点免疫金渗滤法检测弓形虫IgG抗体
作者：邵祝洪 王虹玲 胡建成 方桂女 胡向军
单位：杭州市红十字会医院中心实验室，杭州310004
关键词：点免疫金渗滤测定法；弓形虫
临床检验杂志990323 弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种可寄生在细胞内的原虫，人群中有较高的感染率。人类和多种动物感染弓形虫后可引起弓形虫病，出现神经系统、眼部和多个脏器的损伤。孕妇感染可引起胎儿畸形，流产或死胎。由于检获弓形虫体比较困难，对弓形虫感染的诊断主要依赖于血清抗体的检测[1]。本文采用弓形虫速殖子可溶性抗原和胶体金标记SPA，根据免疫渗滤原理，建立了检测血清弓形虫IgG抗体的点免疫金渗滤测定法(dot immunogold filtration assay,DIGFA)，旨在摸索一种操作简便，反应快速、携带方便、适合现场普查和诊断弓形虫感染的新方法。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 弓形虫速殖子抗原 将弓形虫速殖子接种于BALB/C小鼠腹腔，第三天收集腹水，用胰蛋白酶消化后超声粉碎，高速离心后收集上清，即为速殖子可溶性抗原。紫外吸收法测蛋白浓度为1.2 mg/ml，分装后冷冻干燥，置低温冰箱保存。
1.1.2 胶体金标记SPA 0.01 g/dl氯金酸溶液100 ml加热煮沸，加入1 g/dl柠檬酸三钠1.5 ml，用0.1 mol/L HCl调pH至6.0，加入SPA 1 mg，搅拌10 min，3 000 r/min离心20 min，取上清12 000 r/min离心20 min，将沉淀悬于含1%BSA、0.02 g/dl NaN3的PBS中，置4℃保存[2]。
1.1.3 ELISA法 弓形虫IgG抗体检测试剂盒由伊利康生物技术有限公司提供(进口分装)。
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1.1.4 血清标本 孕妇血清共128份来自本院，正常献血员血清57份来自杭州市中心血站。
1.2 方法
1.2.1 点免疫金渗滤测定法 将弓形虫速殖子可溶性抗原用pH 9.8的碳酸缓冲液溶解，调抗原浓度至2 mg/ml，取1 μl点加在孔径为0.45 μm的硝酸纤维膜上，37℃烘干。在膜下垫上数层吸水滤纸，装入有一直径为0.8 cm加样孔的塑料渗滤夹具中，使点有抗原的部位正对孔中央，在孔中滴加不经稀释的血清样品50 μl，待完全渗入膜内后，再加入胶体金标记的SPA 100 μl。阳性结果可在膜上点有抗原处显现清晰的红色斑点，阴性结果无斑点，整个操作约2～3 min。
1.2.2 ELISA法测定 严格按试剂盒说明书操作。
2 结果
2.1 对比试验 用点免疫金渗滤测定法和ELISA法同时测定孕妇组和献血员组血清标本共185份，结果如表1。
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表1 点免疫金渗滤测定法和ELISA法对比试验结果 组 别
例 数
阳性率(%)
DIGFA
ELISA
孕妇组
献血员
128
57
7.03(9/128)
7.02(4/57)
6.25(8/128)
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7.02(4/57)
ELISA法检测孕妇组弓形虫IgG抗体阳性率为6.25%(8/128)，献血员组阳性率为7.02%(4/57)；点免疫金渗滤测定法检测孕妇组弓形虫IgG抗体阳性率为7.03%(9/128)，献血员组阳性率为7.02%(4/57)。孕妇组与献血员组弓形虫IgG抗体阳性率无显著性差异(χ2＝1.13×10-5 P>0.05)与ELISA法比较，点免疫金渗滤测定法的相对敏感性为92.3%(12/13)，相对特异性为99.4%(172/173),相对符合率为99.5%(184/185)。两种方法之间无显著性差异(χ2＝0.043 P>0.05)。
2.2 吸收试验 将弓形虫速殖子可溶性抗原分别加入4份ELISA法检测出的阳性血清中，充分混匀。半小时后用点免疫金渗滤测定法检测弓形虫IgG抗体，未出现阳性结果。
, 百拇医药 2.3 重复试验 将ELISA法检出的阳性血清和阴性血清各4份，用点免疫金渗滤测定法分别测定同一批次包被和不同的3个批次包被的抗原膜，共重复4次，结果一致。
3 讨论
弓形虫感染后可诱导机体产生体液和细胞免疫反应，血清中出现针对弓形虫抗原的特异性抗体，包括IgG、IgM、IgA和IgE[3～5]。在诊断弓形虫感染时，检测血清中弓形虫IgG抗体的方法被普遍采用，抗原的选择将直接影响检测的特异性和敏感性。本实验中，一份ELISA法检测阴性的血清在点免疫金渗滤测定中出现阳性，其原因可能有二：(一)此方法的敏感性略高于ELISA法；(二)所采用的弓形虫速殖子可溶性抗原与爱米尔肠球菌属或血吸虫之间存在共同抗原决定簇而产生交叉反应。若采用进一步纯化的抗原或基因工程表达抗原如弓形虫主要表面抗原SAG1(p30)等[6]，将有助于提高检测的特异性。
