TTV在非甲-庚型肝炎患者中的检测、克隆及测序
作者：周伯平 马为民 孙彤 王火生 徐六妹 袁静 蒋小玲 付涌水
单位：518020 广东省深圳市肝病研究所(周伯平、马为民、王火生、徐六妹、袁静、蒋小玲)；中国科学院微生物研究所(孙彤)；广州市中心血站(付涌水)
关键词：非甲-庚型肝炎；TT病毒；克隆，分子；序列分析，DNA
中华传染病杂志980301 【摘要】 目的 分析TTV(Transfusion transmitted virus)深圳分离株ORF1部分基因序列。方法 在TTV ORF1设计引物，建立巢式聚合酶链反应(Nested-PCR)，检测40例广东地区非甲-庚型肝炎患者血清中TTV DNA。对PCR产物进行分子克隆，以荧光法(Applied Biosystems,373A)测序。结果 40例非甲-庚型肝炎中21例TTV DNA阳性(52.5%)。对其中一株TTV(SZ1)ORF1部分基因克隆、测序，并与Okamoto等报道的2株(N22、G1a)相比较，其核苷酸序列的同源性分别为96.7%与97.4%。结论 本研究证实我国华南地区存在TTV感染。TTV的分子克隆与测序及PCR诊断技术的建立对国内进一步开展TTV感染的诊断与流行病学调查均具有重要意义。
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Molecular cloning and sequencing of TT virus and its detection in patients with non A-G hepatitis Zhou Boping, Ma Weimin, Sun Tong, et al. Shenzhen Research Institute of Hepatology, Shenzhen 518020
【Abstract】 Objective To analyse partial nucleotide sequence of ORF1 of TTV (transfusion transmitted virus) isolated from a patient with non A-G hepatitis in Shenzhen. Methods A nested polymerase chain reaction (PCR) assay with primers from ORF1 of TTV genome was established to detect TTV DNA in 40 patients with non A-G hepatitis in Guangdong.PCR product was cloned and sequenced with the Applied Biosystems (373A). Results TTV DNA was positive in 21 of 40 patients (52.5%) with non A-G hepatitis.Partial gene of ORF1 of a TTV isolate (SZ1) was cloned,sequenced and compared with known sequences of TTV isolates (N22,G1a) reported by Okamoto.The nucleotide homology were 96.7% between SZ1 and N22,97.4% between SZ1 and G1a.Conclusion The results of this study confirmed the epidemic of TTV infection in Southern China.The cloning and sequencing of the TTV isolate (SZ1) and the development of a PCR assay for detecting TTV DNA has important implication for the diagnosis and epidemiological investigation on TTV infection.
, 百拇医药
【Key words】 Non A-G hepatitis TT virus Cloning,Molecular
Sequence analysis,DNA
在肝炎的病原学诊断过程中发现，有相当一部分(10%～20%)输血后或散发性肝炎患者不能用现有的检测方法检出其病毒学标志[1，2]，提示在已经认识的甲、乙、丙、丁、戊型5种肝炎病毒之外，还存在其他尚未被发现的病原体。1995年底发现的庚型肝炎病毒(HGV)虽然能引起人类感染[3～5]，但其致病性仍未确定[6～8]。最近，日本学者采用先进的分子生物学技术从一例输血后肝炎患者血清中分离到一种新的肝炎相关病毒DNA克隆(N22)，暂命名为TTV病毒(TTV)[9，10]。为了解我国华南地区TTV感染情况，我们采用PCR技术对广东地区40例非甲-庚型肝炎患者血清TTV DNA进行检测，并对其中一株TTV ORF1部分基因进行分子克隆与核苷酸序列分析，现报告如下。
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材料与方法
一、病例来源
1995年12月～1998年2月深圳市东湖医院与广州医学院附二医院所收治的40例非甲-庚型肝炎患者，其中深圳市东湖医院24例，广州医学院附二医院16例。40例患者中男26例，女14例，年龄7～54岁。全部病例血清甲、乙、丙、丁、戊及庚型肝炎病毒标志物，包括HBV DNA、HCV RNA与HGV RNA均阴性。
