汉坦病毒沟3株PCR分型
作者：孔艳 刘文雪 董关木 俞永新
单位：中国药品生物制品检定所，北京 100050
关键词：汉坦病毒沟3株；病毒分型；聚合酶链反应
中国病毒学000103 摘 要：汉坦病毒(HV)沟3株在以往报道的免疫学中和效价检测，为一株中和抗原广谱的毒株。本研究对这一毒株经过两次挑斑纯化，并经PCR方法进行分型检定，初步认为沟3毒株为SEO型HV病毒。
分类号：Q939.4 文献标识码：B
文章编号：1003-5125(2000)01-0011-03
PCR Typing of Hantavirus Gou 3 Strain
, http://www.100md.com KONG Yan, LIU Wen-xie, DONG Guan-mu, YU Yong-xin
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and B iologial Products, Beijing 100050,China)
Abstract：Hantavirus Gou 3 strain has been reported by plaque reduce neutralization test (PRNT) being a neutralizing antigen broad strain. In this i nvestigation the Gou 3 strain was purified by double picked up plaques and ident ified the types using PCR method. The results indicated that the Gou 3 strain virus is Seoul-like virus.
, 百拇医药
Key words：Hantavirus; Virus typing; PCR▲
目前汉坦病毒(HV)分型多用血清学方法，蚀斑中和，PCR以及核酸测序，一般应用血清学方法特别是空斑减少中和试验，可将HV分为四个血清型[1，2]。然而，HTN(汉滩)和SEO(汉城)型病毒间的抗原性有一定的交叉，但一般中和效价仍相差4倍或更多，所以有些病毒出现广谱抗原性。HV沟3株的免疫血清对国内外多株HTN和SEO型毒株均表现几乎相同的中和效价[3]。为了进一步对这一病毒进行研究，鉴别沟3株是否为HTN和SEO型混杂的毒株，我们对这一病毒进行了两次空斑纯化，并对所挑大小空斑病毒进行PCR分型，结果证明沟3原株和不同空斑株病毒均为SEO型病毒。现报告如下：
1 材料和方法
1.1 毒株和细胞
, 百拇医药 沟3株分离自杭州市黑家鼠，在VeroE6细胞中传代，-70℃冷冻保存。VeroE6细胞由美国泛里特军事医学研究所Eckels博士惠赠，本室保存。
1.2 蚀斑减少中和试验(PRNT)
见参考文献[4]。选择国内外具有代表性的毒株10株，其中HTN型6株(76-118、A9、A16、A537、陈株和LR1)和SEO型4株(UR、沟3、R22和湖北-1)，沟3株病毒免疫家兔，采血分离血清，分别与上述病毒株进行PRNT，测定血清中和抗体滴度。
1.3 空斑纯化
将病毒稀释接种于细胞单层平面上，吸附1h，加入第一层琼脂糖培养至第五天，加入第二层培养物，如前文报道[4]。挑出单个的大斑及小斑，接种入E6细胞单层，免疫荧光试验呈++～+++时，收获病毒液，进行二次挑斑，方法同前，培养至荧光++～+++时，收病毒液，分装保存。
, 百拇医药
1.4 PCR试验
1.4.1 病毒核酸提取 将原沟3株及两次挑斑病毒接种于单层细胞上，荧光呈++～+++时收获，用Promega公司产细胞总RNA提取试剂盒(PromegaZ5110)提取总RNA。
1.4.2 引物合成 由本室在美国赛百盛公司合成自M片段保守区，为型特异性引物。HTN型：P1：5′-AATATCAAAGATCCCATG-3′ (+)，P2：5′-CAATCAGCAACATGGGGTAT-3′ (-)， 分别位于M片段的30～49位和631～648位，产物长度619个核苷酸，一对巢式引物NP1：5′- GTGATAGGTTATGTAGAATTAC-3′ (+)；NP2：5′-ACTTCTCTCATAAACCACCTG-3′ (-)。 SEO型 ：P1：5′-AGTTGGCCAAGGCTTTGCATTAAA-3′ (-)；P2：5′-TTGCTGATGTGATGGCAGTCTCT- 3′ (+)；分别位于M片段的78～101和726～748位核苷酸，产物长度为671个核苷酸，巢式引 物为NP1：5′-TCTTGTCGATCACGGTCTCTC-3′ (+)；NP2：5′-GTCAATATACCCGTAGTGCAG- 3′ (-)。
, 百拇医药
1.4.3 cDNA合成及PCR扩增 逆转录及扩增试剂盒为美国Promega公司产品(Promega A1250) 试验方法如文献[5]。
1.4.4 产物分析 将10μL PCR产物在含EB的2%琼脂糖凝胶(Sigma公司产品)电泳，紫外灯下观察扩增后DNA条带。
2 结果
2.1 血清学PRNT中和抗体结果
由表1可见，沟3株免疫血清对6株HTN型病毒的中和效价为1∶320，而对本株和其它三株SEO型为320～640，其对两型的中和抗体滴度相同或只差两倍，说明血清学差异极小。
表1 Gou3株血清对两型出血热病毒株的空斑减少中和试验抗体效价
Table 1 The neutralizing antibodies of anti-Gou 3 serum to different Han tavirus strains in both types by PRNT HTN
, 百拇医药
SEO
Virus strain
Titers of antibody
Virus strain
Titers of antibody
76-118
320
UR
640
A9
320
Gou 3
, http://www.100md.com
