尿雌酮结合物的酶免疫检测法及其意义
作者：陈海燕 宋玲 邱清 王心如
单位：南京医科大学应用毒理研究所，南京210029
关键词：尿；雌酮结合物；酶免疫检测法；早孕
临床检验杂志990305 摘要 为了观察育龄妇女尿雌酮结合物的变化和临床意义，建立了尿雌酮结合物的酶免检测法，测定正常妇女10个月经周期每日晨尿中的E1C(雌酮结合物)，同时还分析了血清雌二醇与尿液E1C变化曲线之间的关系。结果表明，E1C在卵泡早期和中期浓度较低，排卵前浓度明显升高，于排卵当天达到高峰；黄体早期下降，于黄体中期再次升高，下一次月经周期前回到基线水平。E1C升高的时间先于HCG，可作为早孕和胚胎植入的有效指标。
用酶免疫方法测定正常育龄妇女10个月经周期每日晨尿中的雌酮结合物(E1C)，建立尿E1C的酶免疫测定方法，并同步测定血清雌二醇浓度的变化作为参照，观察尿液E1C的改变及其临床意义。
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1 材料和方法
1.1 仪器 Ceres900 Scanning Autoreader自动酶标仪。
1.2 试剂
1.2.1 包被液 取抗E1C多克隆抗体(1∶10)(美国Tilson公司提供)用酶免包被缓冲液(0.05 mol/L pH 9.6)进行1∶400稀释。
1.2.2 E1C标准品 由Sigma公司提供，E1C标准溶液浓度分别为5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125和0.1563 ng/ml。
1.2.3 辣根过氧化物酶标记的E1C(E1C-HRP) 用磷酸盐缓冲液将E1C-HRP(1∶100)贮存液作1∶750稀释。
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1.2.4 ELISA显色底物(ABTS) 由Sigma公司提供，ABTS溶解在0.05 mmol/L柠檬酸盐缓冲液中(含1.6 mmol/L H2O2)，浓度为0.4 mmol/L。
1.3 标本的采集 正常育龄妇女10名，从月经周期的第一天开始自我收集每日的晨尿，共10个未孕周期的尿样，另1名正常育龄期妇女自愿收集一个月经周期的晨尿，并于每日上午抽取静脉血。样品自我收集后至检测前均在-20℃冰箱内保存。
1.4 数据处理 所有的数据均用Sigma plot软件进行计算、作图。
1.5 E1C测定 将包被液加入96孔板，每孔50 μl，封板，室温下过夜。24小时后，用洗板器洗板2分钟，并在吸水纸上拍干。立即加入磷酸缓冲液(0.1 mol/L pH 7.0，含1 g/L BSA)50 μl，平衡30分钟到2小时。每孔加入40 μl 1∶50稀释的尿样、标准或内对照等，反应30分钟。每孔加入50 μl E1C-HRP封板，过夜。倒出平板中液体，洗板2分钟，在吸水纸上拍干。加入反应底物ABTS，在自动摇床上摇动，约35到60分钟。检测终点以平板中最高吸光度，即零标准孔吸光度达到1.000为准。并自动将吸光度转化成EIA数据，绘制标准曲线，计算出待测样本中的E1C含量。
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1.6 肌酐测定 96孔板B行各孔加入100 μl标准和内控，C-H行每孔加入50 μl蒸馏水后再加入50 μl 1∶50稀释的尿样。各孔加入50 μl 0.75 mol/L NaOH及0.04 mol/L苦味酸。测定吸光度值，计算肌酐浓度。
1.7 血清雌二醇的检测 利用德普公司提供的放免试剂盒测定。
2 结果
通过对月经周期的每日晨尿进行E1C检测，可见卵泡期，尿液中E1C水平恒定在基础水平，排卵前尿E1C水平迅速上升，随后下降至基线水平；黄体中期尿E1C再次升高，在下一次月经来潮后又回复到基线水平(见图)。本实验中所观察的10个月经周期，来源于10位正常育龄妇女，其月经周期长度为24～31天(平均为28.2±2.30天)。以尿促性腺激素峰值作为排卵的标记[1]，可以得到排卵时间平均为周期的第14.4±2.3天(第12～19天)；10个周期中有4个周期在排卵当天出现E1C峰；有2个周期在排卵前一天出现E1C峰；有2个周期在排卵后一天出现E1C峰；有2个周期在排卵后二天出现E1C峰。尿E1C达到峰值时浓度为134.68±63.67 ng/mgCr。黄体期峰值出现于排卵后7.5±2.2天(4～10天)，峰值浓度为87.88±25.01 ng/mgCr。
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运用放免试剂盒测定血清中的雌二醇。对某一28天月经周期中的27天尿样及其中21天血清样本进行检测。血清雌二醇与尿液E1C之间周期性变化基本一致，尿液E1C比血清雌二醇滞后一天，排卵后尿E1C趋于比血清雌二醇滞后2或3天(图)。
横座标0表示月经周期中的中期FSH峰出现的时间
图1 某一正常育龄妇女月经周期中尿液E1C与血液E2的变化
在测定E1C时，同时测定肌酐，用肌酐校正E1C值以排除尿液浓缩或稀释对激素水平的影响。
