HIV感染者特异抗原及核酸测定
作者：吴南屏 刘克洲 陈智 李继承 R.H.Dennin
单位：310006 杭州，浙江医科大学传染病研究所(吴南屏、刘克州、陈智、李继承)；德国吕贝克医科大学(R.H.Dennin)
关键词：
中华传染病杂志980318 为探讨HIV DNA，RNA，P24Ag与宿主的相互关系及三者间的内在联系。收集139例抗HIV阳性血标本，用固相免疫酶法测P24Ag(U.S.Abbort)，定量逆转录聚合酶链生物酶法测定HIV RNA(U.S.Roche Bra)和巢式聚合酶链法测HIV DNA(Marke Germany)。并对同一标本三种HIV检测方法的敏感性、一致性进行相关研究，现将结果报告如下。
材料与方法
, 百拇医药 一、标本来源
1995年10月～1996年10月收集德国吕贝克医科大学临床医学中心139例抗-HIV阳性(ELISA)的感染者血浆，进行P24，HIV DNA，HIV RNA测定。
二、HIV P24抗原测定
P24抗原通过固相双抗体夹心免疫酶法试剂(USA Abbort)检测，P24单抗(mouse)包被于固相载体株上与系列稀释的待测血清40℃作用，洗涤后加抗HIV-Ag(Rabbit)40℃作用1小时，洗涤后再加抗免IgG酶结合物(Coat)，40℃ 1小时，洗涤后加OPD显色，按显色深浅测A值，其敏感性可达pg水平，实验过程均设有特异性试验。
三、HIV RNA抽提
, 百拇医药 定量测定HIV RNA试剂由美国Roche Branchburg公司提供。200μl EDTA血浆经异硫氰酸哌抽提、异丙醇纯化、70%酒精洗涤，抽提的RNA置于4℃冰箱备用。HIV定量标准株(QS)由该公司提供含有特异探针的人工合成RNA，已知一定量的RNA与标本一起扩增，所用引物为HIVgag区域SK431/SK462，其引物5′末端有生物素标记，扩增产物为142bp，含QS和生物素标记5′末端的扩增产物。可通过含有HIV特异的寡腺苷酸探针和QS的寡腺苷酸探针包被酶标板，扩增产物连续稀释，用抗生物素-辣根过氧化物结合物和生物素辣根过氧化物酶显色系统，按显色的深浅在分光光度计450nm上，结合HIV稀释度和定量QS而测出每毫升所含HIV RNA的拷贝数，其检测敏感性可达pg水平。
四、HIV DNA提取
EDTA血浆经DNA抽提液抽提，蛋白酶K消化，55℃ 3小时，95℃ 10分钟后灭活蛋白酶K，经二次酚、氯仿抽提，100%酒精和1/10mol/L NaAC沉淀，70%酒精洗涤，室温干燥，100μl TE溶解DNA，置于4℃备用。HIV引物分别位于HIV LTR-gag,pol,env区，所有标本均用巢式PCR对HIV不同区逐一扩增，引物为M667/SK03C(449-956)，M661/SK01C(675-920)，Pol104/Pol4(2394-3117)，Pol3/Pol312K(2810-3017),Env526/EnvC02(7800-7989),Env-Col/571K(7855-7942)，其扩增片段分别为HIVLTR-gag 245bp,pol208bp,env88bp,PCR反应总体积为100μl,扩增程序为：95℃ 1分钟后，94℃ 1.5分钟，72℃ 1.5分钟共35个循环后，72℃延伸5分钟。扩增内套为相同程序，所不同的是取5μl第一次扩增产物作二次扩增产物模板。二次扩增产物在2%琼脂凝胶电泳(0.5μg/ml EB)观察结果。
, http://www.100md.com
为防止交叉污感，三个实验分别在不同实验室进行，均设有阳性、阴性对照。
结 果
一、139例标本检测结果
见表1。
表1 139例标本P24Ag、HIV DNA、HIV RNA测定结果 项 目
标本
例数
阳性例数
(%)
阴性例数
(%)
, 百拇医药
P24
139
34(24.5)
105(75.5)
HIV RNA*
139
108(77.7)
31(22.3)
HIV DNA**
139
109(78.4)
, 百拇医药 30(21.6)
*定量RT-PCR按药盒说明大于3 000copies/ml作为阳性结果统计；**巢式PCR测HIV DNA，此为总结果，在HIVgag,pol,env三个区域，六对引物中，只有一个区域阳性，即作出阳性结果统计
二、各区域HIV DNA测定结果
见表2。
讨 论
检测HIV RNA，HIV DNA，P24抗原是研究HIV病程进展快慢，持续感染的长短及HIV病毒变异、治疗疗效考核指标之一。据报道[1，2]体内HIV DNA，HIV RNA水平高低与HIV感染方式，抗体、细胞毒T细胞
, http://www.100md.com 表2 不同区域巢式PCR扩增HIV
DNA结果 区域
标本
例数
阳性例数
(%)
阴性例数
(%)
RTL gag
139
50(36)
89(64)
env
, http://www.100md.com
139
12(10)
P27(90)
pol
