原位杂交法检测外周血单个核细胞中HCV RN
作者：田德英 宋佩辉 王卫华 Tx.U
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院(田德英、宋佩辉、王卫华)德国海得堡大学内科医院(Tx.U)
关键词：原位杂交；肝炎病毒，丙型；外周血单个核细胞
中华传染病杂志980304 【摘要】 目的 比较慢性丙型肝炎患者用干扰素治疗前以及治疗后3个月PBMC中HCV RNA。方法 应用地高辛素标记HCV RNA正链及负链探针，建立原位杂交方法检测外周血单个核细胞(PMBC)中的HCV RNA。结果 治疗前19例患者正链HCV RNA阳性，8例负链HCV RNA阳性，用正链探针杂交在较多的细胞中出现杂交信号，负链探针杂交仅在少数细胞中出现杂交信号，HCV RNA在PBMC胞浆中呈均质性分布。用干扰素治疗结束后3个月20例患者中9例HCV RNA转阴性，近期治愈率45%。结论 原位杂交技术的敏感性及特异性较高，且重复性较好，是研究HCV RNA在组织中定位分布和病毒复制场所一种切实可行的方法。
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Detection of hepatitis C virus RNA in the peripheral blood mononuclear cells by in situ hybridization Tian Deying, Song Peihui, Wang Weihua, et al. Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To detect HCV RNA in PBMC of 20 cases with chronic hepatitis C before and after interferon (IFN) treatment for 3 months.Methods Using digoxin-labelled plus strand and minus strand HCV RNA probes,an in situ hybridization technique suitable for detecting HCV RNA in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was established. Results Before IFN treatment,plus strand HCV RNA could be detected in 19 cases and minus strand in 8 cases,the hybridization signal was detected in more cells by plus strand probes than by minus strand probes.HCV RNA distributed in the cytoplasm of PBMC homogeneously.After 3 months of IFN treatment,HCV RNA in 9 of 20 cases became negative (45%). Conclusion The results suggested that the in situ hybridization technique had high sensitivity,specificity and repeatability,which was practical for studying the location and replication of HCV RNA.
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【Key words】 In situ hybridization Hepatitis C virus Peripheral blood mononuclear cells
1980年Choo等[1]成功获得丙型肝炎病毒(HCV)基因组的cDNA克隆之后，丙型肝炎(丙肝)血清学诊断技术迅速发展，用PCR方法检测血清中HCV RNA已有大量报道。本实验应用地高辛标记531bp HCV RNA正、负链探针检测PBMC中的HCV RNA，现将方法及有关问题探讨如下。
材料和方法
一、试剂
碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体，蛋白酶K，体外转录地高辛标记试剂盒，RNA酶A(以上试剂均由Boehringer Mannheim出售)，焦碳酸二乙酯(DEPC，Sigma)，硝基四氮唑蓝(NBT)以及5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BICP，Promega Heidelberg)。