点免疫金渗滤测定法是近年发展起来的一种新检测方法。该方法集金标记技术和免疫渗滤技术的优点，简化了操作方法，加快了反应时间，增加了试剂的稳定性。金颗粒与蛋白质靠静电引力作用而形成结合物，此物理过程不破坏蛋白质结构从而保持了蛋白质的原有活性。免疫渗滤技术通过免疫浓缩(immuno concentration)作用，使渗滤过程中存在于液相的抗体与固相载体上的抗原结合机会增加，大大缩短了抗原抗体反应达到平衡的时间。点免疫金渗滤测定法与ELISA法对比结果显示：点免疫金渗滤测定法具有较高的敏感性(92.3%)、特异性(99.4%)和符合率(99.5%)。该法重复性较好且试剂稳定，是现有检测弓形虫抗体方法中操作最简便、反应时间最短的方法，在弓形虫感染的诊断和流行病学调查中具有重要的应用价值。
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参考文献
[1]Houiman R E,Raymond R,Renton N,et al.The diagnosis of toxoplasmosis using IgG avidity.Epidemiol Infect，1994，112：399
[2]Spielberg F,Ryder R W,Harris J,et al.Field testing and comparative evaluation of rapid,visually read screening assay for antibody to human immunodeficiency virus.Lancet，1989，1：580
[3]Noel I,Balfour A H,Wilcox M H.Toxoplasma infection and systemic lupus erythematosus:analysis of the serological response by immunoblotting.J Clin Pathol，1993，46：628
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[4]Wong S Y,Hajdu M P,Ramirez R,et al.Role of IgE in diagnosis of acute toxoplasma infection and toxoplasmosis.J Clin Microbiol，1993，31：2 952
[5]Subauste C S,Remington J S.Immunity to Toxoplasma gondii.Curr opin Immunol.1993，5：532
[6]Kim K,Bulow R,Kampmeier J,et al.Conformationally appropriate expression of the Toxoplasma antigen SAG1(p30)in CHO cells. Infect Immun 1994，62：203
(1998-09-28收稿，1998-02-05修回), 百拇医药
单位：杭州市红十字会医院中心实验室，杭州310004
关键词：点免疫金渗滤测定法；弓形虫
临床检验杂志990323 弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种可寄生在细胞内的原虫，人群中有较高的感染率。人类和多种动物感染弓形虫后可引起弓形虫病，出现神经系统、眼部和多个脏器的损伤。孕妇感染可引起胎儿畸形，流产或死胎。由于检获弓形虫体比较困难，对弓形虫感染的诊断主要依赖于血清抗体的检测[1]。本文采用弓形虫速殖子可溶性抗原和胶体金标记SPA，根据免疫渗滤原理，建立了检测血清弓形虫IgG抗体的点免疫金渗滤测定法(dot immunogold filtration assay,DIGFA)，旨在摸索一种操作简便，反应快速、携带方便、适合现场普查和诊断弓形虫感染的新方法。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 弓形虫速殖子抗原 将弓形虫速殖子接种于BALB/C小鼠腹腔，第三天收集腹水，用胰蛋白酶消化后超声粉碎，高速离心后收集上清，即为速殖子可溶性抗原。紫外吸收法测蛋白浓度为1.2 mg/ml，分装后冷冻干燥，置低温冰箱保存。
1.1.2 胶体金标记SPA 0.01 g/dl氯金酸溶液100 ml加热煮沸，加入1 g/dl柠檬酸三钠1.5 ml，用0.1 mol/L HCl调pH至6.0，加入SPA 1 mg，搅拌10 min，3 000 r/min离心20 min，取上清12 000 r/min离心20 min，将沉淀悬于含1%BSA、0.02 g/dl NaN3的PBS中，置4℃保存[2]。
1.1.3 ELISA法 弓形虫IgG抗体检测试剂盒由伊利康生物技术有限公司提供(进口分装)。
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1.1.4 血清标本 孕妇血清共128份来自本院，正常献血员血清57份来自杭州市中心血站。
1.2 方法
1.2.1 点免疫金渗滤测定法 将弓形虫速殖子可溶性抗原用pH 9.8的碳酸缓冲液溶解，调抗原浓度至2 mg/ml，取1 μl点加在孔径为0.45 μm的硝酸纤维膜上，37℃烘干。在膜下垫上数层吸水滤纸，装入有一直径为0.8 cm加样孔的塑料渗滤夹具中，使点有抗原的部位正对孔中央，在孔中滴加不经稀释的血清样品50 μl，待完全渗入膜内后，再加入胶体金标记的SPA 100 μl。阳性结果可在膜上点有抗原处显现清晰的红色斑点，阴性结果无斑点，整个操作约2～3 min。
1.2.2 ELISA法测定 严格按试剂盒说明书操作。