139
92(66)
47(34)
的反应性及CD4细胞的量密切相关。一些研究认为[3]长期无症状的HIV感染者，外周单个核细胞中HIV DNA和血浆HIV RNA的量比较稳定，如含量逐渐增高提示疾病快速进展和恶化。有关HIV DNA，HIV RNA，P24在同一标本是否有一致的检率，它们之间有什么内在联系报道不多。本试验在139例标本中同时测HIV DNA，RNA和P24，发现大部分标本可同时测到HIV DNA，HIV RNA，阳性一致率为80%，在此组中有67.6%为P24(+)。约20%左右的标本，检测到单一HIV DNA或RNA或P24阳性，为什么同一标本大多数可以同时测到三项指标，而少数20%只能测到单项指标，是否一些低复制、低水平感染HIV因数量少或隐匿而逃逸了敏感的PCR测定，还是与机体其他因素共同作用有关还不明了。Schechter在检测HIV抗体阳性同性恋者发现有10.4%(33/316)对PCR无反应，其用二对引物测HIV核酸其敏感性为83%，三对引物同时测得敏感性为86%，这可能与HIV高度变异有关。Fidler等[4]认为一些有抗原提呈细胞(APC)缺陷HIV的无症状患者，T淋巴细胞可不受细胞凋亡的影响，并可以极低的T细胞感染率(2%)和低T细胞免疫应答而长期潜伏，以致敏感的PCR也不能准确地捕捉到感染的T细胞而影响检测率。Bing等[5]认为长期存活而无症状的母婴HIV感染人群中，有HIV vpr基因突变，Vpr C末端基因缺陷，继而影响N末端Tat开放读码框架。Tat为正调节蛋白，可提高HIV基因转录和复制。Tat突变使HIV不能复制。Weixing等[6]认为HIV核膜可增加HIV DNA合成，也可以影响HIV RNA转录，某些药物在治疗过程中可以抑制和改变HIV表达。综合分析其原因，我们认为其一，测HIV DNA，RNA是在不同的区域，使用不同的引物，扩增不同区域的HIV片段，并不是每个区域均有HIV感染。其二，个体差异性，虽然患者都抗体阳性，但不同的感染方式如静脉药瘾、同性恋、血友病、母婴传播、混合感染，不同感染途径和感染量、个体对感染耐受性也不同。其三，病毒和宿主的免疫调节不同如病毒瘾匿、HIV基因变异、抗原表达细胞缺乏、HIV其他亚型感染或混合感染(待发表)及正在进行药物治疗，均可影响HIV的表达。根据139例HIV DNA，RNA，P24结果分析，我们认为在研究HIV感染和治疗过程中应综合看待各项指标，有条件应采用多引物多区域测HIV DNA、RNA及P24以提高HIV检测敏感性，对单一指标阳性，其它指标阴性者应多因素综合分析，以进一步加深对HIV感染机制及机体免疫内在关系的研究。
, http://www.100md.com
本课题受德国吕贝克医科大学和国家基金资助参考文献
1 Peckham C,Gibb D.Mother to child transmission of the human immumodeficiency virus.N Engl J Med,1995,333:298-302.
2 Wong MT,Dolan MJ,Kozlow Z,et al.Patterns of virus burden and T cell phenctype estalished early are correlated with the rate of disease progression in human immunodeficiency virus type 1 infected persons.J infect Dis 1996,173:377-387.
3 Bagnarelli P,Valenza A,Menzo S,et al.Dynamics of molecular parameters of human immunodeficiency virus type 1 activity in vivo.J Virol,1994,68:2495-2502.
, 百拇医药
4 Fidler SJ,Dorrell L,Ball S,et al.An early antigen presenting cell detect in HIV-1 infected patients correlate with CD4 dependency in human T-cell clones.Immunology,1996,89:46-53.
5 Bing W,Ge YC,Palasanthiran P,et al.Gene defects clustered of the C-terminus of the Vpr gene of HIV-1 longterm nonprogressing mother and child pair:in vivo evolution of Vpr quasis-pecies in blood and plasma.Virology,1996,223:224-232.