640
A16
320
R22
320
A537
320
Hubei
≥320
LR1
320
2.2 PCR分型结果
将原株沟3、第一次挑斑纯化的大、小斑及第二次挑斑纯化的大、小斑，按顺序编号为1、2、3、4、5，用HTN和SEO型引物在同一条件下同时进行扩增，结果HTN型未见条带，SEO型在原株、第一次纯化大、小斑，第二次纯化大、小斑均在671个碱基处出现条带，结果见图1。
, http://www.100md.com
图1 沟3株汉坦病毒PCR分型结果
Fig.1PCR typing products of Hantavirus Gou 3
M:PCR marker N:Nest primer a, b, c, d:Negative
1:Guo 3 strain 2,3:The first picked up plaques 4,5:The second picked up plaques
3 讨论
我们对分离自黑家鼠的沟3株病毒以PRNT方法进行抗原谱的测定，分析结果提示，对两个血清型的10株病毒的PRNT滴度基本一致，最高只相差2倍，这一结果与Schmoljohn[6]和Lee[7]报道的两型间的效价相差25～50倍和10～100倍甚远。因此，这一结果提示沟3株病毒具有广谱的中和抗原，但传统的血清方法对HV分型不能准确辨别，确实是本株病毒具有广谱抗原性或是两型病毒混杂污染所致。由于汉坦病毒的M片段中G1蛋白区同源性最低，且型特异性抗原决定簇位于G1区，因此，选择G1区合成引物所扩增的PCR产物能有效区别不同型别的毒株。本实验室以前对Rr株的PCR扩增对HTN和SEO均阳性[5]，怀疑为二型病毒混杂所致。本研究将原沟3株经两次挑斑纯化，从理论上可认为是由一个病毒粒子扩增产生[6]。因此，我们将沟3原株、一次挑斑和二次挑斑的不同形态的蚀斑样品再进行PCR扩增，这一结果提示沟3株病毒无HTN、SEO型混杂，是一株抗原谱很广的具有作为疫苗候选株优势的毒株，此结果也符合SEO对HTN型的交叉程度大于HTN对SEO的反应程度的报道[1.7]，即SEO型表现抗原性更广谱。但沟3株对HTN型的基因同源性是否较其它SEO型高，有待进一步对其基因进行序列分析确定。
, 百拇医药
作者简介：孔艳(1962-)，女，河南省人，助理研究员，硕士。研究方向为病毒疫苗的研究及应用，出血热病毒的分子生物学及检定。
参考文献：
[1]Schmaijohn C S, Hasty S E, Dalrymple J M et al. Antigenic and genetic properties of viruses linked to hemorrhagic fever with renal syndrome [J]. Science, 1985,227:1041
[2]Lee Pyung-Woo. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immun ofluorescent antibody and plaque reduction neutralization tests [J].J Clin Mi crob iol,1985,22:940
, http://www.100md.com
[3]俞永新，安祺，姚智慧等.一株广谱中和抗原性出血热病毒株的发现[J].中国病毒学，1991，6(3)：271
[4]姚小剑，俞永新，安祺等.检测流行性出血热病毒滴度和中和抗体效价的半微量空斑法[J].病毒学报，1988，4：347
[5]姚智慧，俞永新.应用聚合酶链反应对我国不同来源肾综合症出血热病毒的型别分析[J].病毒学报，1994，10(2)：128
[6]戴华生等编著.新实验病毒学[M].北京：中国学术出版社，1985.114
[7]Lee HW, Lee PW. Baek LJ. Geographical distribution of hemorrhagic fever with renal syndrome and hantaviruses[J]. Arch Virol.1990,(suppl 1):5
收稿日期：1998-10-26
修稿日期：1999-01-19, 百拇医药
单位：中国药品生物制品检定所，北京 100050
关键词：汉坦病毒沟3株；病毒分型；聚合酶链反应
中国病毒学000103 摘 要：汉坦病毒(HV)沟3株在以往报道的免疫学中和效价检测，为一株中和抗原广谱的毒株。本研究对这一毒株经过两次挑斑纯化，并经PCR方法进行分型检定，初步认为沟3毒株为SEO型HV病毒。
分类号：Q939.4 文献标识码：B
文章编号：1003-5125(2000)01-0011-03
PCR Typing of Hantavirus Gou 3 Strain
, http://www.100md.com KONG Yan, LIU Wen-xie, DONG Guan-mu, YU Yong-xin
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and B iologial Products, Beijing 100050,China)
Abstract：Hantavirus Gou 3 strain has been reported by plaque reduce neutralization test (PRNT) being a neutralizing antigen broad strain. In this i nvestigation the Gou 3 strain was purified by double picked up plaques and ident ified the types using PCR method. The results indicated that the Gou 3 strain virus is Seoul-like virus.
