志贺菌流行菌株耐药性及R质粒的研究
作者：丁建强 马亦林 龚正 陈亚岗
单位：310016 杭州，浙江医科大学附属邵逸夫医院(丁建强)；浙江医科大学附属第一医院(马亦要、龚正、陈亚岗)
关键词：志贺菌；药物敏感试验；R质粒
中华传染病杂志980313 【摘要】 目的 调查志贺菌在流行季节的主要血清型和耐药性。方法 收集临床分离的志贺菌157株，进行血清学分型、药物敏感试验和R质粒接合试验。结果 除1株为宋内志贺菌外其余156株均为福氏志贺菌，福氏志贺菌对四环素、氨苄西林和复方新诺明高度耐药达85%以上。对诺氟沙星的耐药率也有27.6%，仅有的1株宋内志贺菌对诺氟沙星，氧氟沙星，环丙沙星均耐药。耐诺氟沙星的细菌的R质粒接合试验的阳性率为51.2%。结论 福氏志贺菌是主要的血清型，对多种抗菌药物有较高的耐药率，没有证据提示R质粒能介导对氟喹诺酮类药物的耐药性。
, 百拇医药 Study on resistance and R plasmid of epidemic strains of Shigellae Ding Jianqiang, Ma Yilin, Gong Zheng, et al. The First Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To investigate the serotypes and resistance of Shigellae in epidemic season. Methods One hundred and fifty-seven clinical isolates of Shigellae were collected and their serotypes were determined, while the susceptibility testing and R plasmid conjugation experiment were performed. Results Except for one Shigellae sonnei, 156 strains were Shigellae flexneri which were highly resistant to Tetracycline, Ampicillin and SMZco(resistance rate >85%). The resistance rate to Norfloxacin was 27.6%. The only isolate of Shigellae sonnei was resistant to three fluoroquinolones(Norfloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin). The positive rate of the R plasmid conjugation experiment was 51.2% in norfloxacin-resistant strains. Conclusion The results showed that Shigellae flexneri was the main serotype of epidemic strains, which had a relatively high resistance rate to various antibiotics. No evidence suggested R plasmid could mediate the resistance to fluoroquinolones.
, 百拇医药
【Key words】 Shigellae Susceptibility testing R plasmid
由志贺菌感染所致的细菌性痢疾是我国发病率仅次于乙型肝炎的第二大传染病，自磺胺等抗菌药物使用以来，由于R质粒介导的多重耐药性，志贺菌对氨苄西林，复方新诺明，四环素等药物的耐药率不断上升并呈现多重耐药现象[1]。80年代初开始使用氟喹诺酮类药物，志贺菌对这种药物的敏感率在95%以上[1，2]。但近年来已发现这种病原菌对诺氟沙星的敏感性已降至85%以下[3]。为了解志贺菌在流行季节的主要血清型和耐药性等情况，我们在1996年8月至10月在杭州，湖州，嘉兴，金华市四个地区搜集了157株志贺菌，进行了血清学分型，药物敏感试验和R质粒接合传递试验等研究并初步探讨志贺菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制。
材料和方法
一、标本的收集
, 百拇医药
取自门诊或住院患者粪便标本，共搜集志贺菌157株，其中杭州地区65株，湖州地区21株，嘉兴地区32株，金华地区39株，在当地经过初步鉴定后，统一送本院重新进行生化和血清学鉴定。
二、志贺菌属诊断血清
购自卫生部兰州生物制品研究所，批号960703。
三、抗菌药敏纸片
共有14种，除奈替米星药敏纸片为采用温州制药厂提供的标准品自行制作及氨曲南药敏纸片为中美上海施贵宝制药公司惠赠外，其余均购自浙江省军区后勤部卫生防疫检验所。包括：诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、氨苄西林、头孢曲松、氯霉素、头孢唑啉、四环素、阿米卡星、庆大霉素、呋喃唑酮。
四、药物敏感试验
