肿瘤坏死因子等与实验性急性肝坏死相关性研究
作者：苏立稳 盛国光 张建军 王伯祥
单位：067000 河北省承德医学院(苏立稳)；湖北中医学院脏象肝病研究所(盛国光、张建军、王伯祥)
关键词：
中华传染病杂志980315 本实验以D-GLaN诱发大鼠急性肝坏死模型，动态观察血浆肿瘤坏死因子(TNF)、血清F蛋白(FP)、总胆红素(TB)、丙氨酸转氨酶(ALT)和凝血酶原时间(PT)五项指标的含量变化(简称“五指标”)，并与急性肝坏死程度进行相关、回归分析。以此来探讨“五指标”与急性肝坏死相关性，并选出评价急性肝坏死较优的指标。
材料与方法
一、实验动物及试剂
(一) 实验动物 Wistar雄性大鼠80只，体重150～200克，由同济医科大学实验动物中心提供。
, 百拇医药
(二) 人肿瘤坏死因子(TNF-α)酶联免疫检测 试剂盒由北京邦定生物医学公司供给。
(三) D-GLaN 解放军防化研究院精细学部提供。
(四) 血清FP测定 试剂由中国医学科学院放射医学研究所提供。
二、方法
将实验动物随机分为正常对照组与肝坏死组，每组40只，肝坏死组动物实验前禁食8小时，然后以900mg/kg[1]的剂量，一次性腹腔注射D-GLaN，4个小时后自由饮水进食。正常对照组亦按相同方式，一次注射生理盐水，各组分别于注射前及注射后24小时、48小时和72小时随机取出10只大鼠放血，检测TNF、FP、TB、ALT和PT五项指标，并在肝中叶一定部位取肝组织HE染色，做常规病理检查。血浆TNF测定采用ELISA双抗体夹心法，首先绘出TNF标准曲线，以酶标阅读仪测A值，然后在标准曲线上求出TNF含量，以ng/ml表示；血清FP测定用放射免疫学方法由中国医学科学院放射医学研究所协助完成。其余指标均按常规方法测定。
, 百拇医药
结 果
一、肝坏死组大鼠中毒前后TNF、FP、TB、ALT及PT变化结果
见附表。中毒24小时“五指标”含量开始上升，48小时达高峰，72小时下降，各时相与正常对照组相比较，差异均有显著性(P<0.01)。
二、中毒后不同时间病理检查结果
来源以坏死程度为标准，用图像分析仪定量化分析。中毒24小时、48小时、72小时分别为50.14±5.22，80.89±3.95，70.06±3.33。
三、病理变化程度“Y”(本实验表示急性肝坏死程度)
附表 肝坏死组大鼠中毒前、后各指标变化情况(
±s) 项目
, 百拇医药
只数
TNF(ng/ml)
FP(ng/ml)
TB(μmol/L)
PT(s)
ALT(u)
中毒前
40
25.00±4.13
60.00±11.06
4.99±1.92
8.58±1.15
, http://www.100md.com
27.50±7.53
中毒后
30
24小时
10
56.10±9.14
151.00±36.65
12.32±2.74
13.95±1.31
282.00±83.83
48小时
10
, 百拇医药
216.00±51.47
384.00±86.05
44.85±12.14
39.60±12.37
771.90±428.50
72小时
10
70.00±24.43
258.00±35.84
22.96±4.21
20.85±3.69
, 百拇医药 460.40±35.87
用计算机MDAS软件，在HP486/80型微机上，对“五指标”含量变化与急性肝坏死程度“Y”，进行多元线性相关、回归分析。即“Y”与X1(TNF)、X2(FP)、X3(TB)、X4(PT)、X5(ALT)进行相关、回归分析，复相关系数为R=0.9690，剔除变量X4后回归方程为：Y=50.89-0.111X1+0.081X2+0.820X3-0.013X5。
讨 论
D-GLaN对肝脏的损伤无特异性，其所致的病理改变与人类病毒性肝炎的表现较为相似，因此它常被视为重要的病理模型而加以利用[2]。
肿瘤坏死因子是一种多肽激素，主要由单核巨噬细胞产生，对机体有正、反两个方面的作用。一方面它可以引起肿瘤坏死，是机体抵抗力的重要介质，具有类似干扰素的抗病毒作用[3]。另一方面与病毒性肝炎关系密切[4]，是引发急性肝坏死的重要介质[5]。肝坏死形成内毒素血症，而肝脏对TNF的毒性具有高度的敏感性，TNF除介导内毒素的多种生物学作用外，还通过诱生其他类介质协同作用，扩大其生物学效应，从不同环节参与体内炎性反应和组织损伤，因此TNF又被视为内毒素所致肝脏病理生理过程的关键性促炎介质[6]。
, 百拇医药
F蛋白是一种主要存在于脊椎动物肝脏中的细胞质蛋白，其在肝细胞的含量比血清及其他器官高300倍以上，因而血清F蛋白水平可以反映肝细胞坏死程度[7]，对肝病的诊断将产生深远的影响[8]。本实验结果显示血清F蛋白水平与急性肝坏死程度呈正相关，与肝病理检查结果相一致，是急性肝坏死较为敏感的标志物，另有研究表明F蛋白是肝坏死特异性指标。
从本研究结果可以看出“五指标”是急性肝坏死较为敏感的标志物，并与急性肝坏死程度呈正相关，因此，检测“五指标”含量变化可以预测肝坏死程度，综合分析“五指标”含量变化对于病毒性肝炎急性肝坏死具有十分重要的诊断学意义。通过逐步回归分析发现TB、TNF、FP和ALT为评价急性肝坏死较为敏感的指标，进一步实验将可以确定五指标的正常、异常范围界限，为今后选择更确切的评价肝坏死程度指标，提供一条可行的方法。
本课题受湖北省教委科研基金资助
, 百拇医药
参考文献
1 李仪奎.中药药理实验方法学.第1版.上海：上海科学技术出版社，1991.460-461.
