2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基)苯酚显色法测定尿钴
作者：高晓钦 李德芬 谢吉民 朱卫华 许艳萍
单位：镇江医学院，江苏镇江 212001
关键词：钴；2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基)苯酚；分光光度法；尿
2摘要 为了建立测定尿液中钴含量的化学方法。依据钴与2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基)苯酚及Triton X-100在pH5.2缓冲液中生成稳定的红色配合物，经12 mol/L硫酸酸化后，用分光光度计进行测定。本法具有较高的灵敏度[ε＝8.26×104 L/(mol.cm)]和较好的选择性，最低检出浓度为3.8 μg/L，变异系数为4.6%。对于20 ml尿样，加入不同量钴0.2～0.4 μg，回收率为93.0%～102.5%之间，结果较为满意。
钴是人体必需的微量元素之一，研究证明，钴对铁的代谢，血红蛋白的合成，红细胞的发育成熟以及成熟血细胞的释放等，均有重要的生理功能。特别是钴作为维生素B12的主要有效成份及其它钴化物的组成部分，发挥着高效能的生血作用。此外，钴还参与蛋白质的合成、叶酸的贮存、硫醇酶的活化以及骨髓磷脂的形成[1]。人体及动物体内的钴主要由尿内排泄，因此，研究尿液中钴含量的测定方法，对于研究钴与人体健康的关系是十分必要的。
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2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基)苯酚(5-Br-PADAP)属吡啶偶氮染料，对很多过渡金属离子都是一个较灵敏的显色剂[2]。我们用该试剂作为显色剂，对尿液中钴含量的方法进行了测定，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 试剂 5-Br-PADAP(北京化工厂)：1.15×10-3 mol/L乙醇溶液。钴标准溶液：用钴盐配成1 mg/ml标准储备液，使用时稀释成1 μg/ml的标准使用液。NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液：pH5.2。2%(V/V)Triton X-100水溶液。消化液：HNO3:HClO4＝4:1(V/V)。NH2OH.HCl水溶液：1.44 mol/L。所有试剂均为AR级。
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1.2 试验方法
1.2.1 尿液的消化 留取24 h尿于洗净的尿液收集瓶中，取20 ml尿液于50 ml三角烧杯中，加9 ml消化液，置电热板上缓缓加热至白烟冒尽消失，残渣洁白为止。
1.2.2 测定 消化后的样品残渣加少量双蒸水溶解，用1 mol/L的NaOH调节至pH 5左右，全部移入10 ml的容量瓶中，加pH 5.2的NaH2PO4-Na3HPO4缓冲液1 ml，加入10%的盐酸羟胺溶液2滴，摇匀后加入2% Triton X-100溶液0.6 ml和5-Br-PADAP 0.5 ml，再加入无水乙醇2 ml，摇匀，放置15 min。加0.8 ml 12 mol/L的H2SO4酸化，用双蒸水定容至10 ml，摇匀后静置15 min。用1 cm比色皿于波长590 nm以试剂空白作参比测定吸光度，通过标准曲线计算尿液中的钴含量。
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2 结果与讨论
2.1 最佳实验条件选择
2.1.1 缓冲液pH值的影响 钴配合物在pH4.0～6.0时吸光度变化不大，在pH 5.2时吸光度最大，本文取pH 5.2。
2.1.2 显色剂用量的影响 试验表明，当Co2+浓度为0.5 μg/10 ml时，显色剂5-Br-PADAP用量以0.2～0.8 ml为好，本文取0.5 ml。
2.1.3 配合物的稳定性试验 显色后放置10 min，吸光度达到最大且稳定，酸化前其吸光度至少24 h内保持稳定；加入12 mol/L的H2SO4酸化后，10 min显色稳定，至少8 h内其吸光度不变。本文酸化前显色时间选用15 min，酸化后显色时间也选用15 min。
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2.1.4 非离子表面活性剂的影响 加入非离子表面活性剂Triton X-100可作为增溶、增敏、增稳稳定剂[3]，经试验取2% Triton X-100 0.6 ml为宜。
2.1.5 乙醇的影响 试验表明，乙醇的加入能显著改变配合物的吸收光谱，使吸收峰变尖(见图1)。因此，乙醇的加入能提高测定钴的特异性。本文选用加入无水乙醇2 ml。
2.1.6 干扰离子的影响及消除 5-Br-PADAP试剂显色灵敏度高，但选择性较差，它几乎能与所有的过渡金属离子形成有色配合物。但在试验条件(pH5.2)下，仅能与Co2+、Cu2+、Ni2+、Fe2+产生定量反应[4]。在加入12 mol/L H2SO4酸化后，28 μg的Cu2+、2 μg的Ni2+、50 μg的Fe2+不干扰钴的测定，这是因为上述干扰离子与5-Br-PADAP形成的配合物在强酸性溶液中迅速分解，此时仅Co2+的配合物保持稳定不受影响。
