会引起骨骼肌收缩蛋白的进一步降解，而大强度负荷后施加小强度负荷有利于其收缩蛋白结构和功能的恢复。
中图分类号：G804.7，R872.7 文献标识码：A 文章编号：1002-0837(1999)06-0426-05
, http://www.100md.com
Immunoblotting Observation on Changes of Myosin
Degradation Metabolism in Toad G astrocnemius Muscle
Electric Stmulation under Simulated Exercise Load
NI Cheng-zhi
Address reprint requests to:NI Cheng-zhi.Institute of Space Medic o-Engineering,Beijing 100094,China
Abstract： Objective To probe into the optimum exercis e load in sports t raining. Method Myosin heavy chain degradation fragments produced by different- intensity electric stimulation were identified in toad gastrocnemius muscle . The fragments were identified by electrophoresis of unfractionated extracts of toad gastrocnemius muscle on sodium dodecyl sulfate/polyacrylamide gels followe d by immunoblotting on nitrocellulose sheets. Polyclonal antibody directed again st the entire myosin were used to characterize the fragments. Result Toad gastrocnemius muscle protein degradation increased under high-intensi ty electric stimulation;two kinds of Myosin degradation fragments whose molecula r weight were 43KD、38KD respectively were produced by double high-intensity el ectric stimulation; the molecular weight 43KD immunoreactive myosin fragments pr oduced by high-intensity electric stimulation disappeared under low-intensity electric stimulation . Conclusion Continuous high-intensity exercise load would make muscle contracti le protein further degradate while low-intensity exercise load would enhance th e recover of contraction and function of the muscle.
, 百拇医药
Key words:myosin;electric stimuli;immunoblotting;toad
骨骼肌肌球蛋白是肌原纤维粗丝的基本组成蛋白，其结构和功能的变化与骨骼肌结构和功能的变化密切相关。Richard等人[1](1987)通过免疫印迹方法观察到鸡胸大肌肌球蛋白在正常生理条件下其降解片段的分子量范围是80-130KD；卢鼎厚等人[2](1997)用免疫电镜方法观察到人在进行大负荷斜蹲后其股外侧肌肌球蛋白解聚或降解并向粗丝以外区域扩散，但无法确定出现的肌球蛋白降解片段的大小。本实验采用触压式电极直接刺激蟾蜍腓肠肌，避免了其它模拟运动方式所引起的非运动器官功能下降而导致实验动物无法维持预定强度的运动，同时严格量化了模拟运动中负荷的强度和运动量。本文通过免疫印迹方法观察了蟾蜍在重复不同强度电刺激条件下其腓肠肌总体蛋白和肌球蛋白的变化情况，目的是为运动员在训练中合理安排运动负荷提供一定的参考。
方 法
, 百拇医药
动物与分组 实验动物蟾蜍(中国科学院动物所提供)，随机分成4组：对照组21只、刺激1组10只、刺激2组9只、刺激3组11只。对照组手术后不加任何刺激,静置15h后取样；刺激1组为大强度电刺激3h后静置12h后取样；刺激2组为大强度电刺激3h后静置3h，然后再小强度电刺激1h再静置8h后取样；刺激3组为大强度电刺激3h后静置3h，然后再大强度电刺激3h再静置6h后取样。
