肌酸激酶亚型的电泳分离和荧光扫描法
作者：赵昕 韩冰 杨振华
单位：北京医院检验科，北京100730
关键词：肌酸激酶同工酶；肌酸激酶亚型；琼脂糖凝胶电泳
临床检验杂志990303 摘要 为了建立用琼脂糖电泳法同时测定肌酸激酶MB同工酶及CK-MM、CK-MB亚型的方法，使用不连续缓冲体系，在稳流、低压条件下电泳30分钟将两种亚型分离，荧光扫描。结果CK-MM在853～14 U/L，CK-MB在152～2.4 U/L之间结果无明显差异，CK-MM和CK-MB亚型最低检出限分别为12 U/L和2.1 U/L。一份血清标本在同一块凝胶上点7个样，连续做两次，CK-MM亚型及CK-MB亚型和同工酶具有好的重复性。已经检测了数百名心梗病人和骨骼肌疾病的病人，证明该法快速、简单、灵敏，重复性好，适用于医院常规实验室。
肌酸激酶由基因位点控制。可形成三种同工酶，即CK-MM、CK-MB和CK-BB。CK-MM同工酶又可分成MM1、MM2、MM3三种亚型，CK-MB也可分为MB1和MB2两种亚型。目前，亚型的检测方法除电泳法外，还有一些其它的方法，但对于临床应用来说，它要求测定方法简单，快速，经济和灵敏，这样才能适用于临床常规实验室。但上述方法很难满足这方面的要求。现在我们在不断研究和改进的基础上建立的CK同工酶及亚型的测定方法已经用于临床。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 仪器 电泳槽和Appraise荧光光密度计均由Beckman公司生产，浇板装置由Pharmacia公司生产，DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪由北京六一仪器厂生产。
1.2 试剂 琼脂糖为中科院生物物理所试剂厂生产，CK底物液为上海长征公司生产，吗啡啉丙磺酸(MOPS)和吗啡啉羟基丙磺酸(MOPSO)及甲基噻唑四唑盐(MTT)均为Sigma公司生产，吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)由Fluka公司生产。
琼脂糖凝胶缓冲液pH为6.6，称取EDTA 0.55 g，咪唑1.7 g，硼酸0.23 g，巴比妥钠1.5 g，2-氨基-2-甲基1，3丙二醇3.5 g，加水溶解后用1 mol/L盐酸调pH为6.6，然后加水到1升。
阴极电泳槽缓冲液pH为7.8，称取MOPS 10.46 g，溶于水后用5 mol/L NaOH调pH值，然后加水到1升。
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阳极电泳槽缓冲液pH为7.4，称取MOPS 12.4 g，溶于水后用5 mol/L NaOH调pH值，然后加水到1升。
1.3 方法
1.3.1 制板 琼脂糖0.3 g，加入30 ml琼脂糖凝胶缓冲液，加热溶解。取一张26×13 cm的透明胶片，贴放在12.5×60 cm的玻璃板上，透明胶片上放0.5 mm厚的塑料胶条，将玻璃板、胶片及胶条用架子固定在专用浇板装置上后倾斜放好，将溶解的琼脂糖凝胶趁热慢慢从胶片的下端浇到上端，边浇边用27×12.5 cm的玻璃板由下向上慢慢推压凝胶，使其均匀铺在胶片上，并将玻璃板压在浇好的凝胶上，玻璃板上放上重铁块，水平放置，待冷却后，放入4℃冰箱30分钟，取出后撬开上层玻璃板，打开架子，将带有凝胶的透明胶片切成8×10 cm的胶片，放在保湿盒中，置4℃冰箱备用。
1.3.2 点样 在距琼脂糖凝胶片一端3 cm处铺一条2×10 cm的滤纸，吸去表面水份，弃去滤纸，在此处放上加样塑料膜(1 cm×6 mm的8个加样孔)，在加样孔处加10 μl的待测血清，10分钟后移去加样薄膜，准备电泳。
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1.3.3 电泳 Beckman公司的电泳槽由冷却室和电泳槽两部分组成，冷却室设在电泳槽上部成拱形，将加完样的琼脂糖凝胶贴放在冷却室下面的凝胶片放样处，点样处位于阴极，冷却室内装有冰块，在电泳槽的阴阳极分别倒入MOPS和MOPSO电泳液，将冷却室盖在电泳槽上，此时凝胶的两端分别插入阴阳极电泳液中，开启电源，稳流30 mA，电压在160 V～220 V之间变化，电泳30分钟。
1.3.4 反应 在电泳后的凝胶片上加1 ml CK 底物液，放入暗盒中，42℃温箱孵育20分钟，取出用水冲洗胶面。