2 张颖，贲长恩，王德福，等.中药“863”对D-氨基半乳糖肝损伤治疗作用的形态学、生物化学实验研究.北京中医学院学报，1993，16：58-59.
3 张定凤，张维.肿瘤坏死因子和感染性疾病.国外医学流行病、传染病分册，1990，17：52-55.
4 李昌平，刘厚钰.肿瘤坏死因子与肝脏.临床消化杂志，1994，6：124-125.
5 张惠琴，姚志强，周永兴，等.肿瘤坏死因子在实验性急性肝坏死中的作用.临床肝胆病杂志，1994，10：19-21.
6 刘预，康格非.肿瘤坏死因子在内毒素所致肝损害中的作用.国外医学临床生物化学与检验学分册，1994，15：35-36.
7 杨爱珍，王亦根.F抗原的研究进展.国外医学流行病、传染病分册，1991，18：154-157.
8 牛惠生，李怀芬，李井渊.F蛋白与肝病.中西医结合肝病杂志，1992，2：48-49., 百拇医药
单位：067000 河北省承德医学院(苏立稳)；湖北中医学院脏象肝病研究所(盛国光、张建军、王伯祥)
关键词：
中华传染病杂志980315 本实验以D-GLaN诱发大鼠急性肝坏死模型，动态观察血浆肿瘤坏死因子(TNF)、血清F蛋白(FP)、总胆红素(TB)、丙氨酸转氨酶(ALT)和凝血酶原时间(PT)五项指标的含量变化(简称“五指标”)，并与急性肝坏死程度进行相关、回归分析。以此来探讨“五指标”与急性肝坏死相关性，并选出评价急性肝坏死较优的指标。
材料与方法
一、实验动物及试剂
(一) 实验动物 Wistar雄性大鼠80只，体重150～200克，由同济医科大学实验动物中心提供。
, 百拇医药
(二) 人肿瘤坏死因子(TNF-α)酶联免疫检测 试剂盒由北京邦定生物医学公司供给。
(三) D-GLaN 解放军防化研究院精细学部提供。
(四) 血清FP测定 试剂由中国医学科学院放射医学研究所提供。
二、方法
将实验动物随机分为正常对照组与肝坏死组，每组40只，肝坏死组动物实验前禁食8小时，然后以900mg/kg[1]的剂量，一次性腹腔注射D-GLaN，4个小时后自由饮水进食。正常对照组亦按相同方式，一次注射生理盐水，各组分别于注射前及注射后24小时、48小时和72小时随机取出10只大鼠放血，检测TNF、FP、TB、ALT和PT五项指标，并在肝中叶一定部位取肝组织HE染色，做常规病理检查。血浆TNF测定采用ELISA双抗体夹心法，首先绘出TNF标准曲线，以酶标阅读仪测A值，然后在标准曲线上求出TNF含量，以ng/ml表示；血清FP测定用放射免疫学方法由中国医学科学院放射医学研究所协助完成。其余指标均按常规方法测定。
, 百拇医药
结 果
一、肝坏死组大鼠中毒前后TNF、FP、TB、ALT及PT变化结果
见附表。中毒24小时“五指标”含量开始上升，48小时达高峰，72小时下降，各时相与正常对照组相比较，差异均有显著性(P<0.01)。
二、中毒后不同时间病理检查结果
来源以坏死程度为标准，用图像分析仪定量化分析。中毒24小时、48小时、72小时分别为50.14±5.22，80.89±3.95，70.06±3.33。
三、病理变化程度“Y”(本实验表示急性肝坏死程度)
附表 肝坏死组大鼠中毒前、后各指标变化情况(
±s) 项目, 百拇医药
只数
TNF(ng/ml)
FP(ng/ml)
TB(μmol/L)
PT(s)
ALT(u)
中毒前
40
25.00±4.13
60.00±11.06
4.99±1.92
8.58±1.15
, http://www.100md.com
27.50±7.53
中毒后
30
24小时
10
56.10±9.14