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预杂交液由本室自己配制，主要成份为：50%去离子甲酰胺，4×ssc、1×Denharts、500μg/ml poly(A)RNA等。
二、实验标本
外周血单个核细胞采自临床丙肝住院患者，其诊断经临床、生化检验及其丙肝血清学检验(包括血清HCV RNA检验)证实，阳性及阴性对照分别选用已被及未被丙肝病毒转染的COS细胞(以上两种细胞均由德国肿瘤研究中心Kru Ber教授惠赠)，及以往证实为HCV RNA阳性及阴性患者的PBMC。
三、方法
(一) 探针的制备及纯化 含HCV 5′-NC的cDNA Bluescript KS质粒(由德国海得堡大学内科医院Theilmann教授提供)，参照分子克隆实验指南提取质粒[2]，分别用EcoRⅠ及BamHⅠ酶切，用EcoRⅠ酶切的cDNA片段用T7 RNA多聚酶合成正链HCV RNA探针，用BamHⅠ酶切cDNA片段用T3多聚酶合成负链HCV RNA探针(两者均来自丙肝病毒基因的5′非编码区和核心区第59-590位碱基区)。280bp β-actin RNA探针来自鼠β-actin 3′非编码区第190-470位碱基区(此探针由Theilmann教授提供)。采用体外转录地高辛标记试剂盒，用地高辛标记探针，方法按试剂盒说明进行。探针纯化采用Sephadex G50柱层析，共收集15管，每管收集15滴，最后取各管收集液1μl点于硝酸膜上，空气干燥后滴加抗Dig-Ap,用NBT和BICP显色，显示出蓝色即可确定为回收探针后，用苯酚氯仿抽提，1/10体积3mol/L NaAc和50ngt RNA分离离心，100%冰酒精漂洗，空气干燥加预杂交液置于-80℃冰箱保存备用。
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(二) 实验标本的处理 10ml血标本用肝素抗凝，经淋巴细胞分层液分离(Ficoll-Hapane)离心，洗涤后调整PBMC浓度为1×107/ml，-80℃保存或者立即制片。玻片涂上多聚赖氨酸粘附剂，每张玻片滴上10μl PBMC 1×107/ml，于湿盒温化30分钟，用4%多聚甲醛固定，洗涤、脱水、空气干燥，-80℃冰箱保存。
(三) 原位杂交 参照Dr Eugenia等[3～5]报道的方法。
(四) 设置对照组 阳性对照设两组：1.被丙肝病毒转染的COS细胞。2.应用β-Actin-RNA探针检测PBMC中β-Actin-mRNA(β-肌动蛋白)。阴性对照设两组：1.慢性丙肝患者PBMC，在杂交前用RNA酶A消化15分钟。2.健康志愿者PBMC。
结 果
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一、Dig-HCV RNA探针浓度对实验结果的影响
取4份血清抗-HCV阳性血清和HCV RNA阳性患者PBMC以及4份被丙肝病毒转染的COS细胞(阳性对照)，8份健康志愿者PBMC(阴性对照)用不同浓度Dig-HCV RNA正链探针进行HCV RNA检测，结果表明探针浓度0.15μg～0.45μg/ml范围以内阳性对照和阴性对照均为阴性，0.6μg/ml时4份被丙肝病毒转染COS为阳性，4份阳性对照组PBMC中有3份显示出特异性杂交信号，阴性对照组无杂交信号，提示探针的最佳浓度为0.6μg/ml。0.75μg/ml时7份阳性对照虽为阳性但背景较高显示出非特异性杂交信号，阴性对照仍为阴性。
二、蛋白酶K浓度对实验结果的影响
采用各种不同浓度的蛋白酶K，用β-Actin RNA探针及原位杂交技术检测COS细胞中β-Actin-mRNA，结果显示未用蛋白酶K消化和浓度在1μg/ml以内的标本无特异性杂交信号，10μg～20μg/ml浓度范围内在细胞胞浆和核中可见特异性杂交信号呈均质性分布，25μg/ml时虽可见杂交信号，但细胞形态已被破坏，当蛋白酶K浓度为100μg/ml时，不仅杂交结果为阴性而且细胞形态完全被破坏。
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三、方法的特异性及重复性
取8份血清抗-HCV及HCV RNA阳性患者的PBMC，采用Dig-HCV RNA正链探针杂交检测PBMC中HCV RNA。同时设置两组阳性对照，两组阴性对照，每个对照组均有2份标本，结果表明8例丙肝患者中7例PBMC中HCV RNA阳性，阳性对照组为阳性，阴性对照组为阴性，上述方法重复四次，结果均一致。
四、实验结果的表达