1.3.5 扫描 将冲洗过的胶片放入Beckman烘干箱烘干，烘干后的胶片用Appraise光密度计340 nm荧光扫描。
1.3.6 统计分析采用EPI软件，统计数据用均值和标准差表示。
2 实验结果
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2.1 稀释实验 取CK总酶活性为1005 U/L，CK-MB为15.1%的血清，用已灭活的血清分别稀释成7种浓度，稀释后CK-MM的活性为853～14 U/L，在同一块凝胶板上电泳，结果见表1。
表1 CK亚型稀释试验结果(%)
CK-MM(14～853 U/L)
CK-MB(2.4～152 U/L)
MM1
MM2
MM3
MB1
MB2
亚型比例
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x±s
CV
14.8～16.9
15.7±0.74.5
58.8～62.861±1.5
2.5
22.4～24.923.5±1.0
4.4
29.4～33.631.4±1.5
4.7
66.4～70.668.5±1.5
2.2
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结果证实，当CK-MM在853～14 U/L，CK-MB在152～2.4 U/L之间，结果无明显差异，当低于最低值时有时也显荧光，但扫描结果误差较大，即CV增大。
2.2 重复性实验 将CK总酶944 U/L，CK-MB 3.2%的一份血清在同一块凝胶上点7个样，连续做2次，共测定14点，CK-MM1、CK-MM2、CK-MM3、CK-MB1、CK-MB2的第一次板内CV%为3.5、3.5、4.8、3.7、3.2，第二次板内CV%为4.4、4.4、4.7、3.0、2.6。
2.3 参考值 对40份体检健康者血清按上述方法进行电泳，全部查出CK-MM亚型，12人查出CK-MB亚型。这些体检者CK为74.9±34.2(U/L)，CK-MB同工酶为3.5%±0.8%，MM1、MM2、MM3分别为62.8%±4.0%、27.3%±3.9%、9.9%±2.9%，MB1和MB2为65.6%±3.7%、34.4%±3.7%。
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健康人CK亚型电泳结果的荧光扫描图见图1。
附图 健康人CK亚型电泳后荧光扫描图
2.4 荧光法与染色法比较 在一块凝胶上点6个样品，中间空一个位置不点，进行电泳，电泳结束后加CK底物液，孵育20分钟后，用水冲洗，然后在凝胶片中间切开，一块烘干用荧光扫描，另一块染色，染色液为0.3 g/L的MTT和0.1 g/L的PMS以25∶1的比例混合，将染色液均匀铺在未烘干的凝胶片上，放在暗盒中，3～5分钟，色带清楚后，立即用水冲洗，然后用Appraise荧光光密度计的吸收光系统扫描。
荧光法与染色法的灵敏度均由图谱上峰的高低来判断，在光密度计按增益的程度扫描，当扫描的图谱上看不到峰图时，说明已低于检测限度。染色法最低可检测CK-MM为36 U/L，荧光法为12 U/L；染色法最低可检测CK-MB为12.3 U/L，荧光法为2.1 U/L，荧光法的灵敏度明显高于染色法。与国外报道CK-MM亚型最低可检测21 U/L[1]，CK-MB亚型最低可检测1.25 U/L[2]接近。
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3 讨论
我们试用过很多方法测定CK-MM亚型,开始用甲
染色的方法，采用不连续缓冲体系，电泳槽为巴比妥缓冲液，但染色方法灵敏度低[3]，特别是MB亚型，所以改用荧光扫描[4]，提高检测灵敏度。但以巴比妥缓冲液放电极槽时，凝胶烘干后，胶片上有盐类结晶，影响荧光扫描，而在阴极改用MOPS缓冲液后，减少了结晶对CK-MM亚型的影响，但CK-MB亚型的分离仍受影响。我们的实验证明阳极为MOPSO缓冲液的凝胶CK-MB亚型分得更清楚。我们还发现，用巴比妥做缓冲液时，电泳结束后，阳极缓冲液变黑，用水冲洗电泳槽时，阳极碳棒上有黑色物质被冲洗下来，而改用MOPSO做缓冲液时，就无此现象。本法当电泳结束时，凝胶片的温度为8℃，避免了酶的失活。