二、血清标本的收集
采用经高压灭菌处理的一次性带盖试管，空腹抽取静脉血10ml，离心分离血清，分装后-30℃保存备用。
三、主要试剂
Taq DNA聚合酶、dNTPs、低溶点琼脂糖及琼脂酶购自Promega公司。Klenow酶、T4DNA连接酶、质粒pUC18均为Boehringer Mannheim公司产品。大肠杆菌DH5α由中山医科大学分子医学中心提供。
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四、TTV引物合成
根据Okamoto等[10]报道的TTV基因序列，采用Goldkey软件，在TTV ORF1的保守区设计两对套式引物，委托上海Sangon生物工程公司合成。引物序列如下：T1 5′ACAGACAGAGGAGAAGGCAAC 3′，T2 5′GGATACCTATTAGCT
CTCAT 3′，T3 5′GGCAACATGTTATGGATAG
AC 3′，T4 5′CCTGGCATTTTACCATTTCCA3′。
其中T1与T2为外引物，T3与T4为内引物，扩增产物长度272bp。
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五、TTV DNA的PCR扩增
采用蛋白酶K法提取血清中TTV DNA。第1次PCR体系含引物T1与T2各20pmol/L、2mmol/L、dNTPs 3μl、Taq酶2U、10×Taq酶buffer 3μl，加入含TTV DNA模板的离心管中，反应总体积30μl。用石蜡油封顶后放PCR扩增仪上，按下列参数循环：94℃ 40秒，56℃ 35秒，72℃ 45秒，共30个循环，最后72℃延伸7分钟。第2次PCR体系含引物T3和T4各20pmol/L、2mmol/L的dNTPs 3μl、Taq酶2U、10×Taq酶buffer 3μl，第一次PCR产物2μl，反应总体积30μl,循环参数同上。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外检测仪上观察结果,出现272bp DNA扩增带者为阳性。
六、TTV DNA分子克隆与测序
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取第2次PCR产物，用低溶点琼脂糖回收纯化，再用Klenow酶补平后，经T4 DNA连接酶将其与经SmaⅠ酶切后的pUC18连接，转化DH5α，挑白斑经PCR鉴定，筛选阳性克隆。用碱裂解/PEG沉淀法提取质粒，采用通用引物，经荧光自动测序仪(Applied Biosystems,373A)进行双向测序。
结 果
一、PCR产物电泳结果
阳性标本扩增产物272bp,与预期大小一致(见图1)。
二、TTV DNA检测结果
40例非甲-庚型肝炎患者中，血清TTV阳性者21例(52.5%)。
三、TTV DNA克隆序列测定结果
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对从1例散发性非甲-庚型肝炎患者血清中
1.3.5.阳性标本(272bp). 2.4.阴性标本
6.DNA分子量标准(100bp DNA ladder)
图1 TTV DNA的PCR产物电泳图
图2 TTV深圳株(SZ1)与日本株(N22，G1a)序列比较
获得的TTV DNA克隆(SZ1)ORF1区部分基因的测序结果表明，其核苷酸序列与Okamoto等[10]报道的TTV N22、G1a克隆的同源性分别为96.7%与97.4%(见图2)。
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讨 论
TTV是继甲、乙、丙、丁、戊及庚型肝炎病毒之后最近才被发现的又一新型肝炎相关病毒[9，10]，初步研究表明TTV为一单股DNA病毒，无包膜。目前已测定的TTV基因序列长约3.7kb,含有ORF1与ORF2两个开放读码框，分别编码770与202个氨基酸。序列分析表明，不同TTV分离株ORF1部分基因核苷酸变异可达30%[10]。
我们根据Okamoto等[10]报道的TTV序列，选择保守区设计两对引物，采用套式PCR法对广东地区40例非甲-庚型肝炎患者血清进行TTV DNA检测，结果21例阳性(52.5%)，表明非甲-庚型肝炎患者中TTV感染率较高，这与其报道的46%相似。对其中1例散发性TTV病毒株(SZ1)ORF1区部分基因进行分子克隆与测序，发现TTV-SZ1与Okamoto等[10]报道的N22、G1a克隆的核苷酸序列的同源性分别为96.7%与97.4%，表明TTV-SZ1与N22、G1a属同一亚型，这是我国华南地区首次证实的TTV感染。TTV深圳分离株的分子克隆与核苷酸序列测定及PCR诊断技术的建立对我国进一步开展TTV感染的流行病学调查及防治研究均具有重要意义。
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本课题受深圳市优秀青年科技人才基金资助
参考文献
1 Buti M,Jardi R,Rodriguez-Frais F,et al.Etiology of acute sporadic hepatitis in Spain:The role of hepatitis C and E viruses. J Hepatol,1994，20：589-592.