6 Weixing Wu,Henderson L,Copelang TD,et al.Human immunodeficienyc virus type-1 nucleocapsid protein reduces reverse transcriptase pausing at a secondary structure near the murine leukimia virus polypurine tract.J Virol,1996,70:7132-7141., http://www.100md.com
单位：310006 杭州，浙江医科大学传染病研究所(吴南屏、刘克州、陈智、李继承)；德国吕贝克医科大学(R.H.Dennin)
关键词：
中华传染病杂志980318 为探讨HIV DNA，RNA，P24Ag与宿主的相互关系及三者间的内在联系。收集139例抗HIV阳性血标本，用固相免疫酶法测P24Ag(U.S.Abbort)，定量逆转录聚合酶链生物酶法测定HIV RNA(U.S.Roche Bra)和巢式聚合酶链法测HIV DNA(Marke Germany)。并对同一标本三种HIV检测方法的敏感性、一致性进行相关研究，现将结果报告如下。
材料与方法
, 百拇医药 一、标本来源
1995年10月～1996年10月收集德国吕贝克医科大学临床医学中心139例抗-HIV阳性(ELISA)的感染者血浆，进行P24，HIV DNA，HIV RNA测定。
二、HIV P24抗原测定
P24抗原通过固相双抗体夹心免疫酶法试剂(USA Abbort)检测，P24单抗(mouse)包被于固相载体株上与系列稀释的待测血清40℃作用，洗涤后加抗HIV-Ag(Rabbit)40℃作用1小时，洗涤后再加抗免IgG酶结合物(Coat)，40℃ 1小时，洗涤后加OPD显色，按显色深浅测A值，其敏感性可达pg水平，实验过程均设有特异性试验。
三、HIV RNA抽提
, 百拇医药 定量测定HIV RNA试剂由美国Roche Branchburg公司提供。200μl EDTA血浆经异硫氰酸哌抽提、异丙醇纯化、70%酒精洗涤，抽提的RNA置于4℃冰箱备用。HIV定量标准株(QS)由该公司提供含有特异探针的人工合成RNA，已知一定量的RNA与标本一起扩增，所用引物为HIVgag区域SK431/SK462，其引物5′末端有生物素标记，扩增产物为142bp，含QS和生物素标记5′末端的扩增产物。可通过含有HIV特异的寡腺苷酸探针和QS的寡腺苷酸探针包被酶标板，扩增产物连续稀释，用抗生物素-辣根过氧化物结合物和生物素辣根过氧化物酶显色系统，按显色的深浅在分光光度计450nm上，结合HIV稀释度和定量QS而测出每毫升所含HIV RNA的拷贝数，其检测敏感性可达pg水平。
四、HIV DNA提取
EDTA血浆经DNA抽提液抽提，蛋白酶K消化，55℃ 3小时，95℃ 10分钟后灭活蛋白酶K，经二次酚、氯仿抽提，100%酒精和1/10mol/L NaAC沉淀，70%酒精洗涤，室温干燥，100μl TE溶解DNA，置于4℃备用。HIV引物分别位于HIV LTR-gag,pol,env区，所有标本均用巢式PCR对HIV不同区逐一扩增，引物为M667/SK03C(449-956)，M661/SK01C(675-920)，Pol104/Pol4(2394-3117)，Pol3/Pol312K(2810-3017),Env526/EnvC02(7800-7989),Env-Col/571K(7855-7942)，其扩增片段分别为HIVLTR-gag 245bp,pol208bp,env88bp,PCR反应总体积为100μl,扩增程序为：95℃ 1分钟后，94℃ 1.5分钟，72℃ 1.5分钟共35个循环后，72℃延伸5分钟。扩增内套为相同程序，所不同的是取5μl第一次扩增产物作二次扩增产物模板。二次扩增产物在2%琼脂凝胶电泳(0.5μg/ml EB)观察结果。
, http://www.100md.com
为防止交叉污感，三个实验分别在不同实验室进行，均设有阳性、阴性对照。
结 果
一、139例标本检测结果
见表1。
表1 139例标本P24Ag、HIV DNA、HIV RNA测定结果 项 目
标本
例数
阳性例数
(%)
阴性例数
(%)
, 百拇医药
P24
139
34(24.5)
105(75.5)
HIV RNA*
139
108(77.7)
31(22.3)
HIV DNA**
139
109(78.4)
, 百拇医药 30(21.6)
*定量RT-PCR按药盒说明大于3 000copies/ml作为阳性结果统计；**巢式PCR测HIV DNA，此为总结果，在HIVgag,pol,env三个区域，六对引物中，只有一个区域阳性，即作出阳性结果统计
二、各区域HIV DNA测定结果
见表2。
讨 论
检测HIV RNA，HIV DNA，P24抗原是研究HIV病程进展快慢，持续感染的长短及HIV病毒变异、治疗疗效考核指标之一。据报道[1，2]体内HIV DNA，HIV RNA水平高低与HIV感染方式，抗体、细胞毒T细胞
, http://www.100md.com 表2 不同区域巢式PCR扩增HIV
DNA结果 区域
标本
例数
阳性例数
(%)
阴性例数
(%)
RTL gag
139
50(36)
89(64)
env
, http://www.100md.com
139
12(10)
P27(90)
pol
139
92(66)
47(34)