我们由于选用了合适的电泳槽和凝胶缓冲液，以及设计合理的电泳槽装置，同时采用荧光扫描，使CK-MB同工酶及亚型的检测灵敏度大为提高，并且对数百名心梗病人的样品进行了检测，证明CK亚型是对心梗病人进行早期和准确诊断的特异性指标。在心肌受损时，组织中的CK-MM3和CK-MB2释放到血中，在羧基肽酶的作用下CK-MM3渐次转变为CK-MM2和CK-MM1，CK-MB2转变为CK-MB1，使MM3/MM1和MB2/MB1的值从低到高，然后又降低，心梗病人在发病4小时后，CK及CK-MB同工酶均未升高以前，MM3/MM1的比值升高，8～12小时达高峰,MB2/MB1的值在发病后2小时升高，6～8小时达高峰，24小时后均恢复正常，4～16小时诊断AMI的灵敏度MM3/MM1最高达83%，MB2/MB1最高达97%，对心梗病人CK亚型的诊断灵敏度均高于CK和CK-MB同工酶，同时我们还对心绞痛及骨骼肌等其它疾病病人的样品进行了检测，证实本法快速，简单，经济、实用。
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参考文献
[1]Nohara R,Sobel B E,Jaffe A S.Quantitative analysis for isoforms of creatine kinase MM in plasma by chromatofocusing,with on-line monitoring of enzyme activity.Clin Chem,1988,34(2)：235
[2]Puleo P R,Guadagno P A,Roberts R.Sensitive,rapid assay of subform of creatinekinase MB in plasma,Clin Chem,1989,35：1452
[3]王玻，杨振华.肌型肌酸激酶亚型快速测定法及其临床应用.中华医学杂志，1990，70：401
[4]胡厚源，杨振华，张远慧.琼脂糖凝胶电泳法测定血清肌酸激酶MB亚型.中华医学检验杂志，1995，18(6)：354
(1998-11-18修回), http://www.100md.com
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关键词：肌酸激酶同工酶；肌酸激酶亚型；琼脂糖凝胶电泳
临床检验杂志990303 摘要 为了建立用琼脂糖电泳法同时测定肌酸激酶MB同工酶及CK-MM、CK-MB亚型的方法，使用不连续缓冲体系，在稳流、低压条件下电泳30分钟将两种亚型分离，荧光扫描。结果CK-MM在853～14 U/L，CK-MB在152～2.4 U/L之间结果无明显差异，CK-MM和CK-MB亚型最低检出限分别为12 U/L和2.1 U/L。一份血清标本在同一块凝胶上点7个样，连续做两次，CK-MM亚型及CK-MB亚型和同工酶具有好的重复性。已经检测了数百名心梗病人和骨骼肌疾病的病人，证明该法快速、简单、灵敏，重复性好，适用于医院常规实验室。
肌酸激酶由基因位点控制。可形成三种同工酶，即CK-MM、CK-MB和CK-BB。CK-MM同工酶又可分成MM1、MM2、MM3三种亚型，CK-MB也可分为MB1和MB2两种亚型。目前，亚型的检测方法除电泳法外，还有一些其它的方法，但对于临床应用来说，它要求测定方法简单，快速，经济和灵敏，这样才能适用于临床常规实验室。但上述方法很难满足这方面的要求。现在我们在不断研究和改进的基础上建立的CK同工酶及亚型的测定方法已经用于临床。
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1 材料和方法
1.1 仪器 电泳槽和Appraise荧光光密度计均由Beckman公司生产，浇板装置由Pharmacia公司生产，DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪由北京六一仪器厂生产。
1.2 试剂 琼脂糖为中科院生物物理所试剂厂生产，CK底物液为上海长征公司生产，吗啡啉丙磺酸(MOPS)和吗啡啉羟基丙磺酸(MOPSO)及甲基噻唑四唑盐(MTT)均为Sigma公司生产，吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)由Fluka公司生产。