该方法灵敏度为4.8 ng/ml，尿液高(1∶10)低(1∶40)浓度的板间变异系数分别为12.5%和8.6%，板内变异系数分别为10.5%和3.8%。高低浓度尿E1C的回收率分别为88.7%和91.4%。
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3 讨论
雌激素是主要由卵巢分泌的类固醇激素，经肝脏酶水解结合反应转化为多种代谢产物，并经尿液排泄。其中E1C为其代谢产物之一。
本文通过对10位正常育龄妇女10个正常月经周期的每日晨尿进行E1C检测，结果发现：卵泡早期和中期E1C浓度较低，排卵前E1C浓度明显升高，于排卵当天达到高峰。黄体早期下降，于黄体中期再次升高，在下一次月经周期前回到基线水平。因雌激素水平在月经周期中不断改变，临床上某一次血清雌二醇的检测不具有完全的代表性，而多次采血也给受检者带来创伤；另外放射免疫法测定，依赖于放射性同位素，费时，又具有放射性污染。鉴于血清雌二醇检测有以上的不足，我们将注意力集中到尿液E1C的检测。分析尿中雌激素代谢产物具有方便、省时、省力，收集样本容易等优点。
研究发现在预测排卵方面，血清检测与尿液雌激素代谢产物的检测作用相当，排卵前雌激素代谢产物E1C的升高，可用于预测排卵。
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目前我们检测早孕主要是根据血清或尿液中人绒毛膜促性腺激素(hCG)的升高来判断，由于胚胎植入时，尿中E1C大量升高，其升高的时间先于可检测到的hCG的升高，所以E1C可以成为检测早孕和胚胎植入的有效的指标，特别是在人工体外受精中，使用了大量的外源性促性腺激素，这时候通过测定尿液中雌酮结合物来判断早早孕非常有用[2]。
参考文献
[1]Qiu Q,Kuo A,Todd H,et al.Enzyme immunoassay method for urinary follicle stimulating hormone(FSH)beta subunit and its application for measurement for total urinary FSH.Fertility and Sterility,1998,69(2):278
[2]Lasley B L,Stabenfeldt G H,Overstreet J W,et al.Urinary hormone levels at the time of ovulation and implantation.Fertil Steril 1985,43(6):861
(1998-08-18收稿，1999-01-28修回), 百拇医药
单位：南京医科大学应用毒理研究所，南京210029
关键词：尿；雌酮结合物；酶免疫检测法；早孕
临床检验杂志990305 摘要 为了观察育龄妇女尿雌酮结合物的变化和临床意义，建立了尿雌酮结合物的酶免检测法，测定正常妇女10个月经周期每日晨尿中的E1C(雌酮结合物)，同时还分析了血清雌二醇与尿液E1C变化曲线之间的关系。结果表明，E1C在卵泡早期和中期浓度较低，排卵前浓度明显升高，于排卵当天达到高峰；黄体早期下降，于黄体中期再次升高，下一次月经周期前回到基线水平。E1C升高的时间先于HCG，可作为早孕和胚胎植入的有效指标。
用酶免疫方法测定正常育龄妇女10个月经周期每日晨尿中的雌酮结合物(E1C)，建立尿E1C的酶免疫测定方法，并同步测定血清雌二醇浓度的变化作为参照，观察尿液E1C的改变及其临床意义。
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1 材料和方法
1.1 仪器 Ceres900 Scanning Autoreader自动酶标仪。
1.2 试剂
1.2.1 包被液 取抗E1C多克隆抗体(1∶10)(美国Tilson公司提供)用酶免包被缓冲液(0.05 mol/L pH 9.6)进行1∶400稀释。
1.2.2 E1C标准品 由Sigma公司提供，E1C标准溶液浓度分别为5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125和0.1563 ng/ml。
1.2.3 辣根过氧化物酶标记的E1C(E1C-HRP) 用磷酸盐缓冲液将E1C-HRP(1∶100)贮存液作1∶750稀释。
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1.2.4 ELISA显色底物(ABTS) 由Sigma公司提供，ABTS溶解在0.05 mmol/L柠檬酸盐缓冲液中(含1.6 mmol/L H2O2)，浓度为0.4 mmol/L。
1.3 标本的采集 正常育龄妇女10名，从月经周期的第一天开始自我收集每日的晨尿，共10个未孕周期的尿样，另1名正常育龄期妇女自愿收集一个月经周期的晨尿，并于每日上午抽取静脉血。样品自我收集后至检测前均在-20℃冰箱内保存。
1.4 数据处理 所有的数据均用Sigma plot软件进行计算、作图。