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2.1.7 吸收曲线 见图1，在以上的试验条件下，钴与5-Br-PADAP形成红色的配合物，于波长584～592 nm处吸光度最大，与文献[5]一致。本文选用590 nm作为测量波长，在UV-210型紫外可见分光光度计(岛津)上测量。
图1 配合物吸收曲线(以试剂空白为参比)
2.2 标准曲线的绘制及灵敏度 取7只10 ml的容量瓶，分别加入Co2+标准使用液(1 μg/ml)0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 ml，用本文选用的方法进行测定。
结果表明，钴含量在0.00～3.00 μg/10 ml范围内服从朗伯-比耳定律，其线性回归方程为：Y＝0.132X+0.0083(Y为吸光度；X为浓度，单位μg/10 ml)，r＝0.99997，表观摩尔吸光系数ε590＝8.26×104L/(mol*cm)，最低检出浓度为3.8 μg/L。
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2.3 重复性试验 将一份混合尿样分为10份，按本法测定钴含量，得
±s为10.4±0.48 μg/L，批内CV为4.6%。
2.4 回收试验 取20 ml钴11.6 μg/L的尿样,分别加入0.2 μg、0.3 μg、0.4 μg钴作为试验样本,与未加钴的空白尿样在相同条件下消化,然后测定钴的回收率分别为102.5%、98.7%、93%,平均回收率为98.1%。
2.5 尿液中钴含量测定 应用本法测定了38例男女健康大学生(男20，女18)尿液中的钴含量，男性为18.66±3.86 μg/24 h，女性为16.23±3.02 μg/24 h。
(本文得到我院陈修玮副教授的指导，在此致谢!)
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参考文献
[1]王夔.生命科学中的微量元素.下册.北京：中国计量出版社，1992，61～70
[2]马卫兴.5-Br-PADAP在分析化学中的应用进展.理化检验-化学分册，1994，30(3)：52
[3]徐亚萍.5-Br-PADAP胶束增溶光度法测定矿泉水及饮用水中微量钴.中国卫生检验杂志，1994，4(2)：88
[4]周天泽，谢永明，秦学敏，等.用电子计算技术处理有机试剂的多组分体系.化学试剂，1982，4(3)：182
[5]金伟.2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚在光度分析应用中的新进展.理化检验-化学分册，1995，31(1)：53，(1998-09-28收稿，1999-02-26修回), http://www.100md.com
单位：镇江医学院，江苏镇江 212001
关键词：钴；2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基)苯酚；分光光度法；尿
2摘要 为了建立测定尿液中钴含量的化学方法。依据钴与2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基)苯酚及Triton X-100在pH5.2缓冲液中生成稳定的红色配合物，经12 mol/L硫酸酸化后，用分光光度计进行测定。本法具有较高的灵敏度[ε＝8.26×104 L/(mol.cm)]和较好的选择性，最低检出浓度为3.8 μg/L，变异系数为4.6%。对于20 ml尿样，加入不同量钴0.2～0.4 μg，回收率为93.0%～102.5%之间，结果较为满意。
钴是人体必需的微量元素之一，研究证明，钴对铁的代谢，血红蛋白的合成，红细胞的发育成熟以及成熟血细胞的释放等，均有重要的生理功能。特别是钴作为维生素B12的主要有效成份及其它钴化物的组成部分，发挥着高效能的生血作用。此外，钴还参与蛋白质的合成、叶酸的贮存、硫醇酶的活化以及骨髓磷脂的形成[1]。人体及动物体内的钴主要由尿内排泄，因此，研究尿液中钴含量的测定方法，对于研究钴与人体健康的关系是十分必要的。
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2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基)苯酚(5-Br-PADAP)属吡啶偶氮染料，对很多过渡金属离子都是一个较灵敏的显色剂[2]。我们用该试剂作为显色剂，对尿液中钴含量的方法进行了测定，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 试剂 5-Br-PADAP(北京化工厂)：1.15×10-3 mol/L乙醇溶液。钴标准溶液：用钴盐配成1 mg/ml标准储备液，使用时稀释成1 μg/ml的标准使用液。NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液：pH5.2。2%(V/V)Triton X-100水溶液。消化液：HNO3:HClO4＝4:1(V/V)。NH2OH.HCl水溶液：1.44 mol/L。所有试剂均为AR级。
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1.2 试验方法