琼脂糖凝胶缓冲液pH为6.6，称取EDTA 0.55 g，咪唑1.7 g，硼酸0.23 g，巴比妥钠1.5 g，2-氨基-2-甲基1，3丙二醇3.5 g，加水溶解后用1 mol/L盐酸调pH为6.6，然后加水到1升。
阴极电泳槽缓冲液pH为7.8，称取MOPS 10.46 g，溶于水后用5 mol/L NaOH调pH值，然后加水到1升。
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阳极电泳槽缓冲液pH为7.4，称取MOPS 12.4 g，溶于水后用5 mol/L NaOH调pH值，然后加水到1升。
1.3 方法
1.3.1 制板 琼脂糖0.3 g，加入30 ml琼脂糖凝胶缓冲液，加热溶解。取一张26×13 cm的透明胶片，贴放在12.5×60 cm的玻璃板上，透明胶片上放0.5 mm厚的塑料胶条，将玻璃板、胶片及胶条用架子固定在专用浇板装置上后倾斜放好，将溶解的琼脂糖凝胶趁热慢慢从胶片的下端浇到上端，边浇边用27×12.5 cm的玻璃板由下向上慢慢推压凝胶，使其均匀铺在胶片上，并将玻璃板压在浇好的凝胶上，玻璃板上放上重铁块，水平放置，待冷却后，放入4℃冰箱30分钟，取出后撬开上层玻璃板，打开架子，将带有凝胶的透明胶片切成8×10 cm的胶片，放在保湿盒中，置4℃冰箱备用。
1.3.2 点样 在距琼脂糖凝胶片一端3 cm处铺一条2×10 cm的滤纸，吸去表面水份，弃去滤纸，在此处放上加样塑料膜(1 cm×6 mm的8个加样孔)，在加样孔处加10 μl的待测血清，10分钟后移去加样薄膜，准备电泳。
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1.3.3 电泳 Beckman公司的电泳槽由冷却室和电泳槽两部分组成，冷却室设在电泳槽上部成拱形，将加完样的琼脂糖凝胶贴放在冷却室下面的凝胶片放样处，点样处位于阴极，冷却室内装有冰块，在电泳槽的阴阳极分别倒入MOPS和MOPSO电泳液，将冷却室盖在电泳槽上，此时凝胶的两端分别插入阴阳极电泳液中，开启电源，稳流30 mA，电压在160 V～220 V之间变化，电泳30分钟。
1.3.4 反应 在电泳后的凝胶片上加1 ml CK 底物液，放入暗盒中，42℃温箱孵育20分钟，取出用水冲洗胶面。
1.3.5 扫描 将冲洗过的胶片放入Beckman烘干箱烘干，烘干后的胶片用Appraise光密度计340 nm荧光扫描。
1.3.6 统计分析采用EPI软件，统计数据用均值和标准差表示。
2 实验结果
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2.1 稀释实验 取CK总酶活性为1005 U/L，CK-MB为15.1%的血清，用已灭活的血清分别稀释成7种浓度，稀释后CK-MM的活性为853～14 U/L，在同一块凝胶板上电泳，结果见表1。
表1 CK亚型稀释试验结果(%)
CK-MM(14～853 U/L)
CK-MB(2.4～152 U/L)
MM1
MM2
MM3
MB1
MB2
亚型比例
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x±s
CV
14.8～16.9
15.7±0.74.5
58.8～62.861±1.5
2.5
22.4～24.923.5±1.0
4.4
29.4～33.631.4±1.5
4.7
66.4～70.668.5±1.5
2.2
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结果证实，当CK-MM在853～14 U/L，CK-MB在152～2.4 U/L之间，结果无明显差异，当低于最低值时有时也显荧光，但扫描结果误差较大，即CV增大。
2.2 重复性实验 将CK总酶944 U/L，CK-MB 3.2%的一份血清在同一块凝胶上点7个样，连续做2次，共测定14点，CK-MM1、CK-MM2、CK-MM3、CK-MB1、CK-MB2的第一次板内CV%为3.5、3.5、4.8、3.7、3.2，第二次板内CV%为4.4、4.4、4.7、3.0、2.6。
2.3 参考值 对40份体检健康者血清按上述方法进行电泳，全部查出CK-MM亚型，12人查出CK-MB亚型。这些体检者CK为74.9±34.2(U/L)，CK-MB同工酶为3.5%±0.8%，MM1、MM2、MM3分别为62.8%±4.0%、27.3%±3.9%、9.9%±2.9%，MB1和MB2为65.6%±3.7%、34.4%±3.7%。