2 Kuwada SK,Patel VM,Hollinger B,et al.Non-A,non-B fulminant hepatitis is also non-E and non-C.Am J Gastroenterol,1994，89：57-61.
3 Simons JN,Leary TP,Dawson GJ,et al.Isolation of a novel virus-like sequence associated with human hepatitis.Nature Medicine,1995,1：564-569.
, 百拇医药
4 Linnen J,Wages J,Zhang-keck ZY,et al.Molecular cloning and diseases association of hepatitis G virus:a transfusion-transmissible agent.Science,1996，271：505-508.
5 Leary TP,Muerhoff AS,Simons JN,et al. Sequence and genomic organization of GBV-C:a novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis.J Med Virol,1996，48：60-67.
6 Alter HJ.The cloning and clinical implications of HGV and HGBV-C.NEJM,1996，334：1536-1537.
, http://www.100md.com
7 Miyakawa Y,Mayumi M.Hepatitis G virus:a true hepatitis virus or an accidental tourist?NEJM,1997，336：795-796.
8 Alter HJ,Nakatsuji Y,Melpolder J,et al.The incidence of transfusion-associated hepatitis G virus infection and its relation to liver disease.NEJM,1997,336：747-754.
9 Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al.A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etioloty.Biochem Biophys Res Commun,1997，241：92-97.
10 Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al.Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etioloty.Hepatology Research,1998，10：1-15., 百拇医药
单位：518020 广东省深圳市肝病研究所(周伯平、马为民、王火生、徐六妹、袁静、蒋小玲)；中国科学院微生物研究所(孙彤)；广州市中心血站(付涌水)
关键词：非甲-庚型肝炎；TT病毒；克隆，分子；序列分析，DNA
中华传染病杂志980301 【摘要】 目的 分析TTV(Transfusion transmitted virus)深圳分离株ORF1部分基因序列。方法 在TTV ORF1设计引物，建立巢式聚合酶链反应(Nested-PCR)，检测40例广东地区非甲-庚型肝炎患者血清中TTV DNA。对PCR产物进行分子克隆，以荧光法(Applied Biosystems,373A)测序。结果 40例非甲-庚型肝炎中21例TTV DNA阳性(52.5%)。对其中一株TTV(SZ1)ORF1部分基因克隆、测序，并与Okamoto等报道的2株(N22、G1a)相比较，其核苷酸序列的同源性分别为96.7%与97.4%。结论 本研究证实我国华南地区存在TTV感染。TTV的分子克隆与测序及PCR诊断技术的建立对国内进一步开展TTV感染的诊断与流行病学调查均具有重要意义。
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Molecular cloning and sequencing of TT virus and its detection in patients with non A-G hepatitis Zhou Boping, Ma Weimin, Sun Tong, et al. Shenzhen Research Institute of Hepatology, Shenzhen 518020
【Abstract】 Objective To analyse partial nucleotide sequence of ORF1 of TTV (transfusion transmitted virus) isolated from a patient with non A-G hepatitis in Shenzhen. Methods A nested polymerase chain reaction (PCR) assay with primers from ORF1 of TTV genome was established to detect TTV DNA in 40 patients with non A-G hepatitis in Guangdong.PCR product was cloned and sequenced with the Applied Biosystems (373A). Results TTV DNA was positive in 21 of 40 patients (52.5%) with non A-G hepatitis.Partial gene of ORF1 of a TTV isolate (SZ1) was cloned,sequenced and compared with known sequences of TTV isolates (N22,G1a) reported by Okamoto.The nucleotide homology were 96.7% between SZ1 and N22,97.4% between SZ1 and G1a.Conclusion The results of this study confirmed the epidemic of TTV infection in Southern China.The cloning and sequencing of the TTV isolate (SZ1) and the development of a PCR assay for detecting TTV DNA has important implication for the diagnosis and epidemiological investigation on TTV infection.