仪器与试剂 实验使用日本产光电SEN-7103型电子刺激器、记录仪、Beckman公司生产的超速冷冻离心机、Mini-PROTEANII型垂直板电泳仪。实验所用的肌球蛋白多抗(M7523)、标准蛋白、丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、甘油、考马斯亮兰、溴酚兰、牛血清白蛋白(BSA)、PMSF、Tween20、TEMED、SDS(十二烷基硫酸钠)均购自Sigma公司。A-Mercaptacthanel、NBTBCIP购自Serva公司。Tris购自Fluka公司。其它试剂均为分析纯。
实验程序 (1)建立电刺激蟾蜍腓肠肌实验模型[3]。(2)抽提电刺激前、后蟾蜍腓肠肌肌球蛋白和可能出现的降解片段[4]。(3)SDS-PAGE垂直板分离电泳[5]。(4)多抗免疫标记肌球蛋白[6]。
, 百拇医药
结 果
电刺激前、后蟾蜍腓肠肌蛋白SDS-PAGE垂直板电泳观察(图1)
图1 不同强度重复剌激蟾蜍腓肠肌蛋白SDS-PAGE电泳图谱
Fig.1 Commassie blue-stained SDS/PAGE of toad gastrocnemius prote in under different-intensity electric stimulation
电刺激前、后分子量为200KD蛋白变化在SDS-PAGE电泳图谱上，实验各组电泳条带最上端均可观察到含量很高的、分子量为200KD的蛋白，并且实验各组没有观察到含量差异。
, 百拇医药
电刺激前、后分子量为78KD蛋白变化 在SDS-PAGE电泳图谱上，无论何种强度电刺激后，分子量为78KD蛋白含量均大于电刺激前含量，变化率为100%(在观察过程中，我们甚至以此作为区分电刺激前、后肌肉样品的标志)(表1)。
表1 电刺激前、后分子量为78KD蛋白变化
Table 1 Effects of different-intensity electric stimulation
on molecular weig ht 78KD protein 组别
(groups)
样本数
(number of samples)
, 百拇医药
78KD蛋白浓度变化(effects of concentration
of molecular weight 78KD protein)
减小(decreased)
不变(invariable)
增大(increased)
变化率(rate)(%)
刺激1组
(group 1)
10
0
0
, http://www.100md.com
10
100
刺激2组
(group 2)
9
0
0
9
100
刺激3组
(group 3)
11
0
, http://www.100md.com
0
11
100
电刺激前、后分子量为43KD蛋白变化 在SDS-PAGE垂直板电泳图谱上，电刺激前不出现分子量为43KD的蛋白，一次大强度电刺激后12h，出现分子量为43KD的蛋白，出现率为80%；一次大强度、一次小强度刺激后8h，出现率为11.11%；二次大强度电刺激后3h，出现率为90.91%(表2)。表2 电刺激前、后分子量为43KD蛋白变化
Table 2 Effects of different intensity electric stimulation
on molecular weight 43KD protein 组别(groups)
样本数(number of samples)
, 百拇医药
出现数(number of occurrance)
出现率(rate)(%)
对照组(control)
21
0
0
刺激1组(group 1)
10
8
80
刺激2组(group 2)
9
, http://www.100md.com
1
11.11
刺激3组(group 3)
11
10
90.91
电刺激前、后分子量为39KD蛋白至前沿蛋白变化 在SDS-PAGE垂直板电泳图谱上，电刺激前从分子量为39KD蛋白至前沿可清晰地观察到6种蛋白，分子量分别为39KD、37KD、35KD、34KD、30KD、24KD的蛋白。电刺激后出现3种蛋白，分子量分别为38KD、32KD、24KD，一次大强度电刺激后12h，变化率为80%；一次大强度、一次小强度电刺激后3h，变化率为88.89%；二次大强度电刺激后3h，变化率为90.91%(表3)。表3 电刺激前、后分子量为39KD蛋白至前沿蛋白变化
, 百拇医药
Table 3 Effects of different intensity electric stimulation
on molecular weight below 39KD protein 组别
(groups)
样本数
(number of samples)
蛋白种类(分子量)
(protein)(MW)
变化数
(number of change)
变化率
, 百拇医药
(rate)(%)
对照组(control)
21
39,37,35,34，30,24KD
刺激1组(group 1)
10
38,32,24KD
8
80
刺激2组(group 2)
9
38,32,24KD
, 百拇医药
8