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健康人CK亚型电泳结果的荧光扫描图见图1。
附图 健康人CK亚型电泳后荧光扫描图
2.4 荧光法与染色法比较 在一块凝胶上点6个样品，中间空一个位置不点，进行电泳，电泳结束后加CK底物液，孵育20分钟后，用水冲洗，然后在凝胶片中间切开，一块烘干用荧光扫描，另一块染色，染色液为0.3 g/L的MTT和0.1 g/L的PMS以25∶1的比例混合，将染色液均匀铺在未烘干的凝胶片上，放在暗盒中，3～5分钟，色带清楚后，立即用水冲洗，然后用Appraise荧光光密度计的吸收光系统扫描。
荧光法与染色法的灵敏度均由图谱上峰的高低来判断，在光密度计按增益的程度扫描，当扫描的图谱上看不到峰图时，说明已低于检测限度。染色法最低可检测CK-MM为36 U/L，荧光法为12 U/L；染色法最低可检测CK-MB为12.3 U/L，荧光法为2.1 U/L，荧光法的灵敏度明显高于染色法。与国外报道CK-MM亚型最低可检测21 U/L[1]，CK-MB亚型最低可检测1.25 U/L[2]接近。
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3 讨论
我们试用过很多方法测定CK-MM亚型,开始用甲
染色的方法，采用不连续缓冲体系，电泳槽为巴比妥缓冲液，但染色方法灵敏度低[3]，特别是MB亚型，所以改用荧光扫描[4]，提高检测灵敏度。但以巴比妥缓冲液放电极槽时，凝胶烘干后，胶片上有盐类结晶，影响荧光扫描，而在阴极改用MOPS缓冲液后，减少了结晶对CK-MM亚型的影响，但CK-MB亚型的分离仍受影响。我们的实验证明阳极为MOPSO缓冲液的凝胶CK-MB亚型分得更清楚。我们还发现，用巴比妥做缓冲液时，电泳结束后，阳极缓冲液变黑，用水冲洗电泳槽时，阳极碳棒上有黑色物质被冲洗下来，而改用MOPSO做缓冲液时，就无此现象。本法当电泳结束时，凝胶片的温度为8℃，避免了酶的失活。我们由于选用了合适的电泳槽和凝胶缓冲液，以及设计合理的电泳槽装置，同时采用荧光扫描，使CK-MB同工酶及亚型的检测灵敏度大为提高，并且对数百名心梗病人的样品进行了检测，证明CK亚型是对心梗病人进行早期和准确诊断的特异性指标。在心肌受损时，组织中的CK-MM3和CK-MB2释放到血中，在羧基肽酶的作用下CK-MM3渐次转变为CK-MM2和CK-MM1，CK-MB2转变为CK-MB1，使MM3/MM1和MB2/MB1的值从低到高，然后又降低，心梗病人在发病4小时后，CK及CK-MB同工酶均未升高以前，MM3/MM1的比值升高，8～12小时达高峰,MB2/MB1的值在发病后2小时升高，6～8小时达高峰，24小时后均恢复正常，4～16小时诊断AMI的灵敏度MM3/MM1最高达83%，MB2/MB1最高达97%，对心梗病人CK亚型的诊断灵敏度均高于CK和CK-MB同工酶，同时我们还对心绞痛及骨骼肌等其它疾病病人的样品进行了检测，证实本法快速，简单，经济、实用。
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参考文献
[1]Nohara R,Sobel B E,Jaffe A S.Quantitative analysis for isoforms of creatine kinase MM in plasma by chromatofocusing,with on-line monitoring of enzyme activity.Clin Chem,1988,34(2)：235
[2]Puleo P R,Guadagno P A,Roberts R.Sensitive,rapid assay of subform of creatinekinase MB in plasma,Clin Chem,1989,35：1452
[3]王玻，杨振华.肌型肌酸激酶亚型快速测定法及其临床应用.中华医学杂志，1990，70：401
[4]胡厚源，杨振华，张远慧.琼脂糖凝胶电泳法测定血清肌酸激酶MB亚型.中华医学检验杂志，1995，18(6)：354
(1998-11-18修回), http://www.100md.com