双球囊导管法基因导入血管的实验研究
作者：李建军 黄从新 李庚山 上野光 竹下彰
单位：李建军 黄从新 李庚山(430060 武汉市 湖北医科大学附一院心内科)；上野光 竹下彰(日本加州大学医学部心内科)
关键词：腺病毒；基因导入；基因治疗；血管
岭南心血管病杂志000217 【摘要】 目的 探讨双球囊导管法腺病毒介导性基因导入犬股动脉的效率及时间曲线。方法 选成年杂交犬20只，经股动脉分支逆行插入7F双球囊导管至髂动脉，采用气囊法剥脱血管内皮后，充盈双球囊，经球囊间侧孔注入0.3 mL约含3.0×109 pfu的含有细菌lacZ基因的重组腺病毒入间腔，培养30分钟。术后1、3、7、14、21、28及35天处死动物，组织化学分析法检测lacZ基因在股动脉的表达。结果 导入基因后24小时即见lacZ基因在血管内膜表达，7天达高峰，持续4周左右。高峰时，培养间腔血管内侧近100%表达了外源基因，深度达血管中膜2/3。结论 双球囊导管法腺病毒介导性基因导入犬股动脉呈高效及一过性特点。
, 百拇医药
Experimental study on gene transfer into vessel using double-balloon catheter
Li Jianjun, Huang Congxin, Li Gengshan
(Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan 430060)
【Abstract】 Objective To evaluate the efficiency and time curve of gene expression following adenovirus-mediated gene transfer into canine injured femoral arteries through double-balloon catheter. Methods Femoral arteries were first subjected to the balloon injury and 3.0×109 pfu of adenovirus expressing bacterial lacZ gene was filled into a closed space created by inflated double-balloon catheter, subsequently incubated for 30 min. The vessel were harvested at 1,3,7,14,21,28 and 35 days after gene transfer.Results The lacZ expression was found in 100% of arterial inner surface and in two-third of arterial media, which detected at 1 day, peaked at 7 days and lasted up to 28 days.Conclusion This study indicated that adenovirus-mediated gene transfer into arteries was transient but high-efficient.
, 百拇医药
【Key words】 Adenovirus Gene transfer Gene therapy Vessel
心血管疾病的基因治疗引人注目，其实验研究报道已迭见文献[1～3]，但高效率地导基因入血管之研究报道尚少。本文选用含细菌lacZ基因的重组腺病毒载体，经双球囊导管法导入犬球囊剥脱内皮后股动脉，获得了十分满意的效果，现报道如下。
材料与方法
1.重组腺病**** 重组腺病****方法详见文献[2，3]。简言之，将细菌lacZ基因插入粘性末端质粒载体的SRa启动子与SV40多聚腺苷酸[poly(A)]序列之间。其质粒载体中含有整个人类5型腺病毒的基因组，但已预先去掉其E1a、E1b和E3区使之形成复制缺陷。含有目的基因lacZ的重组腺病毒命名为Adex1SR-lacZ且经293细胞培养同源重组获得，并经常规酶消化法和测定受其感染后细胞中β-半乳糖苷酶的活性而确认。确认后的病毒株经293细胞扩增，尔后经氯化铯密度梯度离心法回收与纯化。病毒滴度采用293细胞受其感染后斑块形成单位(pfu: plaque formation unit)计算。经该法提取，通常可获得1×1010pfu的高滴度病毒。与此同时，制作不含任何外源基因但结构上与重组腺病毒完全相同的腺病毒命名为Adex1w作为对照。
, 百拇医药