88.89
刺激3组(group 3)
11
38,32,24KD
10
90.91
电刺激前、后蟾蜍腓肠肌肌球蛋白免疫印迹观察(图2)
图2 不同强度重复剌激后蟾蜍腓肠肌球蛋白免疫印迹图谱
a.两次大强度剌激；b.一次大强度剌激，一次小强度剌激；c.一次大强度 剌激；d.剌激前
, 百拇医药
Fig.2 Immunoblots of toad gastrocnemius myosin degration fragments under different-intensity electric stimulation
a.two high-intensity electric stimulation;b.one high and one low intensity stim ulation;c.one high-intensity stimulation;d.before stimulation
电刺激前蟾蜍腓肠肌肌球蛋白免疫印迹观察 在蟾蜍腓肠肌肌球蛋白免疫印迹图谱上，电刺激前可观察到分子量为200KD的肌球蛋白重链以及分子量分别为106KD、100KD的肌球蛋白降解片段。
电刺激后蟾蜍腓肠肌肌球蛋白免疫印迹观察 在蟾蜍腓肠肌肌球蛋白免疫印迹图谱上，电刺激后均可观察到分子量为200KD的肌球蛋白重链以及分子量分别为106KD、100KD的肌球蛋白降解片段。同时，在一次大强度电刺激后12h还可观察到分子量为43KD的肌球蛋白降解片段，出现率为70%；在一次大强度、一次小强度电刺激后8h，大强度电刺激产生的分子量为43KD的肌球蛋白降解片段基本消失，出现率仅为11.11%；在二次大强度电刺激后3h，还可观察到分子量分别为43KD、38KD的两种肌球蛋白降解片段，出现率为72.73%(表4)。
, 百拇医药
表4 电刺激前、后蟾蜍腓肠肌肌球蛋白免疫印迹观察
Table4 Effects of different-intensity electric stimulation
on immunoreactive myosin fragments 组别
(groups)
样本数
(number of
samples)
免疫印记标记到的肌球蛋白片段(number of occurrance of immunoreactive myosin fragments)
, 百拇医药
43KD片段
(43KD fragments)
出现率*
(rate)(%)
38KD片段
(38KD fragments)
43KD，38KD片段
(43KD,38KD fragments)
出现率(%)**
(rate)(%)
对照组(control)
, 百拇医药
21
0
0
0
0
0
刺激1组
(group 1)
10
7
70
0
1
10
, 百拇医药
刺激2组
(group 2)
9
1
11.11
0
0
0
刺激3组
(group 3)
11
2
18.19
, http://www.100md.com
0
8
72.73
注:*只出现分子量为43KD肌球蛋白降解片段的出现率，**出现分子量为43KD、38KD肌球蛋白 降解片段的出现率
Note:* occurrance rate of 43KD immunoreactive myosin fragments,** occurrance rat e of 43KD,38KD immunoreactive myosin fragments
讨 论
通过对电刺激前、后蟾蜍腓肠肌总体蛋白的SDS-PAGE垂直板电泳观察，我们发现蟾蜍腓肠肌在大强度刺激后恢复期的某个时间范围内其总体蛋白分解代谢加强。这与许多学者的研究结果相一致。Mohan(1985)观察到小鼠在一次性力竭运动后即刻其红肌、白肌的肌球蛋白、总蛋白、肌动蛋白的含量均减少，并且白肌减少的程度要比红肌大；同时游离氨基酸增多[6]。Pivarnik、Hickson通过对机体运动后尿中3-甲基组氨酸变化规律的研究后认为：骨骼肌收缩蛋白在运动后随着恢复时间的延长存在一个分解代谢加强的时期，并且收缩蛋白的分解代谢率显著高于安静时骨骼肌收缩蛋白的分解代谢率[7，8]。
, 百拇医药
通过免疫印迹图谱我们发现,实验各组均出现分子量为200KD的肌球蛋白重链以及分子量分别为106KD、100KD的肌球蛋白降解片段；同时，刺激1组还出现分子量为43KD的肌球蛋白降解片段，刺激2组不出现分子量为43KD、38KD的肌球蛋白降解片段，刺激3组还出现分子量分别为43KD、38KD的肌球蛋白降解片段。其中在SDS—PAGE垂直板电泳图谱上，分子量为38KD的肌球蛋白降解片段与肌肉本身具有的分子量为38KD的蛋白位置重合。我们分析有两种可能引起肌球蛋白降解：第一种可能是抽提手段引起的肌球蛋白重链降解，第二种可能是电刺激促发的长时间、高强度肌肉收缩导致肌球蛋白重链降解。Richard通过他的实验排除了第一种可能[2]。在此结论基础上，我们认为实验各组共同出现的分子量分别为106KD、100KD的肌球蛋白降解片段是骨骼肌内部固有的肌球蛋白降解片段，它表明安静时肌球蛋白也发生降解。同时，对于分子量为43KD、38KD的肌球蛋白降解片段而言，在免疫印迹图谱上对照组在这个位置附近没有出现肌球蛋白降解片段的结果，从另一个角度证明了这些肌球蛋白的降解片段只能是由电刺激引起的。本实验所用的肌球蛋白抽提方法采用了Richard的即刻抽提方法。