被丙肝病毒转染的COS细胞作为阳性对照，用Dig-HCV RNA正链探针杂交，结果显示特异性杂交信号在20%细胞胞浆和核中呈弥漫性分布(见图1)，而在杂交前用RNA酶A消化(阴性对照)无杂交信号显示(见图2)。用β-Actin RNA探针检测健康志愿者PBMC中β-Actin mRNA(阳性对照)结果显示特异性的杂交信号出现在90% PBMC的胞浆中。用Dig-HCV RNA正负探针对慢性丙肝患者PBMC进行正、负链HCV RNA检测，用正链探针杂交在较多的细胞中出现杂交信号，而用负链探针杂交，仅在少数细胞中出现杂交信号，特异性杂交信号呈均质性分布在PBMC的胞浆中。
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图1 被丙肝病毒转染COS细胞，采用正链探针杂交，HCV RNA位于COS细胞核和胞浆内呈弥漫性分布×100
图2 被丙肝病毒转染COS细胞，采用正链探针杂交前，用RNA酶A消化，无特异性杂交信号×100五、临床检测
采用Dig-HCV RNA正、负链探针用原位杂交技术检测20例经临床、血清学(抗-HCV、HCV RNA均为阳性)和病理证实的慢性丙肝患者在用干扰素治疗前和用干扰素治疗(患者给予a2b-IFN美国Schring plough公司产品)结束后3个月PBMC中HCV RNA。每周3次肌内注射，每次300万单位疗程6个月，用干扰素前20例患者中正、负链HCV RNA同时阳性8例，正链HCV RNA阳性11例，余下一例正、负链HCV RNA均为阴性经干扰素治疗结束后3个月，9/20例患者正、负链RNA均为阴性，其中有4例在治疗前正、负链HCV RNA阳性，总的转阴率为45%。治疗结束后3个月，10/20例患者血清中抗-HCV、HCV RNA阴转。
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讨 论
本试验应用地高辛标记HCV RNA正、负链探针建立原位杂交法，对PBMC进行正、负链HCV RNA测定，结果表明此项技术有较高的敏感性和特异性且重复性好。检测20例慢性丙肝患者用干扰素治疗前和治疗后3个月PBMC中HCV RNA，结果显示干扰素治疗后，20例患者中9例HCV RNA转阴性，近期治愈率为45%。用正链探针杂交在较多的细胞中出现杂交信号，负链探针杂交仅在少数细胞中出现杂交信号，HCV RNA在PBMC胞浆中呈均质性分布。文献报告HCV是单股正链RNA病毒，呈RNA-RNA复制，负链为RNA复制模板[6]，提示PBMC是丙肝病毒复制场所。
文献报道慢性丙肝患者肝组织损害除了与HCV RNA血症有关外，与PBMC中HCV感染也可能有关[7，8]。我们检测20例慢性丙肝患者中19例正链HCV RNA阳性，表明丙肝的慢性化与PBMC感染有关，PBMC内HCV可不断经循环到达肝脏、致敏细胞，引起肝细胞的反复感染和破坏导致肝炎的慢性变乃致肝硬化。
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本研究Dig-HCV RNA 531bp正、负链探针来自5′非编码区及核心区，其探针片断长且又处于高度保守区，变异性小，对实验的成功起了至关重要的作用。我们采用Sephadex G50柱层析法纯化探针，其目的是为了提高杂交的专一性，降低背景，该方法虽然操作复杂但提纯效率高，杂交效果好。蛋白酶K浓度10～20μg/ml为最佳浓度范围，低于1μg/ml探针不能进入组织，阳性对照标本呈阴性，高于25μg/ml致使细胞大量破坏，本实验蛋白酶K浓度20μg/ml为最合适浓度。
本实验为避免假阳性采用了健康志愿者PBMC和被丙肝病毒转染的COS细胞在杂交前用RNA酶消化，为了防止RNA酶的污染出现假阴性用β-Actin RNA探针检测PBMC中β-Actin-mRNA。在实验过程中为了防止RNA酶的污染，除实验者需带乳胶手套外，杂交前所有溶液均用0.1% DEPC液配制，并进行高压消毒。我们通过优化实验条件及一系列特异性确证实验，认为此项技术敏感性及特异性均高，且重复性好，是研究HCV RNA在细胞及组织中定位分布和病毒复制场所一种方法。
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本课题受国家教委、卫生部资助
作者单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院(田德英、宋佩辉、王卫华)德国海得堡大学内科医院(T
x.U)
参考文献
1 Choo QL,Kuo G,Weiner AJ,et al.Isolation of cDNA clone derived from a blood-borne non-A,non-B viral hepatitis genome.Science，1989，244：359-362.
