中国猪瘟兔化弱毒(兔血源毒)NS3 5′端基因的克隆与序列分析
作者：蒋帅 刘湘涛 李健强 李红卫 殷震
单位：蒋帅(锡山市科委，江苏锡山 214100)；刘湘涛(兰州兽医研究所，甘肃兰州 730046)；李健强(西北农业大学，陕西杨陵 712100)；李红卫(解放军农牧大学，吉林长春 130062)；殷震(解放军农牧大学，吉林长春 130062)
关键词：中国猪瘟兔化弱毒NS3-5′端基因；序列分析；反转录-聚合酶链式反应
中国病毒学000114
分类号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0083-05
Molecular Cloning and Sequence Analysis of NS3 5′
, http://www.100md.com
Terminal Gene of HCLV Isolated from Blood
JIANG Shuai
(Xishan Sci & Tech Commission, Jiangsu Province 21 4100, China)
LIU Xiang-tao
(Lanzhou Veterinary Institute, Gansu Province 730046, China)
LI Jian-qiang
(Northwest Agricultural University, Yangling, Shaaxi P rovince 712100, China)
, 百拇医药
Abstract：The NS3 5′ terminal gene was amplified by reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), and half-nest polymerase reaction. The amplified frag ments were cloned and sequenced. Comparing and analysing the nucleotide sequence sand deduced amino acid sequences of the HCLV isolated from blood and other HC V strains were performed on the computer with Goldkey software. The results show ed that the highest degree of nucleotide homology exists between HCLV isolated f rom blood and “C” strain (sk-6 cellular virus). The homology of aminoacid sequence was all at or over 98% between each pair strains. It reveals that HCLV ha s very close relationship with “C” strain, and also proves that NS3 gene is highly conservative in pestiviruses.
, 百拇医药
Key words：HCLV NS3-5′ terminal gene; Sequence analysis; RT- PCR▲
猪瘟(Hog Cholera, HC；或称为Swine Fever, SF)是猪最重要的传染病之一，猪瘟病毒(HCV 或SFV)归类于黄病毒科瘟病毒属。在现行疫苗中，猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)是最广泛 使用的疫苗之一，HCLV是由中国兽药监察所研制成功的猪瘟弱毒疫苗，赠给许多国家后，被 适应于许多细胞，国外一律称为C株。80年代后，我国猪瘟兔化弱毒组织苗也换代为羊肾、 牛睾丸、羊睾丸等组织细胞苗。但国内外应用单克隆抗体对C株检测发现有不同的反应模式 ，表明经过多年在不同细胞驯化的结果，C株已经名同实异[1，2]。正是在此种 情况下，我们开展HCLV组织毒基因组序列测定工作，根据对猪瘟病毒已测得的毒株基因序列 的研究[3～5]，NS3基因在猪瘟病毒中高度保守，因此选定NS3基因为此项工 作的突破口，以推动HCV疫苗的研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 病毒
HCLV引自中国兽药监察所(480代冻干毒)。复壮与增殖均在兔体中进行。接种HCLV处于高热 期兔心脏采血立即用于RNA抽提。
1.2 引物的设计与合成
根据已发表的HCV核苷酸序列[3～5]，设计三条简并引物(中科院上海细胞所合成 )。引物序列分别为(引物位置参考“C”株细胞毒)： Primer
Sequence
Position
NS31
, 百拇医药 5′ TACACACACCAAGGTGGCAT3′(+)
531 1～5330
NS32
5′ AACCAACCAAGCTTATGAGT3′(-)
5703～5722
NS33
5′ CCATTTCTGTCAAGTCTGT3′(-)
5750～5768
其中引物对NS31 NS32用于对引物NS31 NS33扩增产物的半套式扩增。
, 百拇医药
1.3 病毒RNA提取