, 百拇医药
刺激1组的结果显示，在对蟾蜍腓肠肌施加一次大强度电刺激后恢复期的某个时间范围内，肌球蛋白降解占优势，出现分子量较小的肌球蛋白降解片段；刺激2组的结果显示，如果在恢复期施加小强度电刺激，那么已产生的肌球蛋白降解片段消失。其消失的原因有两种可能：其一，被机体重新利用合成肌球蛋白；其二，作为代谢的基质被氧化分解。我们认为第一种可能性不存在。原因在于，本实验所用的肌球蛋白抽提方法采用的是Richard的即刻抽提方法[2]，采用这种抽提方法抽提到的肌球蛋白降解片段只包含C-末端，不包含N-末端，而我们知道，蛋白质的合成均是从N-末端开始的。小强度电刺激使已产生的肌球蛋白降解片段作为代谢的基质被氧化分解的途径是：小强度电刺激引起的肌肉轻微收缩将大量血液带至肌肉中，肌球蛋白降解片段随血液流至可利用其的部位被氧化分解；刺激3组的结果表明，如果在恢复期施加大强度电刺激，那么肌球蛋白的降解程度加深，表现在降解片段增多，出现分子量更小的肌球蛋白降解片段。对于刺激3组出现分子量为38KD的肌球蛋白降解片段，我们认为一种可能是由肌球蛋白重链直接降解而来，另一种可能是由分子量为43KD的肌球蛋白重链降解片段进一步降解而来的。关于大强度离心收缩后骨骼肌收缩蛋白降解加强的机制目前尚无定论。较为公认的机制是大强度离心收缩产生的高张力使细胞膜受到牵拉，一方面激活Ca2+通道，使Ca2+顺浓度差进入细胞内，另一方面细胞膜的损害也造成Ca2+内流，同时运动后肌浆网功能下降，摄Ca2+能力下降导致肌浆内高Ca2+，肌浆内Ca2+浓度升高可激活蛋白水解酶，造成肌肉蛋白质水解[9,10]。
, 百拇医药
本实验的结果表明，在体质训练中由前一负荷所引起的骨骼肌收缩蛋白降解优势可能有这样的两种发展方向，第一种发展方向，即在运动后没有足够的休息和促进恢复的措施而使运动后的延迟性结构变化不能完全恢复的背景条件下，重复的超负荷训练将导致结构变化的积累和稳定而形成慢性肌肉损伤；另一发展方向，即在训练后通过休息和促进恢复的措施并根据前一负荷的反应调整后继训练负荷使收缩蛋白的合成代谢加强而促进骨骼肌的结构和机能的恢复。我们认为，在运动员训练中，为提高或保持其身体综合素质而进行大强度训练后，采用小强度的后继负荷是较为适宜的。这样既可以达到运动训练的目的，又可以避免运动损伤的发生。
参考文献
[1]RichardD,Daniel L. Myosin Degradation Fragments in Skelet al Muscle[J].J Mol Biol, 1987, 193:47～56
[2]卢鼎厚编著.骨骼肌损伤的机制[M].北京：北京体育大学出版社 ,1997：68～78
, 百拇医药
[3]屈竹青.针刺和静力牵张对大负荷运动后骨骼肌M线变化影响的免疫 电镜研究[J].体育科学杂志，1992, 12(6):52～59
[4]张龙翔主编.生化实验方法和技术[M].北京：人民教育出版社,19 81:112～118
[5]H.Towbin H,Gordon J.Immunoblotting and Dot Immunoblotting —Current Statusand[M].1984,72: 313～340
[6]Mohan PK,Indira K,Rajendra W. Protein Degradation in Funct ionally Different Mu scles of Rat During Exhaustive Exercise[J].Indian Journal of Expermental Biolo gy,1985,23:655～657
, 百拇医药
[7]Pivarnik JM. Urinary 3-methylhistidine excretion increase s with repe ated weight training exercise[J]. Med Sci Sports Exerc,1989, 21(3), 283～287[ ZK)〗
[8]Hickson JF.Failure of weight training to affect urinary in dices of protein metabolism in men[J]. Med Sci Sports Exerc, 1986, 18(5): 563 ～567
[9]田野.细胞Ca2+与运动性骨骼肌肌纤维损伤[J].中国运动 医学杂志,1992,11(1)：44～48
[10]Armstrong RB.Initial events in exercise-induced muscular injury [J].Med Sci Sports Exerc,1990,22:429～435
收稿日期：1999-01-25, 百拇医药
单位：航天医学工程研究所，北京100094
关键词：肌球蛋白；电刺激；免疫印迹；蟾蜍