2 Sambrook JF,Maniatis T.(金冬雁等)分子克隆实验指南.第二版.北京科学出版社,1992.16-23.
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3 Eugenia L,Paloa B,Chantal H,et al.Detection of hepatitis C virus (HCV) RNA sequence in liver tissue by in situ hybridization.J Hepatology,1992，16：219-223.
4 Tanaka Y,Enomoto N,Kojimas,et al.Detection of hepatitis C virus RNA in the liver by in situ hybridization.Liver，1993，13：203-208.
5 Zhang YM,Bachmann S,Hemmer C,et al.Vascular origin of kaposis sarcoma expression of leukocyte adhesion molecule-1,thrombomodulin,and tissue factor.Am J Pathol,1994，144：51-59.
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6 Naoya S,Nobuyuki E,Masayuki K,et al.Detection and quantification of hepatitis C virus RNA replication in the liver.J Hepatology,1994，20：593-597.
7 Kurasaki M,Enomoto N,Sato C,et al.Correlation of plasma hepatitis C virus RNA levels with serum alarine aminotransferase in non-A,non-B chronic liver diease.J Med Virol,1993，39：246-250.
8 Jeffers LJ,Dailey PJ,Coelho-Little E,et al.Correlation of HCV RNA quantitation in sera and liver tissue of patients with chronic C hepatitis.Gastroenterol,1993，104：A923., 百拇医药
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院(田德英、宋佩辉、王卫华)德国海得堡大学内科医院(Tx.U)
关键词：原位杂交；肝炎病毒，丙型；外周血单个核细胞
中华传染病杂志980304 【摘要】 目的 比较慢性丙型肝炎患者用干扰素治疗前以及治疗后3个月PBMC中HCV RNA。方法 应用地高辛素标记HCV RNA正链及负链探针，建立原位杂交方法检测外周血单个核细胞(PMBC)中的HCV RNA。结果 治疗前19例患者正链HCV RNA阳性，8例负链HCV RNA阳性，用正链探针杂交在较多的细胞中出现杂交信号，负链探针杂交仅在少数细胞中出现杂交信号，HCV RNA在PBMC胞浆中呈均质性分布。用干扰素治疗结束后3个月20例患者中9例HCV RNA转阴性，近期治愈率45%。结论 原位杂交技术的敏感性及特异性较高，且重复性较好，是研究HCV RNA在组织中定位分布和病毒复制场所一种切实可行的方法。
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Detection of hepatitis C virus RNA in the peripheral blood mononuclear cells by in situ hybridization Tian Deying, Song Peihui, Wang Weihua, et al. Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To detect HCV RNA in PBMC of 20 cases with chronic hepatitis C before and after interferon (IFN) treatment for 3 months.Methods Using digoxin-labelled plus strand and minus strand HCV RNA probes,an in situ hybridization technique suitable for detecting HCV RNA in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was established. Results Before IFN treatment,plus strand HCV RNA could be detected in 19 cases and minus strand in 8 cases,the hybridization signal was detected in more cells by plus strand probes than by minus strand probes.HCV RNA distributed in the cytoplasm of PBMC homogeneously.After 3 months of IFN treatment,HCV RNA in 9 of 20 cases became negative (45%). Conclusion The results suggested that the in situ hybridization technique had high sensitivity,specificity and repeatability,which was practical for studying the location and replication of HCV RNA.