1.2.1 尿液的消化 留取24 h尿于洗净的尿液收集瓶中，取20 ml尿液于50 ml三角烧杯中，加9 ml消化液，置电热板上缓缓加热至白烟冒尽消失，残渣洁白为止。
1.2.2 测定 消化后的样品残渣加少量双蒸水溶解，用1 mol/L的NaOH调节至pH 5左右，全部移入10 ml的容量瓶中，加pH 5.2的NaH2PO4-Na3HPO4缓冲液1 ml，加入10%的盐酸羟胺溶液2滴，摇匀后加入2% Triton X-100溶液0.6 ml和5-Br-PADAP 0.5 ml，再加入无水乙醇2 ml，摇匀，放置15 min。加0.8 ml 12 mol/L的H2SO4酸化，用双蒸水定容至10 ml，摇匀后静置15 min。用1 cm比色皿于波长590 nm以试剂空白作参比测定吸光度，通过标准曲线计算尿液中的钴含量。
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2 结果与讨论
2.1 最佳实验条件选择
2.1.1 缓冲液pH值的影响 钴配合物在pH4.0～6.0时吸光度变化不大，在pH 5.2时吸光度最大，本文取pH 5.2。
2.1.2 显色剂用量的影响 试验表明，当Co2+浓度为0.5 μg/10 ml时，显色剂5-Br-PADAP用量以0.2～0.8 ml为好，本文取0.5 ml。
2.1.3 配合物的稳定性试验 显色后放置10 min，吸光度达到最大且稳定，酸化前其吸光度至少24 h内保持稳定；加入12 mol/L的H2SO4酸化后，10 min显色稳定，至少8 h内其吸光度不变。本文酸化前显色时间选用15 min，酸化后显色时间也选用15 min。
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2.1.4 非离子表面活性剂的影响 加入非离子表面活性剂Triton X-100可作为增溶、增敏、增稳稳定剂[3]，经试验取2% Triton X-100 0.6 ml为宜。
2.1.5 乙醇的影响 试验表明，乙醇的加入能显著改变配合物的吸收光谱，使吸收峰变尖(见图1)。因此，乙醇的加入能提高测定钴的特异性。本文选用加入无水乙醇2 ml。
2.1.6 干扰离子的影响及消除 5-Br-PADAP试剂显色灵敏度高，但选择性较差，它几乎能与所有的过渡金属离子形成有色配合物。但在试验条件(pH5.2)下，仅能与Co2+、Cu2+、Ni2+、Fe2+产生定量反应[4]。在加入12 mol/L H2SO4酸化后，28 μg的Cu2+、2 μg的Ni2+、50 μg的Fe2+不干扰钴的测定，这是因为上述干扰离子与5-Br-PADAP形成的配合物在强酸性溶液中迅速分解，此时仅Co2+的配合物保持稳定不受影响。
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2.1.7 吸收曲线 见图1，在以上的试验条件下，钴与5-Br-PADAP形成红色的配合物，于波长584～592 nm处吸光度最大，与文献[5]一致。本文选用590 nm作为测量波长，在UV-210型紫外可见分光光度计(岛津)上测量。
图1 配合物吸收曲线(以试剂空白为参比)
2.2 标准曲线的绘制及灵敏度 取7只10 ml的容量瓶，分别加入Co2+标准使用液(1 μg/ml)0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 ml，用本文选用的方法进行测定。
结果表明，钴含量在0.00～3.00 μg/10 ml范围内服从朗伯-比耳定律，其线性回归方程为：Y＝0.132X+0.0083(Y为吸光度；X为浓度，单位μg/10 ml)，r＝0.99997，表观摩尔吸光系数ε590＝8.26×104L/(mol*cm)，最低检出浓度为3.8 μg/L。
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2.3 重复性试验 将一份混合尿样分为10份，按本法测定钴含量，得
±s为10.4±0.48 μg/L，批内CV为4.6%。2.4 回收试验 取20 ml钴11.6 μg/L的尿样,分别加入0.2 μg、0.3 μg、0.4 μg钴作为试验样本,与未加钴的空白尿样在相同条件下消化,然后测定钴的回收率分别为102.5%、98.7%、93%,平均回收率为98.1%。
2.5 尿液中钴含量测定 应用本法测定了38例男女健康大学生(男20，女18)尿液中的钴含量，男性为18.66±3.86 μg/24 h，女性为16.23±3.02 μg/24 h。
(本文得到我院陈修玮副教授的指导，在此致谢!)
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参考文献
[1]王夔.生命科学中的微量元素.下册.北京：中国计量出版社，1992，61～70
[2]马卫兴.5-Br-PADAP在分析化学中的应用进展.理化检验-化学分册，1994，30(3)：52
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[4]周天泽，谢永明，秦学敏，等.用电子计算技术处理有机试剂的多组分体系.化学试剂，1982，4(3)：182
[5]金伟.2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚在光度分析应用中的新进展.理化检验-化学分册，1995，31(1)：53，(1998-09-28收稿，1999-02-26修回), http://www.100md.com