航天医学与医学工程990609摘要：目的 探讨运动员体育训练中运动负荷的合理安排。方法 通过SDS-PAGE垂直板电泳和和免疫印迹方法观察不同强度电刺激后蟾蜍腓肠肌肌球蛋白变化情况。结果 (1)大强度电刺激后蟾蜍腓肠肌蛋白分解加强。(2)两次大强度电刺激后，出现分子量分别为43KD、38KD的肌球蛋白降解片段。(3)大强度电刺激后施加小强度电刺激，已出现的分子量为43KD的肌球蛋白降解片段消失。结论 在体育训练中，连续大强度负荷会引起骨骼肌收缩蛋白的进一步降解，而大强度负荷后施加小强度负荷有利于其收缩蛋白结构和功能的恢复。
中图分类号：G804.7，R872.7 文献标识码：A 文章编号：1002-0837(1999)06-0426-05
, http://www.100md.com
Immunoblotting Observation on Changes of Myosin
Degradation Metabolism in Toad G astrocnemius Muscle
Electric Stmulation under Simulated Exercise Load
NI Cheng-zhi
Address reprint requests to:NI Cheng-zhi.Institute of Space Medic o-Engineering,Beijing 100094,China
Abstract： Objective To probe into the optimum exercis e load in sports t raining. Method Myosin heavy chain degradation fragments produced by different- intensity electric stimulation were identified in toad gastrocnemius muscle . The fragments were identified by electrophoresis of unfractionated extracts of toad gastrocnemius muscle on sodium dodecyl sulfate/polyacrylamide gels followe d by immunoblotting on nitrocellulose sheets. Polyclonal antibody directed again st the entire myosin were used to characterize the fragments. Result Toad gastrocnemius muscle protein degradation increased under high-intensi ty electric stimulation;two kinds of Myosin degradation fragments whose molecula r weight were 43KD、38KD respectively were produced by double high-intensity el ectric stimulation; the molecular weight 43KD immunoreactive myosin fragments pr oduced by high-intensity electric stimulation disappeared under low-intensity electric stimulation . Conclusion Continuous high-intensity exercise load would make muscle contracti le protein further degradate while low-intensity exercise load would enhance th e recover of contraction and function of the muscle.
, 百拇医药
Key words:myosin;electric stimuli;immunoblotting;toad
骨骼肌肌球蛋白是肌原纤维粗丝的基本组成蛋白，其结构和功能的变化与骨骼肌结构和功能的变化密切相关。Richard等人[1](1987)通过免疫印迹方法观察到鸡胸大肌肌球蛋白在正常生理条件下其降解片段的分子量范围是80-130KD；卢鼎厚等人[2](1997)用免疫电镜方法观察到人在进行大负荷斜蹲后其股外侧肌肌球蛋白解聚或降解并向粗丝以外区域扩散，但无法确定出现的肌球蛋白降解片段的大小。本实验采用触压式电极直接刺激蟾蜍腓肠肌，避免了其它模拟运动方式所引起的非运动器官功能下降而导致实验动物无法维持预定强度的运动，同时严格量化了模拟运动中负荷的强度和运动量。本文通过免疫印迹方法观察了蟾蜍在重复不同强度电刺激条件下其腓肠肌总体蛋白和肌球蛋白的变化情况，目的是为运动员在训练中合理安排运动负荷提供一定的参考。
方 法
, 百拇医药