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【Key words】 In situ hybridization Hepatitis C virus Peripheral blood mononuclear cells
1980年Choo等[1]成功获得丙型肝炎病毒(HCV)基因组的cDNA克隆之后，丙型肝炎(丙肝)血清学诊断技术迅速发展，用PCR方法检测血清中HCV RNA已有大量报道。本实验应用地高辛标记531bp HCV RNA正、负链探针检测PBMC中的HCV RNA，现将方法及有关问题探讨如下。
材料和方法
一、试剂
碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体，蛋白酶K，体外转录地高辛标记试剂盒，RNA酶A(以上试剂均由Boehringer Mannheim出售)，焦碳酸二乙酯(DEPC，Sigma)，硝基四氮唑蓝(NBT)以及5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BICP，Promega Heidelberg)。
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预杂交液由本室自己配制，主要成份为：50%去离子甲酰胺，4×ssc、1×Denharts、500μg/ml poly(A)RNA等。
二、实验标本
外周血单个核细胞采自临床丙肝住院患者，其诊断经临床、生化检验及其丙肝血清学检验(包括血清HCV RNA检验)证实，阳性及阴性对照分别选用已被及未被丙肝病毒转染的COS细胞(以上两种细胞均由德国肿瘤研究中心Kru Ber教授惠赠)，及以往证实为HCV RNA阳性及阴性患者的PBMC。
三、方法
(一) 探针的制备及纯化 含HCV 5′-NC的cDNA Bluescript KS质粒(由德国海得堡大学内科医院Theilmann教授提供)，参照分子克隆实验指南提取质粒[2]，分别用EcoRⅠ及BamHⅠ酶切，用EcoRⅠ酶切的cDNA片段用T7 RNA多聚酶合成正链HCV RNA探针，用BamHⅠ酶切cDNA片段用T3多聚酶合成负链HCV RNA探针(两者均来自丙肝病毒基因的5′非编码区和核心区第59-590位碱基区)。280bp β-actin RNA探针来自鼠β-actin 3′非编码区第190-470位碱基区(此探针由Theilmann教授提供)。采用体外转录地高辛标记试剂盒，用地高辛标记探针，方法按试剂盒说明进行。探针纯化采用Sephadex G50柱层析，共收集15管，每管收集15滴，最后取各管收集液1μl点于硝酸膜上，空气干燥后滴加抗Dig-Ap,用NBT和BICP显色，显示出蓝色即可确定为回收探针后，用苯酚氯仿抽提，1/10体积3mol/L NaAc和50ngt RNA分离离心，100%冰酒精漂洗，空气干燥加预杂交液置于-80℃冰箱保存备用。
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(二) 实验标本的处理 10ml血标本用肝素抗凝，经淋巴细胞分层液分离(Ficoll-Hapane)离心，洗涤后调整PBMC浓度为1×107/ml，-80℃保存或者立即制片。玻片涂上多聚赖氨酸粘附剂，每张玻片滴上10μl PBMC 1×107/ml，于湿盒温化30分钟，用4%多聚甲醛固定，洗涤、脱水、空气干燥，-80℃冰箱保存。
(三) 原位杂交 参照Dr Eugenia等[3～5]报道的方法。
(四) 设置对照组 阳性对照设两组：1.被丙肝病毒转染的COS细胞。2.应用β-Actin-RNA探针检测PBMC中β-Actin-mRNA(β-肌动蛋白)。阴性对照设两组：1.慢性丙肝患者PBMC，在杂交前用RNA酶A消化15分钟。2.健康志愿者PBMC。
结 果
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一、Dig-HCV RNA探针浓度对实验结果的影响
取4份血清抗-HCV阳性血清和HCV RNA阳性患者PBMC以及4份被丙肝病毒转染的COS细胞(阳性对照)，8份健康志愿者PBMC(阴性对照)用不同浓度Dig-HCV RNA正链探针进行HCV RNA检测，结果表明探针浓度0.15μg～0.45μg/ml范围以内阳性对照和阴性对照均为阴性，0.6μg/ml时4份被丙肝病毒转染COS为阳性，4份阳性对照组PBMC中有3份显示出特异性杂交信号，阴性对照组无杂交信号，提示探针的最佳浓度为0.6μg/ml。0.75μg/ml时7份阳性对照虽为阳性但背景较高显示出非特异性杂交信号，阴性对照仍为阴性。
