变性梯度凝胶电泳中PCR实验条件的探讨
作者：王玉明 段勇 赵淮 宋滇平 刘华 张秋霞
单位：昆明医学院附属第一医院，昆明650032
关键词：聚合酶链反应；变性梯度凝胶电泳；碱基片段
变性梯度凝胶电泳中PCR实验条件的探讨 变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)能可靠快速地检测含有一个碱基突变、达536 bp的DNA片段。当结合PCR技术后，在一个引物的5′端加入30～50 bp的GC片段(GC-clamp)，进行PCR反应，把带有较高解链温度GC片段的扩增产物DNA放到有梯度的尿素和甲酰胺作为变性剂的聚炳烯凝胶中进行电泳，由于正常与单点突变的DNA系列稍有不同，使得这些带有较高解链温度GC片段DNA在相同的变性剂中有不同的解链点。从而几乎能检测到所有的突变，达到较高的敏感性。但由于引物富含GC碱基，为了使反应的效率一致，需逐一对PCR的反应条件进行确定。现以胰高血糖素受体基因第九外显子为对象，探讨PCR的反应条件。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器 PE 9600基因扩增仪；Bio-Rad Power Pac3000型电泳仪、DGGE System电泳系统和Gel Doc1000图像分析系统。
1.1.2 主要试剂 寡核苷酸引物，胰高血糖素受体基因的第九外显子的寡核苷酸引物：上游引物，在5′端加入40个GC碱 基：5′-CGCCGCCGCCGCCCGCGCCGCCGCCGCC-
CGCGCCGCCGCCTGTGCCCCAGTATGTGAGTG-3′和下游引物：5′-AGACAGGATGCTGCT GTCTC-3′，扩增片段长度为231个碱基，上海生工生物工程公司；dNTP，Promega；TaqDNA聚合酶，华美生物工程公司；甲酰胺，尿素，BIO-RAD；DNA标准分子量；琼脂糖。
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1.1.3 模板制备 从人外周血白细胞中用酚/氯仿法提取DNA为模板。
1.2 方法
PCR反应体系的基本组成为，模板2 μl；其余组份的最终浓度分别为dNTP 150 μmol/L；引物0.6 μmol/L；Taq聚合酶1.5 U；10倍反应缓冲液3 μl；镁离子1.0 mmol/L，加重蒸水至30 μl，再加入40 μl的石蜡油，然后94℃加热5 min。反应程序如下：94℃ 1 min；62℃ 1 min和72℃ 1 min，共33个循环，然后72℃ 5 min为最后的延伸阶段。基本组成以外的其它变化在结果部分进行描述。
用20 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测DNA扩增产物，电泳条件：电压100 V，时间45 min；1 mg/L溴化乙锭染色，Gel Doc 1000图像分析系统观察196 bp的产物片段。
, 百拇医药 2 结果
2.1 变性温度 在88～96℃内每间隔2℃设系列变性温度。结果表明，88℃和90℃无区带，最适变性温度为94℃。94℃以上，随着温度的增加，扩增产物反而减少。
2.2 退火温度 在56～68℃内，每间隔3℃设系列退火温度。结果表明，最适的退火温度为59℃和62℃，与通过计算所得的未加入GC-clamp的引物Tm值62℃基本相符。
2.3 引物浓度 在0.2～1 μmol/L，每间隔0.2 μmol/L设系列引物浓度。研究表明，在0.2～0.8 μmol/L内，有扩增产物，其中最适的引物浓度为0.4～0.6 μmol/L。
2.4 酶浓度 在0.5～2.5 U，每间隔0.5 U设系列Taq酶量。实验表明：0.5 U的酶用量可得到满意的阳性结果，1.5 U酶量得到最为满意的结果。
, http://www.100md.com
2.5 dNTP浓度 在50～200 μmol/L范围，每间隔25 μmol/L设系列dNTP浓度。实验表明，当dNTP浓度从75 μmol/L开始，区带随浓度的增加而加深，其最适dNTP浓度为150 μmol/L。
2.6 镁离子浓度 在0.5～3.0 mmol/L内，每间隔0.5 mmol/L设系列镁离子浓度。实验表明，最适的镁离子浓度为1.0 mmol/L。
2.7 循环次数 当其它扩增条件确定后，设扩增的循环次数分别为25、35、45、55和65个。结果表明，以35个循环的产物量较为理想。
3 讨论
由于PCR实验易受到污染、聚合酶抑制剂和不适宜反应条件等因素的影响而导致假阴性或假阳性结果。因而在每一种PCR的方法应用于科研和临床常规实验之前，为了保证实验的可靠性和准确性，必须对影响反应结果的因素进行研究。
针对DGGE技术中的PCR要求，需在一个引物的一端加上一个富含GC碱基的片段，因而需确定影响PCR反应的各种最适实验条件，使得反应的效率一致，为进一步用DGGE技术筛查其是否存在DNA点突变打下基础。从本文对退火温度、变性温度、引物浓度、Taq酶的用量、dNTP的浓度、镁离子浓度和扩增次数等影响PCR反应的因素进行研究的结果可看出，任何实验条件偏离最佳实验条件将导致扩增无产物或非特异性产物，将影响PCR实验的可靠性。
(1998-01-23收稿，1998-09-27修回), 百拇医药
单位：昆明医学院附属第一医院，昆明650032