动物与分组 实验动物蟾蜍(中国科学院动物所提供)，随机分成4组：对照组21只、刺激1组10只、刺激2组9只、刺激3组11只。对照组手术后不加任何刺激,静置15h后取样；刺激1组为大强度电刺激3h后静置12h后取样；刺激2组为大强度电刺激3h后静置3h，然后再小强度电刺激1h再静置8h后取样；刺激3组为大强度电刺激3h后静置3h，然后再大强度电刺激3h再静置6h后取样。
仪器与试剂 实验使用日本产光电SEN-7103型电子刺激器、记录仪、Beckman公司生产的超速冷冻离心机、Mini-PROTEANII型垂直板电泳仪。实验所用的肌球蛋白多抗(M7523)、标准蛋白、丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、甘油、考马斯亮兰、溴酚兰、牛血清白蛋白(BSA)、PMSF、Tween20、TEMED、SDS(十二烷基硫酸钠)均购自Sigma公司。A-Mercaptacthanel、NBTBCIP购自Serva公司。Tris购自Fluka公司。其它试剂均为分析纯。
实验程序 (1)建立电刺激蟾蜍腓肠肌实验模型[3]。(2)抽提电刺激前、后蟾蜍腓肠肌肌球蛋白和可能出现的降解片段[4]。(3)SDS-PAGE垂直板分离电泳[5]。(4)多抗免疫标记肌球蛋白[6]。
, 百拇医药
结 果
电刺激前、后蟾蜍腓肠肌蛋白SDS-PAGE垂直板电泳观察(图1)
图1 不同强度重复剌激蟾蜍腓肠肌蛋白SDS-PAGE电泳图谱Fig.1 Commassie blue-stained SDS/PAGE of toad gastrocnemius prote in under different-intensity electric stimulation
电刺激前、后分子量为200KD蛋白变化在SDS-PAGE电泳图谱上，实验各组电泳条带最上端均可观察到含量很高的、分子量为200KD的蛋白，并且实验各组没有观察到含量差异。
, 百拇医药
电刺激前、后分子量为78KD蛋白变化 在SDS-PAGE电泳图谱上，无论何种强度电刺激后，分子量为78KD蛋白含量均大于电刺激前含量，变化率为100%(在观察过程中，我们甚至以此作为区分电刺激前、后肌肉样品的标志)(表1)。
表1 电刺激前、后分子量为78KD蛋白变化
Table 1 Effects of different-intensity electric stimulation
on molecular weig ht 78KD protein 组别
(groups)
样本数
(number of samples)
, 百拇医药
78KD蛋白浓度变化(effects of concentration
of molecular weight 78KD protein)
减小(decreased)
不变(invariable)
增大(increased)
变化率(rate)(%)
刺激1组
(group 1)
10
0
0
, http://www.100md.com
10
100
刺激2组
(group 2)
9
0
0
9
100
刺激3组
(group 3)
11
0
, http://www.100md.com
0
11
100
电刺激前、后分子量为43KD蛋白变化 在SDS-PAGE垂直板电泳图谱上，电刺激前不出现分子量为43KD的蛋白，一次大强度电刺激后12h，出现分子量为43KD的蛋白，出现率为80%；一次大强度、一次小强度刺激后8h，出现率为11.11%；二次大强度电刺激后3h，出现率为90.91%(表2)。表2 电刺激前、后分子量为43KD蛋白变化
Table 2 Effects of different intensity electric stimulation
on molecular weight 43KD protein 组别(groups)
样本数(number of samples)
, 百拇医药
出现数(number of occurrance)
出现率(rate)(%)
对照组(control)
21
0
0
刺激1组(group 1)
10
8
80
刺激2组(group 2)
9
, http://www.100md.com
1
11.11
刺激3组(group 3)
11
10
90.91
电刺激前、后分子量为39KD蛋白至前沿蛋白变化 在SDS-PAGE垂直板电泳图谱上，电刺激前从分子量为39KD蛋白至前沿可清晰地观察到6种蛋白，分子量分别为39KD、37KD、35KD、34KD、30KD、24KD的蛋白。电刺激后出现3种蛋白，分子量分别为38KD、32KD、24KD，一次大强度电刺激后12h，变化率为80%；一次大强度、一次小强度电刺激后3h，变化率为88.89%；二次大强度电刺激后3h，变化率为90.91%(表3)。表3 电刺激前、后分子量为39KD蛋白至前沿蛋白变化
, 百拇医药
Table 3 Effects of different intensity electric stimulation
on molecular weight below 39KD protein 组别
(groups)
样本数
(number of samples)