的反应性及CD4细胞的量密切相关。一些研究认为[3]长期无症状的HIV感染者，外周单个核细胞中HIV DNA和血浆HIV RNA的量比较稳定，如含量逐渐增高提示疾病快速进展和恶化。有关HIV DNA，HIV RNA，P24在同一标本是否有一致的检率，它们之间有什么内在联系报道不多。本试验在139例标本中同时测HIV DNA，RNA和P24，发现大部分标本可同时测到HIV DNA，HIV RNA，阳性一致率为80%，在此组中有67.6%为P24(+)。约20%左右的标本，检测到单一HIV DNA或RNA或P24阳性，为什么同一标本大多数可以同时测到三项指标，而少数20%只能测到单项指标，是否一些低复制、低水平感染HIV因数量少或隐匿而逃逸了敏感的PCR测定，还是与机体其他因素共同作用有关还不明了。Schechter在检测HIV抗体阳性同性恋者发现有10.4%(33/316)对PCR无反应，其用二对引物测HIV核酸其敏感性为83%，三对引物同时测得敏感性为86%，这可能与HIV高度变异有关。Fidler等[4]认为一些有抗原提呈细胞(APC)缺陷HIV的无症状患者，T淋巴细胞可不受细胞凋亡的影响，并可以极低的T细胞感染率(2%)和低T细胞免疫应答而长期潜伏，以致敏感的PCR也不能准确地捕捉到感染的T细胞而影响检测率。Bing等[5]认为长期存活而无症状的母婴HIV感染人群中，有HIV vpr基因突变，Vpr C末端基因缺陷，继而影响N末端Tat开放读码框架。Tat为正调节蛋白，可提高HIV基因转录和复制。Tat突变使HIV不能复制。Weixing等[6]认为HIV核膜可增加HIV DNA合成，也可以影响HIV RNA转录，某些药物在治疗过程中可以抑制和改变HIV表达。综合分析其原因，我们认为其一，测HIV DNA，RNA是在不同的区域，使用不同的引物，扩增不同区域的HIV片段，并不是每个区域均有HIV感染。其二，个体差异性，虽然患者都抗体阳性，但不同的感染方式如静脉药瘾、同性恋、血友病、母婴传播、混合感染，不同感染途径和感染量、个体对感染耐受性也不同。其三，病毒和宿主的免疫调节不同如病毒瘾匿、HIV基因变异、抗原表达细胞缺乏、HIV其他亚型感染或混合感染(待发表)及正在进行药物治疗，均可影响HIV的表达。根据139例HIV DNA，RNA，P24结果分析，我们认为在研究HIV感染和治疗过程中应综合看待各项指标，有条件应采用多引物多区域测HIV DNA、RNA及P24以提高HIV检测敏感性，对单一指标阳性，其它指标阴性者应多因素综合分析，以进一步加深对HIV感染机制及机体免疫内在关系的研究。
, http://www.100md.com
本课题受德国吕贝克医科大学和国家基金资助参考文献
1 Peckham C,Gibb D.Mother to child transmission of the human immumodeficiency virus.N Engl J Med,1995,333:298-302.
2 Wong MT,Dolan MJ,Kozlow Z,et al.Patterns of virus burden and T cell phenctype estalished early are correlated with the rate of disease progression in human immunodeficiency virus type 1 infected persons.J infect Dis 1996,173:377-387.
3 Bagnarelli P,Valenza A,Menzo S,et al.Dynamics of molecular parameters of human immunodeficiency virus type 1 activity in vivo.J Virol,1994,68:2495-2502.
, 百拇医药
4 Fidler SJ,Dorrell L,Ball S,et al.An early antigen presenting cell detect in HIV-1 infected patients correlate with CD4 dependency in human T-cell clones.Immunology,1996,89:46-53.
5 Bing W,Ge YC,Palasanthiran P,et al.Gene defects clustered of the C-terminus of the Vpr gene of HIV-1 longterm nonprogressing mother and child pair:in vivo evolution of Vpr quasis-pecies in blood and plasma.Virology,1996,223:224-232.
6 Weixing Wu,Henderson L,Copelang TD,et al.Human immunodeficienyc virus type-1 nucleocapsid protein reduces reverse transcriptase pausing at a secondary structure near the murine leukimia virus polypurine tract.J Virol,1996,70:7132-7141., http://www.100md.com