1.5 E1C测定 将包被液加入96孔板，每孔50 μl，封板，室温下过夜。24小时后，用洗板器洗板2分钟，并在吸水纸上拍干。立即加入磷酸缓冲液(0.1 mol/L pH 7.0，含1 g/L BSA)50 μl，平衡30分钟到2小时。每孔加入40 μl 1∶50稀释的尿样、标准或内对照等，反应30分钟。每孔加入50 μl E1C-HRP封板，过夜。倒出平板中液体，洗板2分钟，在吸水纸上拍干。加入反应底物ABTS，在自动摇床上摇动，约35到60分钟。检测终点以平板中最高吸光度，即零标准孔吸光度达到1.000为准。并自动将吸光度转化成EIA数据，绘制标准曲线，计算出待测样本中的E1C含量。
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1.6 肌酐测定 96孔板B行各孔加入100 μl标准和内控，C-H行每孔加入50 μl蒸馏水后再加入50 μl 1∶50稀释的尿样。各孔加入50 μl 0.75 mol/L NaOH及0.04 mol/L苦味酸。测定吸光度值，计算肌酐浓度。
1.7 血清雌二醇的检测 利用德普公司提供的放免试剂盒测定。
2 结果
通过对月经周期的每日晨尿进行E1C检测，可见卵泡期，尿液中E1C水平恒定在基础水平，排卵前尿E1C水平迅速上升，随后下降至基线水平；黄体中期尿E1C再次升高，在下一次月经来潮后又回复到基线水平(见图)。本实验中所观察的10个月经周期，来源于10位正常育龄妇女，其月经周期长度为24～31天(平均为28.2±2.30天)。以尿促性腺激素峰值作为排卵的标记[1]，可以得到排卵时间平均为周期的第14.4±2.3天(第12～19天)；10个周期中有4个周期在排卵当天出现E1C峰；有2个周期在排卵前一天出现E1C峰；有2个周期在排卵后一天出现E1C峰；有2个周期在排卵后二天出现E1C峰。尿E1C达到峰值时浓度为134.68±63.67 ng/mgCr。黄体期峰值出现于排卵后7.5±2.2天(4～10天)，峰值浓度为87.88±25.01 ng/mgCr。
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运用放免试剂盒测定血清中的雌二醇。对某一28天月经周期中的27天尿样及其中21天血清样本进行检测。血清雌二醇与尿液E1C之间周期性变化基本一致，尿液E1C比血清雌二醇滞后一天，排卵后尿E1C趋于比血清雌二醇滞后2或3天(图)。
横座标0表示月经周期中的中期FSH峰出现的时间
图1 某一正常育龄妇女月经周期中尿液E1C与血液E2的变化
在测定E1C时，同时测定肌酐，用肌酐校正E1C值以排除尿液浓缩或稀释对激素水平的影响。
该方法灵敏度为4.8 ng/ml，尿液高(1∶10)低(1∶40)浓度的板间变异系数分别为12.5%和8.6%，板内变异系数分别为10.5%和3.8%。高低浓度尿E1C的回收率分别为88.7%和91.4%。
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3 讨论
雌激素是主要由卵巢分泌的类固醇激素，经肝脏酶水解结合反应转化为多种代谢产物，并经尿液排泄。其中E1C为其代谢产物之一。
本文通过对10位正常育龄妇女10个正常月经周期的每日晨尿进行E1C检测，结果发现：卵泡早期和中期E1C浓度较低，排卵前E1C浓度明显升高，于排卵当天达到高峰。黄体早期下降，于黄体中期再次升高，在下一次月经周期前回到基线水平。因雌激素水平在月经周期中不断改变，临床上某一次血清雌二醇的检测不具有完全的代表性，而多次采血也给受检者带来创伤；另外放射免疫法测定，依赖于放射性同位素，费时，又具有放射性污染。鉴于血清雌二醇检测有以上的不足，我们将注意力集中到尿液E1C的检测。分析尿中雌激素代谢产物具有方便、省时、省力，收集样本容易等优点。
研究发现在预测排卵方面，血清检测与尿液雌激素代谢产物的检测作用相当，排卵前雌激素代谢产物E1C的升高，可用于预测排卵。
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目前我们检测早孕主要是根据血清或尿液中人绒毛膜促性腺激素(hCG)的升高来判断，由于胚胎植入时，尿中E1C大量升高，其升高的时间先于可检测到的hCG的升高，所以E1C可以成为检测早孕和胚胎植入的有效的指标，特别是在人工体外受精中，使用了大量的外源性促性腺激素，这时候通过测定尿液中雌酮结合物来判断早早孕非常有用[2]。
参考文献
[1]Qiu Q,Kuo A,Todd H,et al.Enzyme immunoassay method for urinary follicle stimulating hormone(FSH)beta subunit and its application for measurement for total urinary FSH.Fertility and Sterility,1998,69(2):278
[2]Lasley B L,Stabenfeldt G H,Overstreet J W,et al.Urinary hormone levels at the time of ovulation and implantation.Fertil Steril 1985,43(6):861
(1998-08-18收稿，1999-01-28修回), 百拇医药