蛋白种类(分子量)
(protein)(MW)
变化数
(number of change)
变化率
, 百拇医药
(rate)(%)
对照组(control)
21
39,37,35,34，30,24KD
刺激1组(group 1)
10
38,32,24KD
8
80
刺激2组(group 2)
9
38,32,24KD
, 百拇医药
8
88.89
刺激3组(group 3)
11
38,32,24KD
10
90.91
电刺激前、后蟾蜍腓肠肌肌球蛋白免疫印迹观察(图2)
图2 不同强度重复剌激后蟾蜍腓肠肌球蛋白免疫印迹图谱
a.两次大强度剌激；b.一次大强度剌激，一次小强度剌激；c.一次大强度 剌激；d.剌激前
, 百拇医药
Fig.2 Immunoblots of toad gastrocnemius myosin degration fragments under different-intensity electric stimulation
a.two high-intensity electric stimulation;b.one high and one low intensity stim ulation;c.one high-intensity stimulation;d.before stimulation
电刺激前蟾蜍腓肠肌肌球蛋白免疫印迹观察 在蟾蜍腓肠肌肌球蛋白免疫印迹图谱上，电刺激前可观察到分子量为200KD的肌球蛋白重链以及分子量分别为106KD、100KD的肌球蛋白降解片段。
电刺激后蟾蜍腓肠肌肌球蛋白免疫印迹观察 在蟾蜍腓肠肌肌球蛋白免疫印迹图谱上，电刺激后均可观察到分子量为200KD的肌球蛋白重链以及分子量分别为106KD、100KD的肌球蛋白降解片段。同时，在一次大强度电刺激后12h还可观察到分子量为43KD的肌球蛋白降解片段，出现率为70%；在一次大强度、一次小强度电刺激后8h，大强度电刺激产生的分子量为43KD的肌球蛋白降解片段基本消失，出现率仅为11.11%；在二次大强度电刺激后3h，还可观察到分子量分别为43KD、38KD的两种肌球蛋白降解片段，出现率为72.73%(表4)。
, 百拇医药
表4 电刺激前、后蟾蜍腓肠肌肌球蛋白免疫印迹观察
Table4 Effects of different-intensity electric stimulation
on immunoreactive myosin fragments 组别
(groups)
样本数
(number of
samples)
免疫印记标记到的肌球蛋白片段(number of occurrance of immunoreactive myosin fragments)
, 百拇医药
43KD片段
(43KD fragments)
出现率*
(rate)(%)
38KD片段
(38KD fragments)
43KD，38KD片段
(43KD,38KD fragments)
出现率(%)**
(rate)(%)
对照组(control)
, 百拇医药
21
0
0
0
0
0
刺激1组
(group 1)
10
7
70
0
1
10
, 百拇医药
刺激2组
(group 2)
9
1
11.11
0
0
0
刺激3组
(group 3)
11
2
18.19
, http://www.100md.com
0
8
72.73
注:*只出现分子量为43KD肌球蛋白降解片段的出现率，**出现分子量为43KD、38KD肌球蛋白 降解片段的出现率
Note:* occurrance rate of 43KD immunoreactive myosin fragments,** occurrance rat e of 43KD,38KD immunoreactive myosin fragments
讨 论
通过对电刺激前、后蟾蜍腓肠肌总体蛋白的SDS-PAGE垂直板电泳观察，我们发现蟾蜍腓肠肌在大强度刺激后恢复期的某个时间范围内其总体蛋白分解代谢加强。这与许多学者的研究结果相一致。Mohan(1985)观察到小鼠在一次性力竭运动后即刻其红肌、白肌的肌球蛋白、总蛋白、肌动蛋白的含量均减少，并且白肌减少的程度要比红肌大；同时游离氨基酸增多[6]。Pivarnik、Hickson通过对机体运动后尿中3-甲基组氨酸变化规律的研究后认为：骨骼肌收缩蛋白在运动后随着恢复时间的延长存在一个分解代谢加强的时期，并且收缩蛋白的分解代谢率显著高于安静时骨骼肌收缩蛋白的分解代谢率[7，8]。
, 百拇医药