参考文献[6]。取100μL兔心血加0.6mL裂解液，60μL NaAc，0.6mL酚-氯仿混 合液抽提，上清直接用于反转录。本步骤所用试剂均为Promega出品。
1.4 RT-PCR
取1.3所提上清，分别加入负链引物(NS33)、反转录缓冲液、dNTP、RNasin和AMV(Prome ga)，42℃水浴1h。再取反转录产物，加入PCR缓冲液，相应的二条引物(NS31、NS 33)、dNTP和Tag DNA聚合酶(Promega)，置Gene Amp PCR System 2400(PE Co., USA)， 94℃ 1min, 55℃ 1min, 72℃ 1min扩增29个循环。扩增产物于1%琼脂糖凝胶 电脉。
, http://www.100md.com
1.5 Half-Nest PCR(半套式PCR)
直接取上述PCR产物2μL溶于100μL PCR扩增系统中，用引物对NS13 NS23作半 套式扩增，方法同上。
1.6 克隆与测序
将半套式扩增片段与PGEM-T载体相连(按Promega操作说明书进行)。参考文献[7][8]的 方法转化新鲜制备的感受态细菌DH5α，鉴定阳性克隆，提取质粒送Takara大连宝生物有限 公司测序。
1.7 序列分析
采用Goldkey软件整理分析数据，并作核苷酸和氨基酸的同源性比较。
2 结果与讨论
, http://www.100md.com
2.1 HCLV(兔血源毒)NS3 5′端核苷酸序列及推导的氨基酸序列
引物对NS31 NS33扩增后未检测出扩增片段，继之以NS31 NS32半套式扩增 后检测出预期大小(412bp)扩增片段(电泳图略)，将PCR产物克隆到PGEM-T载体中，然后 由Takara大连宝生物有限公司完成测序，核苷酸序列测定结果及推导氨基酸序列见图1。
图1 HCLV NS3 5′端核苷酸序列及 推导的氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of HCLV NS3 5′ terminal
, 百拇医药
2.2 核苷酸和氨基酸序列比较
将测得的HCLV NS3 5′端核苷酸及推导的氨基酸序列与已知的其它HCV毒株相应序列进行 同源性比较，见图2、图3。
图2 HCV NS3 5′端核苷 酸序列同源性比较
Fig.2 Comparison of nucleotide homology of HCV NS3 5′ terminal
, http://www.100md.com
图3 推导的HCV NS3 N端氨基酸序 列同源性比较
Fig.3 Comparison of homology of HCV NS3 N terminal deduced amino acid
HCLV NS3 5′端核苷酸及推导的氨基酸序列与上述比较毒株间核苷酸与氨基酸序列同源性 比值分别见表1、2
表1 核苷酸同源性比值
Table 1 Ratio of nucleoti de homology
Alfort
“C”
Brescia
, 百拇医药
strain
strain
strain
HCLV
strain
92%
99%
95%
Brescia
strain
91%
95%
“C”
, 百拇医药
strain
91%
表2 氨基酸同源性比 值
Table 2 Ratio of homology of amino acid sequence
Alfort
“C”
Brescia
strain
strain
strain
HCLV
, 百拇医药 strain
99%
99%
98%
Brescia
strain
99%
99%
“C”
strain
100%
由表1可以看出HCLV NS3 5′基因与“C”株细胞毒的同源性最高，为99%，与Alfort株相 应核苷酸序列同源性最低，为91%。由表2可以看出所比较各株氨基酸序列同源性都在98%以 上。这与四株病毒基因组全序列的比较是一致的，也与NS3基因在猪瘟病毒中高度保守的 结论一致，“C”株细胞毒是HCLV在SK-6细胞上的驯化毒，HCLV兔血源毒是从动物血液中获 得的HCLV，因此这二者有最高的同源性是合乎逻辑的。
, 百拇医药
2.3 关于试验技术路线的讨论
对现有参考序列RNA病毒来说，其基因组测序工作常用RT-PCR方法，然而由于RNA自身的不 稳定性及RNA酶的作用难以得到完整RNA片段，加之HCLV病毒产量低，易破 碎难以用等密度梯度离心法提纯，因此当我们用一步法从组织毒中难于抽提RNA时，改用接 种HCLV处于高热期的兔血，结果扩增出了预期片段。■
基金项目：国家“攀登计划”资助课题
作者简介：蒋帅(1973-)，男，陕西省靖边县人，硕士，研究方向动物病毒分子生物学。
参考文献：
[1]Van Rijin P, Miedema G, Wensvoort G et al. Antigenic E1 of hog cholera virus [J]. J Virol, 1994,68:3934～3942
, 百拇医药
[2]施万球，韦家槐，黄小曼等.中国株猪瘟兔化弱毒克隆毒的研究[J].中国畜禽传染病，1997，1：3～8
[3]Meyers G, Rumenapf T, Thie H. Molecular cloning and nucleotide sequence of genome of Hog Cholera virus [J]. J Virol, 1989,171:555～567