2 结果
2.1 对比试验 用点免疫金渗滤测定法和ELISA法同时测定孕妇组和献血员组血清标本共185份，结果如表1。
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表1 点免疫金渗滤测定法和ELISA法对比试验结果 组 别
例 数
阳性率(%)
DIGFA
ELISA
孕妇组
献血员
128
57
7.03(9/128)
7.02(4/57)
6.25(8/128)
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7.02(4/57)
ELISA法检测孕妇组弓形虫IgG抗体阳性率为6.25%(8/128)，献血员组阳性率为7.02%(4/57)；点免疫金渗滤测定法检测孕妇组弓形虫IgG抗体阳性率为7.03%(9/128)，献血员组阳性率为7.02%(4/57)。孕妇组与献血员组弓形虫IgG抗体阳性率无显著性差异(χ2＝1.13×10-5 P>0.05)与ELISA法比较，点免疫金渗滤测定法的相对敏感性为92.3%(12/13)，相对特异性为99.4%(172/173),相对符合率为99.5%(184/185)。两种方法之间无显著性差异(χ2＝0.043 P>0.05)。
2.2 吸收试验 将弓形虫速殖子可溶性抗原分别加入4份ELISA法检测出的阳性血清中，充分混匀。半小时后用点免疫金渗滤测定法检测弓形虫IgG抗体，未出现阳性结果。
, 百拇医药 2.3 重复试验 将ELISA法检出的阳性血清和阴性血清各4份，用点免疫金渗滤测定法分别测定同一批次包被和不同的3个批次包被的抗原膜，共重复4次，结果一致。
3 讨论
弓形虫感染后可诱导机体产生体液和细胞免疫反应，血清中出现针对弓形虫抗原的特异性抗体，包括IgG、IgM、IgA和IgE[3～5]。在诊断弓形虫感染时，检测血清中弓形虫IgG抗体的方法被普遍采用，抗原的选择将直接影响检测的特异性和敏感性。本实验中，一份ELISA法检测阴性的血清在点免疫金渗滤测定中出现阳性，其原因可能有二：(一)此方法的敏感性略高于ELISA法；(二)所采用的弓形虫速殖子可溶性抗原与爱米尔肠球菌属或血吸虫之间存在共同抗原决定簇而产生交叉反应。若采用进一步纯化的抗原或基因工程表达抗原如弓形虫主要表面抗原SAG1(p30)等[6]，将有助于提高检测的特异性。
点免疫金渗滤测定法是近年发展起来的一种新检测方法。该方法集金标记技术和免疫渗滤技术的优点，简化了操作方法，加快了反应时间，增加了试剂的稳定性。金颗粒与蛋白质靠静电引力作用而形成结合物，此物理过程不破坏蛋白质结构从而保持了蛋白质的原有活性。免疫渗滤技术通过免疫浓缩(immuno concentration)作用，使渗滤过程中存在于液相的抗体与固相载体上的抗原结合机会增加，大大缩短了抗原抗体反应达到平衡的时间。点免疫金渗滤测定法与ELISA法对比结果显示：点免疫金渗滤测定法具有较高的敏感性(92.3%)、特异性(99.4%)和符合率(99.5%)。该法重复性较好且试剂稳定，是现有检测弓形虫抗体方法中操作最简便、反应时间最短的方法，在弓形虫感染的诊断和流行病学调查中具有重要的应用价值。
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参考文献
[1]Houiman R E,Raymond R,Renton N,et al.The diagnosis of toxoplasmosis using IgG avidity.Epidemiol Infect，1994，112：399
[2]Spielberg F,Ryder R W,Harris J,et al.Field testing and comparative evaluation of rapid,visually read screening assay for antibody to human immunodeficiency virus.Lancet，1989，1：580
[3]Noel I,Balfour A H,Wilcox M H.Toxoplasma infection and systemic lupus erythematosus:analysis of the serological response by immunoblotting.J Clin Pathol，1993，46：628
, http://www.100md.com
[4]Wong S Y,Hajdu M P,Ramirez R,et al.Role of IgE in diagnosis of acute toxoplasma infection and toxoplasmosis.J Clin Microbiol，1993，31：2 952
[5]Subauste C S,Remington J S.Immunity to Toxoplasma gondii.Curr opin Immunol.1993，5：532
[6]Kim K,Bulow R,Kampmeier J,et al.Conformationally appropriate expression of the Toxoplasma antigen SAG1(p30)in CHO cells. Infect Immun 1994，62：203
(1998-09-28收稿，1998-02-05修回), 百拇医药