2.活体基因导入犬股动脉 成年杂交犬20只，雌雄不拘，体重13～27.5千克。经静脉注射苯巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，仰卧位固定。右股三角区纵行切口暴露股动脉及其分支，切开股动脉分支并逆行插入7F双球囊导管至髂动脉。经尾端注入0.5 mL空气充盈前囊，来回拖拉3次以剥脱血管内皮细胞。继之，后撤导管于股动脉处后，充盈双球囊以形成长约2.5 cm的无血流间腔。经导管侧孔用生理盐水冲洗间腔3次，注入0.25 mL约含3.0×109 pfu的Adex 1SR-lacZ入间腔，培养30 min。其间腔充盈压经压力传感器监测小于200 mmHg。随后，经导管侧孔回收病毒，生理盐水冲洗3次。松解球囊，撤除导管，结扎股动脉分支，恢复血流，缝合伤口。左侧股动脉依同法注入0.25 mL约含3.0×109 pfu的Adex1W入间腔，培养30 min。术毕，动物送动物中心饲养。术后常规抗生素治疗3天。双球囊导管法导基因入血管示意见图1。
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图1 双球囊导管法导基因入血管示意图
3.组织化学分析 基因导入后24小时(n=2)和3、7、14、21、28及35天(n=3)，经静脉注入过量苯巴比妥钠处死动物，迅即取出双侧股动脉，并沿血管长轴用锐利眼科剪剪开股动脉。冷生理盐水冲洗血管3次后，置于2%甲醛+0.2%戊二醛/PBS(pH 7.4)液中于4℃固定6小时。继之，PBS冲洗5次，浸泡冲洗10分钟×3次。随后将血管置于5 mmol/L铁氰化钾+5 mmol/L亚铁氰化钾+1 mmol/L二氯化镁+1 mg/mL x-gal的PBS液中37℃培养5小时。
染色完毕后，血管经生理盐水冲洗3次，重新置于2%甲醛+0.2%戊二醛/PBS(pH 7.4)溶液中于4℃固定24小时以上。继之将血管沿横轴切成5 mm条片，石蜡包埋。使用组织切片机将包埋组织切成5 μm的切片，经核固红法(nuclear fast red)染色后显微镜下观察。
, http://www.100md.com 结 果
由于本实验所用腺病毒携带有细菌lacZ基因，后者表达的蛋白产物β-半乳糖苷酶与底物x-gal发生化学反应后呈蓝色，故本实验极易观察到基因是否得到表达及基因表达的部位与范围。经双球囊导管侧孔(图1)注入0.3 mL约含3.0×109 pfu之重组腺病入剥脱内皮后股动脉，经组织化学分析发现，lacZ基因在血管内侧的表达面积近乎100%(图2B)，组织切片示lacZ基因表达的深度近血管中膜的2/3(图2C)。而导入对照腺病毒之血管未见蓝染(图2A)。
图2 双球囊导管法基因导入犬股动脉后组织化学分析结果
A.对照血管大体标本，×6； B.导基因后7天血管大体标本，×8；C.图2B血管组织切片标本，×120.M：中膜；O：外膜
, http://www.100md.com
继之，我们观察了lacZ基因在血管中表达的时间曲线。20只犬分别于基因导入后24小时，3、7、14、21、28及35天处死动物，取出股动脉，经组织化学分析发现，导基因入血管24小时后即可见lacZ基因表达，3天后达峰值的75%，7天达高峰，后渐退并维持28天，35天后则消失。说明腺病毒介导性基因导入血管后其外源基因之表达呈一过性特点。
讨 论
心血管疾病的基因治疗是近年来心血管研究的热点之一。血管平滑肌细胞(VSMC)作为基因治疗的重要靶细胞倍受重视，其主要原因是它参与了疗效确切的冠状动脉腔内成形术(PTCA)后血管再狭窄的发生与发展[4]。导基因入血管，抑制VSMC的增殖与游走可能为PTCA术后再狭窄的治疗带来新的契机。迄今为止，高效率导基因入血管的研究报道甚少。因此，在体直接对动脉壁进行高效的基因转移，至今对各国学者仍是一个具有挑战性的研究课题[5]。
, 百拇医药
腺病毒载体具有高转染性，可转染增殖和非增殖细胞，且可携带大的基因片断，视为心血管系统基因转导和基因治疗的合理载体[6]。本研究使用双球囊导管法将重组腺病毒导入犬剥脱内皮后股动脉，经30分钟常规压力下培养，7天后的组织化学分析结果表明，lacZ基因在血管内侧的表达面积高达95%以上，其深度亦达血管中膜2/3以上(见图2B和图2C)。提示腺病毒载体转基因入在体血管具有高效性。
然而，因腺病毒载体不能整合入宿主细胞的染色体，其携带基因的表达具有一过性的特点[7]。本观察发现，腺病毒介导性基因导入血管后，其基因在血管中表达于第7天达高峰，此后渐退至4周左右消失。有关其消失的机制尚不十分清楚，多认为与宿主产生的免疫反应有关[8]。
值得指出的是，双球囊导管法基因于血管壁，因需较长时间地阻断血流，故应用有一定限制，作者认为用于外周血管性疾病的研究与治疗仍是可取的。多孔气囊导管、水凝胶(hydrogel)包被气囊导管及血管内皮包被支架等新型经导管转基因技术作为双球囊导管技术的逻辑性延伸已在开发应用之中。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Nabel EG, Pompili VJ, Plautz GE, et al. Gene transfer and vascular disease. Cardiovasc Res, 1994, 28: 445～454
2，Li J-J, Ueno H, Yamamoto H, et al. Adenovirus-mediated arterial gene transfer does not require prior injury for submaximal gene expression. Gene Ther, 1995, 2:351～354