[4]Ishikawa K, Nagai H, Katayama K et al. Comparison of the entire nucleotide and deduced amino acid sequences of the attenuated hog cholera vaccine strain GPE and the wild type parental strain ALD [J]. Arch Virol, 1995,140:1385～1391
, 百拇医药
[5]Moormann R, Van H, Miedema G et al. Infectious RNA transcribed from a n engineered full-length cDNA template of the genome of a pestivirus [J]. J V irol, 1996,2:736～770
[6]Wilcek S, Herring A, Nettlefon P. Pestiviruses isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis [J]. Arch Viral, 1994,136:309 ～323
[7]Canal C, Hotael I, Almeida L et al. Differentiation of classical swine fever virus from ruminant pestiviruses by reverse transcription and polymerase chain reaction [J]. Vet Micro, 1996,2(48):373～379
[8]Pestova T, Shatsky I, Fletcher S et al. A prokaryotic-like mode of cytoplasmic eukaryotic translation to the initial codon during internal translation initiation of hepatitis C and classical swine fever virus RNAs [J]. Gene, 1998,1(12):67～83
收稿日期：1998-06-29
修稿日期：1999-06-28, 百拇医药
单位：蒋帅(锡山市科委，江苏锡山 214100)；刘湘涛(兰州兽医研究所，甘肃兰州 730046)；李健强(西北农业大学，陕西杨陵 712100)；李红卫(解放军农牧大学，吉林长春 130062)；殷震(解放军农牧大学，吉林长春 130062)
关键词：中国猪瘟兔化弱毒NS3-5′端基因；序列分析；反转录-聚合酶链式反应
中国病毒学000114
分类号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0083-05
Molecular Cloning and Sequence Analysis of NS3 5′
, http://www.100md.com
Terminal Gene of HCLV Isolated from Blood
JIANG Shuai
(Xishan Sci & Tech Commission, Jiangsu Province 21 4100, China)
LIU Xiang-tao
(Lanzhou Veterinary Institute, Gansu Province 730046, China)
LI Jian-qiang
(Northwest Agricultural University, Yangling, Shaaxi P rovince 712100, China)
, 百拇医药
Abstract：The NS3 5′ terminal gene was amplified by reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), and half-nest polymerase reaction. The amplified frag ments were cloned and sequenced. Comparing and analysing the nucleotide sequence sand deduced amino acid sequences of the HCLV isolated from blood and other HC V strains were performed on the computer with Goldkey software. The results show ed that the highest degree of nucleotide homology exists between HCLV isolated f rom blood and “C” strain (sk-6 cellular virus). The homology of aminoacid sequence was all at or over 98% between each pair strains. It reveals that HCLV ha s very close relationship with “C” strain, and also proves that NS3 gene is highly conservative in pestiviruses.