, 百拇医药
Key words：Hantavirus; Virus typing; PCR▲
目前汉坦病毒(HV)分型多用血清学方法，蚀斑中和，PCR以及核酸测序，一般应用血清学方法特别是空斑减少中和试验，可将HV分为四个血清型[1，2]。然而，HTN(汉滩)和SEO(汉城)型病毒间的抗原性有一定的交叉，但一般中和效价仍相差4倍或更多，所以有些病毒出现广谱抗原性。HV沟3株的免疫血清对国内外多株HTN和SEO型毒株均表现几乎相同的中和效价[3]。为了进一步对这一病毒进行研究，鉴别沟3株是否为HTN和SEO型混杂的毒株，我们对这一病毒进行了两次空斑纯化，并对所挑大小空斑病毒进行PCR分型，结果证明沟3原株和不同空斑株病毒均为SEO型病毒。现报告如下：
1 材料和方法
1.1 毒株和细胞
, 百拇医药 沟3株分离自杭州市黑家鼠，在VeroE6细胞中传代，-70℃冷冻保存。VeroE6细胞由美国泛里特军事医学研究所Eckels博士惠赠，本室保存。
1.2 蚀斑减少中和试验(PRNT)
见参考文献[4]。选择国内外具有代表性的毒株10株，其中HTN型6株(76-118、A9、A16、A537、陈株和LR1)和SEO型4株(UR、沟3、R22和湖北-1)，沟3株病毒免疫家兔，采血分离血清，分别与上述病毒株进行PRNT，测定血清中和抗体滴度。
1.3 空斑纯化
将病毒稀释接种于细胞单层平面上，吸附1h，加入第一层琼脂糖培养至第五天，加入第二层培养物，如前文报道[4]。挑出单个的大斑及小斑，接种入E6细胞单层，免疫荧光试验呈++～+++时，收获病毒液，进行二次挑斑，方法同前，培养至荧光++～+++时，收病毒液，分装保存。
, 百拇医药
1.4 PCR试验
1.4.1 病毒核酸提取 将原沟3株及两次挑斑病毒接种于单层细胞上，荧光呈++～+++时收获，用Promega公司产细胞总RNA提取试剂盒(PromegaZ5110)提取总RNA。
1.4.2 引物合成 由本室在美国赛百盛公司合成自M片段保守区，为型特异性引物。HTN型：P1：5′-AATATCAAAGATCCCATG-3′ (+)，P2：5′-CAATCAGCAACATGGGGTAT-3′ (-)， 分别位于M片段的30～49位和631～648位，产物长度619个核苷酸，一对巢式引物NP1：5′- GTGATAGGTTATGTAGAATTAC-3′ (+)；NP2：5′-ACTTCTCTCATAAACCACCTG-3′ (-)。 SEO型 ：P1：5′-AGTTGGCCAAGGCTTTGCATTAAA-3′ (-)；P2：5′-TTGCTGATGTGATGGCAGTCTCT- 3′ (+)；分别位于M片段的78～101和726～748位核苷酸，产物长度为671个核苷酸，巢式引 物为NP1：5′-TCTTGTCGATCACGGTCTCTC-3′ (+)；NP2：5′-GTCAATATACCCGTAGTGCAG- 3′ (-)。
, 百拇医药
1.4.3 cDNA合成及PCR扩增 逆转录及扩增试剂盒为美国Promega公司产品(Promega A1250) 试验方法如文献[5]。
1.4.4 产物分析 将10μL PCR产物在含EB的2%琼脂糖凝胶(Sigma公司产品)电泳，紫外灯下观察扩增后DNA条带。
2 结果
2.1 血清学PRNT中和抗体结果
由表1可见，沟3株免疫血清对6株HTN型病毒的中和效价为1∶320，而对本株和其它三株SEO型为320～640，其对两型的中和抗体滴度相同或只差两倍，说明血清学差异极小。
表1 Gou3株血清对两型出血热病毒株的空斑减少中和试验抗体效价
Table 1 The neutralizing antibodies of anti-Gou 3 serum to different Han tavirus strains in both types by PRNT HTN
, 百拇医药
SEO
Virus strain
Titers of antibody
Virus strain
Titers of antibody
76-118
320
UR
640
A9
320
Gou 3
, http://www.100md.com
640