二、蛋白酶K浓度对实验结果的影响
采用各种不同浓度的蛋白酶K，用β-Actin RNA探针及原位杂交技术检测COS细胞中β-Actin-mRNA，结果显示未用蛋白酶K消化和浓度在1μg/ml以内的标本无特异性杂交信号，10μg～20μg/ml浓度范围内在细胞胞浆和核中可见特异性杂交信号呈均质性分布，25μg/ml时虽可见杂交信号，但细胞形态已被破坏，当蛋白酶K浓度为100μg/ml时，不仅杂交结果为阴性而且细胞形态完全被破坏。
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三、方法的特异性及重复性
取8份血清抗-HCV及HCV RNA阳性患者的PBMC，采用Dig-HCV RNA正链探针杂交检测PBMC中HCV RNA。同时设置两组阳性对照，两组阴性对照，每个对照组均有2份标本，结果表明8例丙肝患者中7例PBMC中HCV RNA阳性，阳性对照组为阳性，阴性对照组为阴性，上述方法重复四次，结果均一致。
四、实验结果的表达
被丙肝病毒转染的COS细胞作为阳性对照，用Dig-HCV RNA正链探针杂交，结果显示特异性杂交信号在20%细胞胞浆和核中呈弥漫性分布(见图1)，而在杂交前用RNA酶A消化(阴性对照)无杂交信号显示(见图2)。用β-Actin RNA探针检测健康志愿者PBMC中β-Actin mRNA(阳性对照)结果显示特异性的杂交信号出现在90% PBMC的胞浆中。用Dig-HCV RNA正负探针对慢性丙肝患者PBMC进行正、负链HCV RNA检测，用正链探针杂交在较多的细胞中出现杂交信号，而用负链探针杂交，仅在少数细胞中出现杂交信号，特异性杂交信号呈均质性分布在PBMC的胞浆中。
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图1 被丙肝病毒转染COS细胞，采用正链探针杂交，HCV RNA位于COS细胞核和胞浆内呈弥漫性分布×100
图2 被丙肝病毒转染COS细胞，采用正链探针杂交前，用RNA酶A消化，无特异性杂交信号×100五、临床检测
采用Dig-HCV RNA正、负链探针用原位杂交技术检测20例经临床、血清学(抗-HCV、HCV RNA均为阳性)和病理证实的慢性丙肝患者在用干扰素治疗前和用干扰素治疗(患者给予a2b-IFN美国Schring plough公司产品)结束后3个月PBMC中HCV RNA。每周3次肌内注射，每次300万单位疗程6个月，用干扰素前20例患者中正、负链HCV RNA同时阳性8例，正链HCV RNA阳性11例，余下一例正、负链HCV RNA均为阴性经干扰素治疗结束后3个月，9/20例患者正、负链RNA均为阴性，其中有4例在治疗前正、负链HCV RNA阳性，总的转阴率为45%。治疗结束后3个月，10/20例患者血清中抗-HCV、HCV RNA阴转。
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本试验应用地高辛标记HCV RNA正、负链探针建立原位杂交法，对PBMC进行正、负链HCV RNA测定，结果表明此项技术有较高的敏感性和特异性且重复性好。检测20例慢性丙肝患者用干扰素治疗前和治疗后3个月PBMC中HCV RNA，结果显示干扰素治疗后，20例患者中9例HCV RNA转阴性，近期治愈率为45%。用正链探针杂交在较多的细胞中出现杂交信号，负链探针杂交仅在少数细胞中出现杂交信号，HCV RNA在PBMC胞浆中呈均质性分布。文献报告HCV是单股正链RNA病毒，呈RNA-RNA复制，负链为RNA复制模板[6]，提示PBMC是丙肝病毒复制场所。
文献报道慢性丙肝患者肝组织损害除了与HCV RNA血症有关外，与PBMC中HCV感染也可能有关[7，8]。我们检测20例慢性丙肝患者中19例正链HCV RNA阳性，表明丙肝的慢性化与PBMC感染有关，PBMC内HCV可不断经循环到达肝脏、致敏细胞，引起肝细胞的反复感染和破坏导致肝炎的慢性变乃致肝硬化。