, 百拇医药
Key words：HCLV NS3-5′ terminal gene; Sequence analysis; RT- PCR▲
猪瘟(Hog Cholera, HC；或称为Swine Fever, SF)是猪最重要的传染病之一，猪瘟病毒(HCV 或SFV)归类于黄病毒科瘟病毒属。在现行疫苗中，猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)是最广泛 使用的疫苗之一，HCLV是由中国兽药监察所研制成功的猪瘟弱毒疫苗，赠给许多国家后，被 适应于许多细胞，国外一律称为C株。80年代后，我国猪瘟兔化弱毒组织苗也换代为羊肾、 牛睾丸、羊睾丸等组织细胞苗。但国内外应用单克隆抗体对C株检测发现有不同的反应模式 ，表明经过多年在不同细胞驯化的结果，C株已经名同实异[1，2]。正是在此种 情况下，我们开展HCLV组织毒基因组序列测定工作，根据对猪瘟病毒已测得的毒株基因序列 的研究[3～5]，NS3基因在猪瘟病毒中高度保守，因此选定NS3基因为此项工 作的突破口，以推动HCV疫苗的研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 病毒
HCLV引自中国兽药监察所(480代冻干毒)。复壮与增殖均在兔体中进行。接种HCLV处于高热 期兔心脏采血立即用于RNA抽提。
1.2 引物的设计与合成
根据已发表的HCV核苷酸序列[3～5]，设计三条简并引物(中科院上海细胞所合成 )。引物序列分别为(引物位置参考“C”株细胞毒)： Primer
Sequence
Position
NS31
, 百拇医药 5′ TACACACACCAAGGTGGCAT3′(+)
531 1～5330
NS32
5′ AACCAACCAAGCTTATGAGT3′(-)
5703～5722
NS33
5′ CCATTTCTGTCAAGTCTGT3′(-)
5750～5768
其中引物对NS31 NS32用于对引物NS31 NS33扩增产物的半套式扩增。
, 百拇医药
1.3 病毒RNA提取
参考文献[6]。取100μL兔心血加0.6mL裂解液，60μL NaAc，0.6mL酚-氯仿混 合液抽提，上清直接用于反转录。本步骤所用试剂均为Promega出品。
1.4 RT-PCR
取1.3所提上清，分别加入负链引物(NS33)、反转录缓冲液、dNTP、RNasin和AMV(Prome ga)，42℃水浴1h。再取反转录产物，加入PCR缓冲液，相应的二条引物(NS31、NS 33)、dNTP和Tag DNA聚合酶(Promega)，置Gene Amp PCR System 2400(PE Co., USA)， 94℃ 1min, 55℃ 1min, 72℃ 1min扩增29个循环。扩增产物于1%琼脂糖凝胶 电脉。
, http://www.100md.com
1.5 Half-Nest PCR(半套式PCR)
直接取上述PCR产物2μL溶于100μL PCR扩增系统中，用引物对NS13 NS23作半 套式扩增，方法同上。
1.6 克隆与测序
将半套式扩增片段与PGEM-T载体相连(按Promega操作说明书进行)。参考文献[7][8]的 方法转化新鲜制备的感受态细菌DH5α，鉴定阳性克隆，提取质粒送Takara大连宝生物有限 公司测序。
1.7 序列分析
采用Goldkey软件整理分析数据，并作核苷酸和氨基酸的同源性比较。
2 结果与讨论
, http://www.100md.com
2.1 HCLV(兔血源毒)NS3 5′端核苷酸序列及推导的氨基酸序列
引物对NS31 NS33扩增后未检测出扩增片段，继之以NS31 NS32半套式扩增 后检测出预期大小(412bp)扩增片段(电泳图略)，将PCR产物克隆到PGEM-T载体中，然后 由Takara大连宝生物有限公司完成测序，核苷酸序列测定结果及推导氨基酸序列见图1。
图1 HCLV NS3 5′端核苷酸序列及 推导的氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of HCLV NS3 5′ terminal
, 百拇医药
2.2 核苷酸和氨基酸序列比较
将测得的HCLV NS3 5′端核苷酸及推导的氨基酸序列与已知的其它HCV毒株相应序列进行 同源性比较，见图2、图3。
图2 HCV NS3 5′端核苷 酸序列同源性比较
Fig.2 Comparison of nucleotide homology of HCV NS3 5′ terminal
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图3 推导的HCV NS3 N端氨基酸序 列同源性比较
Fig.3 Comparison of homology of HCV NS3 N terminal deduced amino acid
HCLV NS3 5′端核苷酸及推导的氨基酸序列与上述比较毒株间核苷酸与氨基酸序列同源性 比值分别见表1、2