A16
320
R22
320
A537
320
Hubei
≥320
LR1
320
2.2 PCR分型结果
将原株沟3、第一次挑斑纯化的大、小斑及第二次挑斑纯化的大、小斑，按顺序编号为1、2、3、4、5，用HTN和SEO型引物在同一条件下同时进行扩增，结果HTN型未见条带，SEO型在原株、第一次纯化大、小斑，第二次纯化大、小斑均在671个碱基处出现条带，结果见图1。
, http://www.100md.com
图1 沟3株汉坦病毒PCR分型结果
Fig.1PCR typing products of Hantavirus Gou 3
M:PCR marker N:Nest primer a, b, c, d:Negative
1:Guo 3 strain 2,3:The first picked up plaques 4,5:The second picked up plaques
3 讨论
我们对分离自黑家鼠的沟3株病毒以PRNT方法进行抗原谱的测定，分析结果提示，对两个血清型的10株病毒的PRNT滴度基本一致，最高只相差2倍，这一结果与Schmoljohn[6]和Lee[7]报道的两型间的效价相差25～50倍和10～100倍甚远。因此，这一结果提示沟3株病毒具有广谱的中和抗原，但传统的血清方法对HV分型不能准确辨别，确实是本株病毒具有广谱抗原性或是两型病毒混杂污染所致。由于汉坦病毒的M片段中G1蛋白区同源性最低，且型特异性抗原决定簇位于G1区，因此，选择G1区合成引物所扩增的PCR产物能有效区别不同型别的毒株。本实验室以前对Rr株的PCR扩增对HTN和SEO均阳性[5]，怀疑为二型病毒混杂所致。本研究将原沟3株经两次挑斑纯化，从理论上可认为是由一个病毒粒子扩增产生[6]。因此，我们将沟3原株、一次挑斑和二次挑斑的不同形态的蚀斑样品再进行PCR扩增，这一结果提示沟3株病毒无HTN、SEO型混杂，是一株抗原谱很广的具有作为疫苗候选株优势的毒株，此结果也符合SEO对HTN型的交叉程度大于HTN对SEO的反应程度的报道[1.7]，即SEO型表现抗原性更广谱。但沟3株对HTN型的基因同源性是否较其它SEO型高，有待进一步对其基因进行序列分析确定。
, 百拇医药
作者简介：孔艳(1962-)，女，河南省人，助理研究员，硕士。研究方向为病毒疫苗的研究及应用，出血热病毒的分子生物学及检定。
参考文献：
[1]Schmaijohn C S, Hasty S E, Dalrymple J M et al. Antigenic and genetic properties of viruses linked to hemorrhagic fever with renal syndrome [J]. Science, 1985,227:1041
[2]Lee Pyung-Woo. Serotypic classification of hantaviruses by indirect immun ofluorescent antibody and plaque reduction neutralization tests [J].J Clin Mi crob iol,1985,22:940
, http://www.100md.com
[3]俞永新，安祺，姚智慧等.一株广谱中和抗原性出血热病毒株的发现[J].中国病毒学，1991，6(3)：271
[4]姚小剑，俞永新，安祺等.检测流行性出血热病毒滴度和中和抗体效价的半微量空斑法[J].病毒学报，1988，4：347
[5]姚智慧，俞永新.应用聚合酶链反应对我国不同来源肾综合症出血热病毒的型别分析[J].病毒学报，1994，10(2)：128
[6]戴华生等编著.新实验病毒学[M].北京：中国学术出版社，1985.114
[7]Lee HW, Lee PW. Baek LJ. Geographical distribution of hemorrhagic fever with renal syndrome and hantaviruses[J]. Arch Virol.1990,(suppl 1):5
收稿日期：1998-10-26
修稿日期：1999-01-19, 百拇医药