3，Ueno H, Li J-J, Tomita H, et al. Quantitative analysis of gene expression after a repetitive infection into the same arterial wall. Arterioscler Tnromb Vasc Biol, 1995, 15: 2246～2251
, 百拇医药
4，上野光，李建军，竹下彰. 动脉硬化ヒ生长因子. 脉管と内皮，1994， 4：487～492
5，牛杰，顾依群，陈明哲，等. 四种球囊导管基因转移系统作用的比较. 中国循环杂志，1988， 13：170～171
6，Li J-J, Ueno H, Pan Y, et al. Percutaneous transluminal gene transfer into canine myocardium in vivo by replication-defective adenovirus. Cardiovasc Res, 1995, 30: 97～105
7，李建军，李庚山，黄从新，等. 自制针型导管在基因导入心脏中的应用. 中国循环杂志， 1998， 13： 283～284
8，Quantin B, Perricaudet LD, Jajbaksh S, et al. Adenovirus as an expression vector in muscle cells in vivo. Proc. Natl Acad Sci USA, 1992, 99: 2581～2592, http://www.100md.com
单位：李建军 黄从新 李庚山(430060 武汉市 湖北医科大学附一院心内科)；上野光 竹下彰(日本加州大学医学部心内科)
关键词：腺病毒；基因导入；基因治疗；血管
岭南心血管病杂志000217 【摘要】 目的 探讨双球囊导管法腺病毒介导性基因导入犬股动脉的效率及时间曲线。方法 选成年杂交犬20只，经股动脉分支逆行插入7F双球囊导管至髂动脉，采用气囊法剥脱血管内皮后，充盈双球囊，经球囊间侧孔注入0.3 mL约含3.0×109 pfu的含有细菌lacZ基因的重组腺病毒入间腔，培养30分钟。术后1、3、7、14、21、28及35天处死动物，组织化学分析法检测lacZ基因在股动脉的表达。结果 导入基因后24小时即见lacZ基因在血管内膜表达，7天达高峰，持续4周左右。高峰时，培养间腔血管内侧近100%表达了外源基因，深度达血管中膜2/3。结论 双球囊导管法腺病毒介导性基因导入犬股动脉呈高效及一过性特点。
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Experimental study on gene transfer into vessel using double-balloon catheter
Li Jianjun, Huang Congxin, Li Gengshan
(Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan 430060)
【Abstract】 Objective To evaluate the efficiency and time curve of gene expression following adenovirus-mediated gene transfer into canine injured femoral arteries through double-balloon catheter. Methods Femoral arteries were first subjected to the balloon injury and 3.0×109 pfu of adenovirus expressing bacterial lacZ gene was filled into a closed space created by inflated double-balloon catheter, subsequently incubated for 30 min. The vessel were harvested at 1,3,7,14,21,28 and 35 days after gene transfer.Results The lacZ expression was found in 100% of arterial inner surface and in two-third of arterial media, which detected at 1 day, peaked at 7 days and lasted up to 28 days.Conclusion This study indicated that adenovirus-mediated gene transfer into arteries was transient but high-efficient.