表1 核苷酸同源性比值
Table 1 Ratio of nucleoti de homology
Alfort
“C”
Brescia
, 百拇医药
strain
strain
strain
HCLV
strain
92%
99%
95%
Brescia
strain
91%
95%
“C”
, 百拇医药
strain
91%
表2 氨基酸同源性比 值
Table 2 Ratio of homology of amino acid sequence
Alfort
“C”
Brescia
strain
strain
strain
HCLV
, 百拇医药 strain
99%
99%
98%
Brescia
strain
99%
99%
“C”
strain
100%
由表1可以看出HCLV NS3 5′基因与“C”株细胞毒的同源性最高，为99%，与Alfort株相 应核苷酸序列同源性最低，为91%。由表2可以看出所比较各株氨基酸序列同源性都在98%以 上。这与四株病毒基因组全序列的比较是一致的，也与NS3基因在猪瘟病毒中高度保守的 结论一致，“C”株细胞毒是HCLV在SK-6细胞上的驯化毒，HCLV兔血源毒是从动物血液中获 得的HCLV，因此这二者有最高的同源性是合乎逻辑的。
, 百拇医药
2.3 关于试验技术路线的讨论
对现有参考序列RNA病毒来说，其基因组测序工作常用RT-PCR方法，然而由于RNA自身的不 稳定性及RNA酶的作用难以得到完整RNA片段，加之HCLV病毒产量低，易破 碎难以用等密度梯度离心法提纯，因此当我们用一步法从组织毒中难于抽提RNA时，改用接 种HCLV处于高热期的兔血，结果扩增出了预期片段。■
基金项目：国家“攀登计划”资助课题
作者简介：蒋帅(1973-)，男，陕西省靖边县人，硕士，研究方向动物病毒分子生物学。
参考文献：
[1]Van Rijin P, Miedema G, Wensvoort G et al. Antigenic E1 of hog cholera virus [J]. J Virol, 1994,68:3934～3942
, 百拇医药
[2]施万球，韦家槐，黄小曼等.中国株猪瘟兔化弱毒克隆毒的研究[J].中国畜禽传染病，1997，1：3～8
[3]Meyers G, Rumenapf T, Thie H. Molecular cloning and nucleotide sequence of genome of Hog Cholera virus [J]. J Virol, 1989,171:555～567
[4]Ishikawa K, Nagai H, Katayama K et al. Comparison of the entire nucleotide and deduced amino acid sequences of the attenuated hog cholera vaccine strain GPE and the wild type parental strain ALD [J]. Arch Virol, 1995,140:1385～1391
, 百拇医药
[5]Moormann R, Van H, Miedema G et al. Infectious RNA transcribed from a n engineered full-length cDNA template of the genome of a pestivirus [J]. J V irol, 1996,2:736～770
[6]Wilcek S, Herring A, Nettlefon P. Pestiviruses isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis [J]. Arch Viral, 1994,136:309 ～323
[7]Canal C, Hotael I, Almeida L et al. Differentiation of classical swine fever virus from ruminant pestiviruses by reverse transcription and polymerase chain reaction [J]. Vet Micro, 1996,2(48):373～379
[8]Pestova T, Shatsky I, Fletcher S et al. A prokaryotic-like mode of cytoplasmic eukaryotic translation to the initial codon during internal translation initiation of hepatitis C and classical swine fever virus RNAs [J]. Gene, 1998,1(12):67～83
收稿日期：1998-06-29
修稿日期：1999-06-28, 百拇医药