纸片法采用Kirby-Bauer法，诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星3种抗菌药物同时进行最低抑菌浓度(MIC)测定，采用平皿双倍稀释法。所用药物：诺氟沙星标准品，浙江新昌制药厂生产，批号920807，效价99%。氧氟沙星标准品，浙江温州制药厂生产，批号930004，效价99.28%。环丙沙星标准品，浙江温州制药厂生产，批号930451，效价93.47%。质控菌为大肠埃希菌ATCC25922。诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星药敏纸片的含量分别为10μg、5μg和5μg。最低抑菌浓度测定值的判断标准为：诺氟沙星 敏感≤4 中介度 8 耐药≥16 氧氟沙星 敏感≤2 中度敏感 4 耐药≥8 环丙沙星敏感≤1 中度敏感 2 耐药≥4[4]。
, 百拇医药
五、R质粒接合试验
按张子康介绍的方法[5]将供、受体菌分别接种于中国蓝平板上，37°C过夜后分别将两种细菌转种于1ml肉汤中，37°C培养5～6小时。吸取供、受体菌液各0.02ml于0.5ml肉汤中，37°C水浴中接合2小时。在含有氯霉素(20mg/L)和利福平(100mg/L)的中国蓝平板上分别涂布0.05ml接合菌、受体菌和供体菌，置37°C培养过夜，并同时涂布在除氯霉素和利福平外另加有诺氟沙星(4mg/L)的中国蓝平板上。受体菌为大肠埃希菌K12W1485F-Rifr。
结果
一、血清学分型
结果显示在上述浙江四个地区流行季节的志贺菌属感染主要为福氏志贺菌，且以福氏ⅡA为主，有156株，宋内志贺菌1株，未能分离出其他血清型。
, 百拇医药
二、药物敏感试验
156株福氏志贺菌的纸片法药敏结果见表1。同时发现某些菌株对抗菌药物呈现高度耐药和多重耐药情况见表2。1株宋内志贺菌对诺氟沙星、氧氟沙星，环丙沙星，氨苄西林，四环素，复方新诺明耐药，对其它抗菌素敏感。3种氟喹诺酮类药物对志贺菌的最低抑菌浓度(MIC)测定结果见表3。
三、R质粒接合试验
接合体呈不透明蓝绿色，光滑湿润，边缘整齐，具有利福平和氯霉素抗性，未经接合的供、受体菌不能在含有抗菌素的中国蓝培养基上生长。接合体不能在含诺氟沙星培养基上生长。157株志贺菌均做R质粒接合试验。耐诺氟沙星的细菌的R质粒阳性率达90.4%。
讨论
本研究显示福氏志贺菌仍然是最常见的血清型，宋内和其它血清型少见。这与我国其它地区报道的情况相符合[6]。药物敏感试验表明福氏志贺菌对多种抗菌药物耐药尤其是对于四环素、氨苄西林
, http://www.100md.com
表1 156株福氏志贺菌的纸片法药敏结果(株数) 抗菌药物
耐药
中度敏感
敏感
耐药率
四环素
153
0
3
98.1
氨苄西林
148
6
, http://www.100md.com
2
94.9
复方新诺明
137
0
19
87.8
氯霉素
32
54
70
20.5
呋喃唑酮
, http://www.100md.com
1
13
142
0.6
诺氟沙星
43
11
102
27.6
氧氟沙星
18
24
114
, http://www.100md.com 11.5
环丙沙星
24
26
106
15.4
头孢唑啉
5
0
151
3.2
头孢曲松
4
1
, 百拇医药
151
2.6
氨曲南
2
2
152
1.3
庆大霉素
2
0
154
1.3
阿米卡星
, 百拇医药 1
0
155
0.6
奈替米星
1
0
155
0.6
表2 福氏志贺菌对抗菌药物的多重耐药情况 菌群
株数
耐药菌株数
10种
, 百拇医药
9种
8种
7种
6种
5种
4种
3种
2种
1种
0种
福氏志贺菌
156
2
1
, 百拇医药
1
5
10
12
52
65
6
1
1
表3 3种药物对志贺菌的最低药物抑菌浓度(mg/L) 菌种
株数
MIC范围
MIC50
, 百拇医药
MIC90
FPA
OFA
CPFA
FPA
OFA
CPFA
FPA
OFA
CPFA
福志
156
0.25～128
, http://www.100md.com
0.25～32
0.25～64
4
1
1
32
8
8
宋志
1
16
8
4
和复方新诺明的耐药率相当高，与其它报道相似[2，3]。本研究中发现福氏志贺菌对氟喹诺酮类抗菌药物有一定的耐药性，对诺氟沙星的耐药率达到了27.6%，某个医院竟达到53.3%(16/30)。质粒接合试验提示R质粒能介导福氏志贺菌对四环素，氨苄西林，复方新诺明等药物的多重耐药性，但不能介导细菌对氟喹诺酮类药物的耐药性，这与国内外研究结果相符合[1，7，8]。本研究中仅分离到1株宋内志贺菌但它对3种氟喹诺酮类药物均耐药，这是否会造成菌群流行态势的改变尚待进一步的观察。目前细菌对氟喹诺酮类药物耐药的机制已经明确，主要为编码细菌DNA旋转酶的基因发生点突变所致以及膜耐药。国外在对宋内和痢疾志贺菌对4-喹诺酮类药物耐药机制的研究中已经发现耐药细菌的GyrA基因发生了点突变[9，10]。我们推测志贺菌对氟喹诺酮类药物的耐药性仍然主要是由于编码细菌DNA旋转酶的基因突变所造成或由于细菌体内药物浓度的改变所致。因此严密监测细菌耐药情况和防止氟喹诺酮类药物的滥用对于细菌性痢疾的防治有重要的现实意义。 参考文献
, 百拇医药
1 包幼迪，俞树高，戴赓孙，等.痢疾杆菌耐药性变异的研究.中华微生物和免疫学杂志，1982，2：304-307.