通过免疫印迹图谱我们发现,实验各组均出现分子量为200KD的肌球蛋白重链以及分子量分别为106KD、100KD的肌球蛋白降解片段；同时，刺激1组还出现分子量为43KD的肌球蛋白降解片段，刺激2组不出现分子量为43KD、38KD的肌球蛋白降解片段，刺激3组还出现分子量分别为43KD、38KD的肌球蛋白降解片段。其中在SDS—PAGE垂直板电泳图谱上，分子量为38KD的肌球蛋白降解片段与肌肉本身具有的分子量为38KD的蛋白位置重合。我们分析有两种可能引起肌球蛋白降解：第一种可能是抽提手段引起的肌球蛋白重链降解，第二种可能是电刺激促发的长时间、高强度肌肉收缩导致肌球蛋白重链降解。Richard通过他的实验排除了第一种可能[2]。在此结论基础上，我们认为实验各组共同出现的分子量分别为106KD、100KD的肌球蛋白降解片段是骨骼肌内部固有的肌球蛋白降解片段，它表明安静时肌球蛋白也发生降解。同时，对于分子量为43KD、38KD的肌球蛋白降解片段而言，在免疫印迹图谱上对照组在这个位置附近没有出现肌球蛋白降解片段的结果，从另一个角度证明了这些肌球蛋白的降解片段只能是由电刺激引起的。本实验所用的肌球蛋白抽提方法采用了Richard的即刻抽提方法。
, 百拇医药
刺激1组的结果显示，在对蟾蜍腓肠肌施加一次大强度电刺激后恢复期的某个时间范围内，肌球蛋白降解占优势，出现分子量较小的肌球蛋白降解片段；刺激2组的结果显示，如果在恢复期施加小强度电刺激，那么已产生的肌球蛋白降解片段消失。其消失的原因有两种可能：其一，被机体重新利用合成肌球蛋白；其二，作为代谢的基质被氧化分解。我们认为第一种可能性不存在。原因在于，本实验所用的肌球蛋白抽提方法采用的是Richard的即刻抽提方法[2]，采用这种抽提方法抽提到的肌球蛋白降解片段只包含C-末端，不包含N-末端，而我们知道，蛋白质的合成均是从N-末端开始的。小强度电刺激使已产生的肌球蛋白降解片段作为代谢的基质被氧化分解的途径是：小强度电刺激引起的肌肉轻微收缩将大量血液带至肌肉中，肌球蛋白降解片段随血液流至可利用其的部位被氧化分解；刺激3组的结果表明，如果在恢复期施加大强度电刺激，那么肌球蛋白的降解程度加深，表现在降解片段增多，出现分子量更小的肌球蛋白降解片段。对于刺激3组出现分子量为38KD的肌球蛋白降解片段，我们认为一种可能是由肌球蛋白重链直接降解而来，另一种可能是由分子量为43KD的肌球蛋白重链降解片段进一步降解而来的。关于大强度离心收缩后骨骼肌收缩蛋白降解加强的机制目前尚无定论。较为公认的机制是大强度离心收缩产生的高张力使细胞膜受到牵拉，一方面激活Ca2+通道，使Ca2+顺浓度差进入细胞内，另一方面细胞膜的损害也造成Ca2+内流，同时运动后肌浆网功能下降，摄Ca2+能力下降导致肌浆内高Ca2+，肌浆内Ca2+浓度升高可激活蛋白水解酶，造成肌肉蛋白质水解[9,10]。
, 百拇医药
本实验的结果表明，在体质训练中由前一负荷所引起的骨骼肌收缩蛋白降解优势可能有这样的两种发展方向，第一种发展方向，即在运动后没有足够的休息和促进恢复的措施而使运动后的延迟性结构变化不能完全恢复的背景条件下，重复的超负荷训练将导致结构变化的积累和稳定而形成慢性肌肉损伤；另一发展方向，即在训练后通过休息和促进恢复的措施并根据前一负荷的反应调整后继训练负荷使收缩蛋白的合成代谢加强而促进骨骼肌的结构和机能的恢复。我们认为，在运动员训练中，为提高或保持其身体综合素质而进行大强度训练后，采用小强度的后继负荷是较为适宜的。这样既可以达到运动训练的目的，又可以避免运动损伤的发生。
参考文献
[1]RichardD,Daniel L. Myosin Degradation Fragments in Skelet al Muscle[J].J Mol Biol, 1987, 193:47～56
[2]卢鼎厚编著.骨骼肌损伤的机制[M].北京：北京体育大学出版社 ,1997：68～78
, 百拇医药
[3]屈竹青.针刺和静力牵张对大负荷运动后骨骼肌M线变化影响的免疫 电镜研究[J].体育科学杂志，1992, 12(6):52～59
[4]张龙翔主编.生化实验方法和技术[M].北京：人民教育出版社,19 81:112～118
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[6]Mohan PK,Indira K,Rajendra W. Protein Degradation in Funct ionally Different Mu scles of Rat During Exhaustive Exercise[J].Indian Journal of Expermental Biolo gy,1985,23:655～657
, 百拇医药
[7]Pivarnik JM. Urinary 3-methylhistidine excretion increase s with repe ated weight training exercise[J]. Med Sci Sports Exerc,1989, 21(3), 283～287[ ZK)〗
[8]Hickson JF.Failure of weight training to affect urinary in dices of protein metabolism in men[J]. Med Sci Sports Exerc, 1986, 18(5): 563 ～567
[9]田野.细胞Ca2+与运动性骨骼肌肌纤维损伤[J].中国运动 医学杂志,1992,11(1)：44～48
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收稿日期：1999-01-25, 百拇医药