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本研究Dig-HCV RNA 531bp正、负链探针来自5′非编码区及核心区，其探针片断长且又处于高度保守区，变异性小，对实验的成功起了至关重要的作用。我们采用Sephadex G50柱层析法纯化探针，其目的是为了提高杂交的专一性，降低背景，该方法虽然操作复杂但提纯效率高，杂交效果好。蛋白酶K浓度10～20μg/ml为最佳浓度范围，低于1μg/ml探针不能进入组织，阳性对照标本呈阴性，高于25μg/ml致使细胞大量破坏，本实验蛋白酶K浓度20μg/ml为最合适浓度。
本实验为避免假阳性采用了健康志愿者PBMC和被丙肝病毒转染的COS细胞在杂交前用RNA酶消化，为了防止RNA酶的污染出现假阴性用β-Actin RNA探针检测PBMC中β-Actin-mRNA。在实验过程中为了防止RNA酶的污染，除实验者需带乳胶手套外，杂交前所有溶液均用0.1% DEPC液配制，并进行高压消毒。我们通过优化实验条件及一系列特异性确证实验，认为此项技术敏感性及特异性均高，且重复性好，是研究HCV RNA在细胞及组织中定位分布和病毒复制场所一种方法。
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本课题受国家教委、卫生部资助
作者单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院(田德英、宋佩辉、王卫华)德国海得堡大学内科医院(T
x.U)参考文献
1 Choo QL,Kuo G,Weiner AJ,et al.Isolation of cDNA clone derived from a blood-borne non-A,non-B viral hepatitis genome.Science，1989，244：359-362.
2 Sambrook JF,Maniatis T.(金冬雁等)分子克隆实验指南.第二版.北京科学出版社,1992.16-23.
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3 Eugenia L,Paloa B,Chantal H,et al.Detection of hepatitis C virus (HCV) RNA sequence in liver tissue by in situ hybridization.J Hepatology,1992，16：219-223.
4 Tanaka Y,Enomoto N,Kojimas,et al.Detection of hepatitis C virus RNA in the liver by in situ hybridization.Liver，1993，13：203-208.
5 Zhang YM,Bachmann S,Hemmer C,et al.Vascular origin of kaposis sarcoma expression of leukocyte adhesion molecule-1,thrombomodulin,and tissue factor.Am J Pathol,1994，144：51-59.
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6 Naoya S,Nobuyuki E,Masayuki K,et al.Detection and quantification of hepatitis C virus RNA replication in the liver.J Hepatology,1994，20：593-597.
7 Kurasaki M,Enomoto N,Sato C,et al.Correlation of plasma hepatitis C virus RNA levels with serum alarine aminotransferase in non-A,non-B chronic liver diease.J Med Virol,1993，39：246-250.
8 Jeffers LJ,Dailey PJ,Coelho-Little E,et al.Correlation of HCV RNA quantitation in sera and liver tissue of patients with chronic C hepatitis.Gastroenterol,1993，104：A923., 百拇医药