2 聂青和，张开瑞，黄上媛，等.细菌性痢疾3018例的菌群分布与药敏试验.人民军医，1995，422：35-37.
3 孙殿兴，李仕英，张福广，等.1986～1995年629株痢疾杆菌菌型菌群分布及药敏调查.中华传染病杂志，1997，15：172-174.
4 娄永新，王金良主编.实用临床细菌学检验与进展.天津：天津科技翻译出版公司，1994.252-256.
5 张子康，何光泽主编.医学微生物与免疫学实验教程.成都：四川科学技术出版社，1989.39-40.
6 耿峪，夏光明，王丽，等.北京地区1979～1987年痢疾杆菌菌群菌型分布.中华预防医学杂志，1989，23：372-373.
, 百拇医药
7 Thirunarayanan MA, Jesudason MV, Jacob John T. Resistance of shigellae to nalidixic acid & fluorinated quinolones. Indian J Med Res[A],1993,11:239-241.
8 Courvalin P. Plasmid-mediated 4-quinolone resistance: a real or apparent absence? J Antimicrob Chemother,1990,34:681-684.
9 Rahman M, Mauff G, Levy J, et al. Detection of 4-quinolone resistance mutation in gyr A gene of shigella dysenteriae type by PCR. J Antimicrob Chemother,1994,38:2488-2491.
10 Horiuchi S, Iwagaki Y, Yamamoto N, et al. Reduced susceptibilities of shigella sonnei strains isolated from patients with dysentery to fluoroquinolones. J Antimicrob Chemother,1993,37:2486-2489., 百拇医药
单位：310016 杭州，浙江医科大学附属邵逸夫医院(丁建强)；浙江医科大学附属第一医院(马亦要、龚正、陈亚岗)
关键词：志贺菌；药物敏感试验；R质粒
中华传染病杂志980313 【摘要】 目的 调查志贺菌在流行季节的主要血清型和耐药性。方法 收集临床分离的志贺菌157株，进行血清学分型、药物敏感试验和R质粒接合试验。结果 除1株为宋内志贺菌外其余156株均为福氏志贺菌，福氏志贺菌对四环素、氨苄西林和复方新诺明高度耐药达85%以上。对诺氟沙星的耐药率也有27.6%，仅有的1株宋内志贺菌对诺氟沙星，氧氟沙星，环丙沙星均耐药。耐诺氟沙星的细菌的R质粒接合试验的阳性率为51.2%。结论 福氏志贺菌是主要的血清型，对多种抗菌药物有较高的耐药率，没有证据提示R质粒能介导对氟喹诺酮类药物的耐药性。
, 百拇医药 Study on resistance and R plasmid of epidemic strains of Shigellae Ding Jianqiang, Ma Yilin, Gong Zheng, et al. The First Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objective To investigate the serotypes and resistance of Shigellae in epidemic season. Methods One hundred and fifty-seven clinical isolates of Shigellae were collected and their serotypes were determined, while the susceptibility testing and R plasmid conjugation experiment were performed. Results Except for one Shigellae sonnei, 156 strains were Shigellae flexneri which were highly resistant to Tetracycline, Ampicillin and SMZco(resistance rate >85%). The resistance rate to Norfloxacin was 27.6%. The only isolate of Shigellae sonnei was resistant to three fluoroquinolones(Norfloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin). The positive rate of the R plasmid conjugation experiment was 51.2% in norfloxacin-resistant strains. Conclusion The results showed that Shigellae flexneri was the main serotype of epidemic strains, which had a relatively high resistance rate to various antibiotics. No evidence suggested R plasmid could mediate the resistance to fluoroquinolones.