151.00±36.65
12.32±2.74
13.95±1.31
282.00±83.83
48小时
10
, 百拇医药
216.00±51.47
384.00±86.05
44.85±12.14
39.60±12.37
771.90±428.50
72小时
10
70.00±24.43
258.00±35.84
22.96±4.21
20.85±3.69
, 百拇医药 460.40±35.87
用计算机MDAS软件，在HP486/80型微机上，对“五指标”含量变化与急性肝坏死程度“Y”，进行多元线性相关、回归分析。即“Y”与X1(TNF)、X2(FP)、X3(TB)、X4(PT)、X5(ALT)进行相关、回归分析，复相关系数为R=0.9690，剔除变量X4后回归方程为：Y=50.89-0.111X1+0.081X2+0.820X3-0.013X5。
讨 论
D-GLaN对肝脏的损伤无特异性，其所致的病理改变与人类病毒性肝炎的表现较为相似，因此它常被视为重要的病理模型而加以利用[2]。
肿瘤坏死因子是一种多肽激素，主要由单核巨噬细胞产生，对机体有正、反两个方面的作用。一方面它可以引起肿瘤坏死，是机体抵抗力的重要介质，具有类似干扰素的抗病毒作用[3]。另一方面与病毒性肝炎关系密切[4]，是引发急性肝坏死的重要介质[5]。肝坏死形成内毒素血症，而肝脏对TNF的毒性具有高度的敏感性，TNF除介导内毒素的多种生物学作用外，还通过诱生其他类介质协同作用，扩大其生物学效应，从不同环节参与体内炎性反应和组织损伤，因此TNF又被视为内毒素所致肝脏病理生理过程的关键性促炎介质[6]。
, 百拇医药
F蛋白是一种主要存在于脊椎动物肝脏中的细胞质蛋白，其在肝细胞的含量比血清及其他器官高300倍以上，因而血清F蛋白水平可以反映肝细胞坏死程度[7]，对肝病的诊断将产生深远的影响[8]。本实验结果显示血清F蛋白水平与急性肝坏死程度呈正相关，与肝病理检查结果相一致，是急性肝坏死较为敏感的标志物，另有研究表明F蛋白是肝坏死特异性指标。
从本研究结果可以看出“五指标”是急性肝坏死较为敏感的标志物，并与急性肝坏死程度呈正相关，因此，检测“五指标”含量变化可以预测肝坏死程度，综合分析“五指标”含量变化对于病毒性肝炎急性肝坏死具有十分重要的诊断学意义。通过逐步回归分析发现TB、TNF、FP和ALT为评价急性肝坏死较为敏感的指标，进一步实验将可以确定五指标的正常、异常范围界限，为今后选择更确切的评价肝坏死程度指标，提供一条可行的方法。
本课题受湖北省教委科研基金资助
, 百拇医药
参考文献
1 李仪奎.中药药理实验方法学.第1版.上海：上海科学技术出版社，1991.460-461.
2 张颖，贲长恩，王德福，等.中药“863”对D-氨基半乳糖肝损伤治疗作用的形态学、生物化学实验研究.北京中医学院学报，1993，16：58-59.
3 张定凤，张维.肿瘤坏死因子和感染性疾病.国外医学流行病、传染病分册，1990，17：52-55.
4 李昌平，刘厚钰.肿瘤坏死因子与肝脏.临床消化杂志，1994，6：124-125.
5 张惠琴，姚志强，周永兴，等.肿瘤坏死因子在实验性急性肝坏死中的作用.临床肝胆病杂志，1994，10：19-21.
6 刘预，康格非.肿瘤坏死因子在内毒素所致肝损害中的作用.国外医学临床生物化学与检验学分册，1994，15：35-36.
7 杨爱珍，王亦根.F抗原的研究进展.国外医学流行病、传染病分册，1991，18：154-157.
8 牛惠生，李怀芬，李井渊.F蛋白与肝病.中西医结合肝病杂志，1992，2：48-49., 百拇医药