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【Key words】 Non A-G hepatitis TT virus Cloning,Molecular
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1995年12月～1998年2月深圳市东湖医院与广州医学院附二医院所收治的40例非甲-庚型肝炎患者，其中深圳市东湖医院24例，广州医学院附二医院16例。40例患者中男26例，女14例，年龄7～54岁。全部病例血清甲、乙、丙、丁、戊及庚型肝炎病毒标志物，包括HBV DNA、HCV RNA与HGV RNA均阴性。
二、血清标本的收集
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Taq DNA聚合酶、dNTPs、低溶点琼脂糖及琼脂酶购自Promega公司。Klenow酶、T4DNA连接酶、质粒pUC18均为Boehringer Mannheim公司产品。大肠杆菌DH5α由中山医科大学分子医学中心提供。
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五、TTV DNA的PCR扩增
采用蛋白酶K法提取血清中TTV DNA。第1次PCR体系含引物T1与T2各20pmol/L、2mmol/L、dNTPs 3μl、Taq酶2U、10×Taq酶buffer 3μl，加入含TTV DNA模板的离心管中，反应总体积30μl。用石蜡油封顶后放PCR扩增仪上，按下列参数循环：94℃ 40秒，56℃ 35秒，72℃ 45秒，共30个循环，最后72℃延伸7分钟。第2次PCR体系含引物T3和T4各20pmol/L、2mmol/L的dNTPs 3μl、Taq酶2U、10×Taq酶buffer 3μl，第一次PCR产物2μl，反应总体积30μl,循环参数同上。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外检测仪上观察结果,出现272bp DNA扩增带者为阳性。
六、TTV DNA分子克隆与测序
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取第2次PCR产物，用低溶点琼脂糖回收纯化，再用Klenow酶补平后，经T4 DNA连接酶将其与经SmaⅠ酶切后的pUC18连接，转化DH5α，挑白斑经PCR鉴定，筛选阳性克隆。用碱裂解/PEG沉淀法提取质粒，采用通用引物，经荧光自动测序仪(Applied Biosystems,373A)进行双向测序。
结 果
一、PCR产物电泳结果
阳性标本扩增产物272bp,与预期大小一致(见图1)。
二、TTV DNA检测结果
40例非甲-庚型肝炎患者中，血清TTV阳性者21例(52.5%)。
三、TTV DNA克隆序列测定结果
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对从1例散发性非甲-庚型肝炎患者血清中
1.3.5.阳性标本(272bp). 2.4.阴性标本6.DNA分子量标准(100bp DNA ladder)
图1 TTV DNA的PCR产物电泳图
图2 TTV深圳株(SZ1)与日本株(N22，G1a)序列比较
获得的TTV DNA克隆(SZ1)ORF1区部分基因的测序结果表明，其核苷酸序列与Okamoto等[10]报道的TTV N22、G1a克隆的同源性分别为96.7%与97.4%(见图2)。
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讨 论
TTV是继甲、乙、丙、丁、戊及庚型肝炎病毒之后最近才被发现的又一新型肝炎相关病毒[9，10]，初步研究表明TTV为一单股DNA病毒，无包膜。目前已测定的TTV基因序列长约3.7kb,含有ORF1与ORF2两个开放读码框，分别编码770与202个氨基酸。序列分析表明，不同TTV分离株ORF1部分基因核苷酸变异可达30%[10]。
我们根据Okamoto等[10]报道的TTV序列，选择保守区设计两对引物，采用套式PCR法对广东地区40例非甲-庚型肝炎患者血清进行TTV DNA检测，结果21例阳性(52.5%)，表明非甲-庚型肝炎患者中TTV感染率较高，这与其报道的46%相似。对其中1例散发性TTV病毒株(SZ1)ORF1区部分基因进行分子克隆与测序，发现TTV-SZ1与Okamoto等[10]报道的N22、G1a克隆的核苷酸序列的同源性分别为96.7%与97.4%，表明TTV-SZ1与N22、G1a属同一亚型，这是我国华南地区首次证实的TTV感染。TTV深圳分离株的分子克隆与核苷酸序列测定及PCR诊断技术的建立对我国进一步开展TTV感染的流行病学调查及防治研究均具有重要意义。
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