, 百拇医药
【Key words】 Shigellae Susceptibility testing R plasmid
由志贺菌感染所致的细菌性痢疾是我国发病率仅次于乙型肝炎的第二大传染病，自磺胺等抗菌药物使用以来，由于R质粒介导的多重耐药性，志贺菌对氨苄西林，复方新诺明，四环素等药物的耐药率不断上升并呈现多重耐药现象[1]。80年代初开始使用氟喹诺酮类药物，志贺菌对这种药物的敏感率在95%以上[1，2]。但近年来已发现这种病原菌对诺氟沙星的敏感性已降至85%以下[3]。为了解志贺菌在流行季节的主要血清型和耐药性等情况，我们在1996年8月至10月在杭州，湖州，嘉兴，金华市四个地区搜集了157株志贺菌，进行了血清学分型，药物敏感试验和R质粒接合传递试验等研究并初步探讨志贺菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制。
材料和方法
一、标本的收集
, 百拇医药
取自门诊或住院患者粪便标本，共搜集志贺菌157株，其中杭州地区65株，湖州地区21株，嘉兴地区32株，金华地区39株，在当地经过初步鉴定后，统一送本院重新进行生化和血清学鉴定。
二、志贺菌属诊断血清
购自卫生部兰州生物制品研究所，批号960703。
三、抗菌药敏纸片
共有14种，除奈替米星药敏纸片为采用温州制药厂提供的标准品自行制作及氨曲南药敏纸片为中美上海施贵宝制药公司惠赠外，其余均购自浙江省军区后勤部卫生防疫检验所。包括：诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、氨苄西林、头孢曲松、氯霉素、头孢唑啉、四环素、阿米卡星、庆大霉素、呋喃唑酮。
四、药物敏感试验
纸片法采用Kirby-Bauer法，诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星3种抗菌药物同时进行最低抑菌浓度(MIC)测定，采用平皿双倍稀释法。所用药物：诺氟沙星标准品，浙江新昌制药厂生产，批号920807，效价99%。氧氟沙星标准品，浙江温州制药厂生产，批号930004，效价99.28%。环丙沙星标准品，浙江温州制药厂生产，批号930451，效价93.47%。质控菌为大肠埃希菌ATCC25922。诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星药敏纸片的含量分别为10μg、5μg和5μg。最低抑菌浓度测定值的判断标准为：诺氟沙星 敏感≤4 中介度 8 耐药≥16 氧氟沙星 敏感≤2 中度敏感 4 耐药≥8 环丙沙星敏感≤1 中度敏感 2 耐药≥4[4]。
, 百拇医药
五、R质粒接合试验
按张子康介绍的方法[5]将供、受体菌分别接种于中国蓝平板上，37°C过夜后分别将两种细菌转种于1ml肉汤中，37°C培养5～6小时。吸取供、受体菌液各0.02ml于0.5ml肉汤中，37°C水浴中接合2小时。在含有氯霉素(20mg/L)和利福平(100mg/L)的中国蓝平板上分别涂布0.05ml接合菌、受体菌和供体菌，置37°C培养过夜，并同时涂布在除氯霉素和利福平外另加有诺氟沙星(4mg/L)的中国蓝平板上。受体菌为大肠埃希菌K12W1485F-Rifr。
结果
一、血清学分型
结果显示在上述浙江四个地区流行季节的志贺菌属感染主要为福氏志贺菌，且以福氏ⅡA为主，有156株，宋内志贺菌1株，未能分离出其他血清型。
, 百拇医药
二、药物敏感试验
156株福氏志贺菌的纸片法药敏结果见表1。同时发现某些菌株对抗菌药物呈现高度耐药和多重耐药情况见表2。1株宋内志贺菌对诺氟沙星、氧氟沙星，环丙沙星，氨苄西林，四环素，复方新诺明耐药，对其它抗菌素敏感。3种氟喹诺酮类药物对志贺菌的最低抑菌浓度(MIC)测定结果见表3。
三、R质粒接合试验
接合体呈不透明蓝绿色，光滑湿润，边缘整齐，具有利福平和氯霉素抗性，未经接合的供、受体菌不能在含有抗菌素的中国蓝培养基上生长。接合体不能在含诺氟沙星培养基上生长。157株志贺菌均做R质粒接合试验。耐诺氟沙星的细菌的R质粒阳性率达90.4%。
讨论
本研究显示福氏志贺菌仍然是最常见的血清型，宋内和其它血清型少见。这与我国其它地区报道的情况相符合[6]。药物敏感试验表明福氏志贺菌对多种抗菌药物耐药尤其是对于四环素、氨苄西林
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表1 156株福氏志贺菌的纸片法药敏结果(株数) 抗菌药物
耐药
中度敏感
敏感
耐药率
四环素
153
0
3
98.1
氨苄西林
148
6
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2
94.9
复方新诺明
137
0
19
87.8
氯霉素
32
54
70
20.5
呋喃唑酮