关键词：聚合酶链反应；变性梯度凝胶电泳；碱基片段
变性梯度凝胶电泳中PCR实验条件的探讨 变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)能可靠快速地检测含有一个碱基突变、达536 bp的DNA片段。当结合PCR技术后，在一个引物的5′端加入30～50 bp的GC片段(GC-clamp)，进行PCR反应，把带有较高解链温度GC片段的扩增产物DNA放到有梯度的尿素和甲酰胺作为变性剂的聚炳烯凝胶中进行电泳，由于正常与单点突变的DNA系列稍有不同，使得这些带有较高解链温度GC片段DNA在相同的变性剂中有不同的解链点。从而几乎能检测到所有的突变，达到较高的敏感性。但由于引物富含GC碱基，为了使反应的效率一致，需逐一对PCR的反应条件进行确定。现以胰高血糖素受体基因第九外显子为对象，探讨PCR的反应条件。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器 PE 9600基因扩增仪；Bio-Rad Power Pac3000型电泳仪、DGGE System电泳系统和Gel Doc1000图像分析系统。
1.1.2 主要试剂 寡核苷酸引物，胰高血糖素受体基因的第九外显子的寡核苷酸引物：上游引物，在5′端加入40个GC碱 基：5′-CGCCGCCGCCGCCCGCGCCGCCGCCGCC-
CGCGCCGCCGCCTGTGCCCCAGTATGTGAGTG-3′和下游引物：5′-AGACAGGATGCTGCT GTCTC-3′，扩增片段长度为231个碱基，上海生工生物工程公司；dNTP，Promega；TaqDNA聚合酶，华美生物工程公司；甲酰胺，尿素，BIO-RAD；DNA标准分子量；琼脂糖。
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1.1.3 模板制备 从人外周血白细胞中用酚/氯仿法提取DNA为模板。
1.2 方法
PCR反应体系的基本组成为，模板2 μl；其余组份的最终浓度分别为dNTP 150 μmol/L；引物0.6 μmol/L；Taq聚合酶1.5 U；10倍反应缓冲液3 μl；镁离子1.0 mmol/L，加重蒸水至30 μl，再加入40 μl的石蜡油，然后94℃加热5 min。反应程序如下：94℃ 1 min；62℃ 1 min和72℃ 1 min，共33个循环，然后72℃ 5 min为最后的延伸阶段。基本组成以外的其它变化在结果部分进行描述。
用20 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测DNA扩增产物，电泳条件：电压100 V，时间45 min；1 mg/L溴化乙锭染色，Gel Doc 1000图像分析系统观察196 bp的产物片段。
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2.1 变性温度 在88～96℃内每间隔2℃设系列变性温度。结果表明，88℃和90℃无区带，最适变性温度为94℃。94℃以上，随着温度的增加，扩增产物反而减少。
2.2 退火温度 在56～68℃内，每间隔3℃设系列退火温度。结果表明，最适的退火温度为59℃和62℃，与通过计算所得的未加入GC-clamp的引物Tm值62℃基本相符。
2.3 引物浓度 在0.2～1 μmol/L，每间隔0.2 μmol/L设系列引物浓度。研究表明，在0.2～0.8 μmol/L内，有扩增产物，其中最适的引物浓度为0.4～0.6 μmol/L。
2.4 酶浓度 在0.5～2.5 U，每间隔0.5 U设系列Taq酶量。实验表明：0.5 U的酶用量可得到满意的阳性结果，1.5 U酶量得到最为满意的结果。
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2.5 dNTP浓度 在50～200 μmol/L范围，每间隔25 μmol/L设系列dNTP浓度。实验表明，当dNTP浓度从75 μmol/L开始，区带随浓度的增加而加深，其最适dNTP浓度为150 μmol/L。
2.6 镁离子浓度 在0.5～3.0 mmol/L内，每间隔0.5 mmol/L设系列镁离子浓度。实验表明，最适的镁离子浓度为1.0 mmol/L。
2.7 循环次数 当其它扩增条件确定后，设扩增的循环次数分别为25、35、45、55和65个。结果表明，以35个循环的产物量较为理想。
3 讨论
由于PCR实验易受到污染、聚合酶抑制剂和不适宜反应条件等因素的影响而导致假阴性或假阳性结果。因而在每一种PCR的方法应用于科研和临床常规实验之前，为了保证实验的可靠性和准确性，必须对影响反应结果的因素进行研究。
针对DGGE技术中的PCR要求，需在一个引物的一端加上一个富含GC碱基的片段，因而需确定影响PCR反应的各种最适实验条件，使得反应的效率一致，为进一步用DGGE技术筛查其是否存在DNA点突变打下基础。从本文对退火温度、变性温度、引物浓度、Taq酶的用量、dNTP的浓度、镁离子浓度和扩增次数等影响PCR反应的因素进行研究的结果可看出，任何实验条件偏离最佳实验条件将导致扩增无产物或非特异性产物，将影响PCR实验的可靠性。
(1998-01-23收稿，1998-09-27修回), 百拇医药