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1
13
142
0.6
诺氟沙星
43
11
102
27.6
氧氟沙星
18
24
114
, http://www.100md.com 11.5
环丙沙星
24
26
106
15.4
头孢唑啉
5
0
151
3.2
头孢曲松
4
1
, 百拇医药
151
2.6
氨曲南
2
2
152
1.3
庆大霉素
2
0
154
1.3
阿米卡星
, 百拇医药 1
0
155
0.6
奈替米星
1
0
155
0.6
表2 福氏志贺菌对抗菌药物的多重耐药情况 菌群
株数
耐药菌株数
10种
, 百拇医药
9种
8种
7种
6种
5种
4种
3种
2种
1种
0种
福氏志贺菌
156
2
1
, 百拇医药
1
5
10
12
52
65
6
1
1
表3 3种药物对志贺菌的最低药物抑菌浓度(mg/L) 菌种
株数
MIC范围
MIC50
, 百拇医药
MIC90
FPA
OFA
CPFA
FPA
OFA
CPFA
FPA
OFA
CPFA
福志
156
0.25～128
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0.25～32
0.25～64
4
1
1
32
8
8
宋志
1
16
8
4
和复方新诺明的耐药率相当高，与其它报道相似[2，3]。本研究中发现福氏志贺菌对氟喹诺酮类抗菌药物有一定的耐药性，对诺氟沙星的耐药率达到了27.6%，某个医院竟达到53.3%(16/30)。质粒接合试验提示R质粒能介导福氏志贺菌对四环素，氨苄西林，复方新诺明等药物的多重耐药性，但不能介导细菌对氟喹诺酮类药物的耐药性，这与国内外研究结果相符合[1，7，8]。本研究中仅分离到1株宋内志贺菌但它对3种氟喹诺酮类药物均耐药，这是否会造成菌群流行态势的改变尚待进一步的观察。目前细菌对氟喹诺酮类药物耐药的机制已经明确，主要为编码细菌DNA旋转酶的基因发生点突变所致以及膜耐药。国外在对宋内和痢疾志贺菌对4-喹诺酮类药物耐药机制的研究中已经发现耐药细菌的GyrA基因发生了点突变[9，10]。我们推测志贺菌对氟喹诺酮类药物的耐药性仍然主要是由于编码细菌DNA旋转酶的基因突变所造成或由于细菌体内药物浓度的改变所致。因此严密监测细菌耐药情况和防止氟喹诺酮类药物的滥用对于细菌性痢疾的防治有重要的现实意义。 参考文献
, 百拇医药
1 包幼迪，俞树高，戴赓孙，等.痢疾杆菌耐药性变异的研究.中华微生物和免疫学杂志，1982，2：304-307.
2 聂青和，张开瑞，黄上媛，等.细菌性痢疾3018例的菌群分布与药敏试验.人民军医，1995，422：35-37.
3 孙殿兴，李仕英，张福广，等.1986～1995年629株痢疾杆菌菌型菌群分布及药敏调查.中华传染病杂志，1997，15：172-174.
4 娄永新，王金良主编.实用临床细菌学检验与进展.天津：天津科技翻译出版公司，1994.252-256.
5 张子康，何光泽主编.医学微生物与免疫学实验教程.成都：四川科学技术出版社，1989.39-40.
6 耿峪，夏光明，王丽，等.北京地区1979～1987年痢疾杆菌菌群菌型分布.中华预防医学杂志，1989，23：372-373.
, 百拇医药
7 Thirunarayanan MA, Jesudason MV, Jacob John T. Resistance of shigellae to nalidixic acid & fluorinated quinolones. Indian J Med Res[A],1993,11:239-241.
8 Courvalin P. Plasmid-mediated 4-quinolone resistance: a real or apparent absence? J Antimicrob Chemother,1990,34:681-684.
9 Rahman M, Mauff G, Levy J, et al. Detection of 4-quinolone resistance mutation in gyr A gene of shigella dysenteriae type by PCR. J Antimicrob Chemother,1994,38:2488-2491.
10 Horiuchi S, Iwagaki Y, Yamamoto N, et al. Reduced susceptibilities of shigella sonnei strains isolated from patients with dysentery to fluoroquinolones. J Antimicrob Chemother,1993,37:2486-2489., 百拇医药