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【Key words】 Adenovirus Gene transfer Gene therapy Vessel
心血管疾病的基因治疗引人注目，其实验研究报道已迭见文献[1～3]，但高效率地导基因入血管之研究报道尚少。本文选用含细菌lacZ基因的重组腺病毒载体，经双球囊导管法导入犬球囊剥脱内皮后股动脉，获得了十分满意的效果，现报道如下。
材料与方法
1.重组腺病**** 重组腺病****方法详见文献[2，3]。简言之，将细菌lacZ基因插入粘性末端质粒载体的SRa启动子与SV40多聚腺苷酸[poly(A)]序列之间。其质粒载体中含有整个人类5型腺病毒的基因组，但已预先去掉其E1a、E1b和E3区使之形成复制缺陷。含有目的基因lacZ的重组腺病毒命名为Adex1SR-lacZ且经293细胞培养同源重组获得，并经常规酶消化法和测定受其感染后细胞中β-半乳糖苷酶的活性而确认。确认后的病毒株经293细胞扩增，尔后经氯化铯密度梯度离心法回收与纯化。病毒滴度采用293细胞受其感染后斑块形成单位(pfu: plaque formation unit)计算。经该法提取，通常可获得1×1010pfu的高滴度病毒。与此同时，制作不含任何外源基因但结构上与重组腺病毒完全相同的腺病毒命名为Adex1w作为对照。
, 百拇医药
2.活体基因导入犬股动脉 成年杂交犬20只，雌雄不拘，体重13～27.5千克。经静脉注射苯巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，仰卧位固定。右股三角区纵行切口暴露股动脉及其分支，切开股动脉分支并逆行插入7F双球囊导管至髂动脉。经尾端注入0.5 mL空气充盈前囊，来回拖拉3次以剥脱血管内皮细胞。继之，后撤导管于股动脉处后，充盈双球囊以形成长约2.5 cm的无血流间腔。经导管侧孔用生理盐水冲洗间腔3次，注入0.25 mL约含3.0×109 pfu的Adex 1SR-lacZ入间腔，培养30 min。其间腔充盈压经压力传感器监测小于200 mmHg。随后，经导管侧孔回收病毒，生理盐水冲洗3次。松解球囊，撤除导管，结扎股动脉分支，恢复血流，缝合伤口。左侧股动脉依同法注入0.25 mL约含3.0×109 pfu的Adex1W入间腔，培养30 min。术毕，动物送动物中心饲养。术后常规抗生素治疗3天。双球囊导管法导基因入血管示意见图1。
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图1 双球囊导管法导基因入血管示意图
3.组织化学分析 基因导入后24小时(n=2)和3、7、14、21、28及35天(n=3)，经静脉注入过量苯巴比妥钠处死动物，迅即取出双侧股动脉，并沿血管长轴用锐利眼科剪剪开股动脉。冷生理盐水冲洗血管3次后，置于2%甲醛+0.2%戊二醛/PBS(pH 7.4)液中于4℃固定6小时。继之，PBS冲洗5次，浸泡冲洗10分钟×3次。随后将血管置于5 mmol/L铁氰化钾+5 mmol/L亚铁氰化钾+1 mmol/L二氯化镁+1 mg/mL x-gal的PBS液中37℃培养5小时。
染色完毕后，血管经生理盐水冲洗3次，重新置于2%甲醛+0.2%戊二醛/PBS(pH 7.4)溶液中于4℃固定24小时以上。继之将血管沿横轴切成5 mm条片，石蜡包埋。使用组织切片机将包埋组织切成5 μm的切片，经核固红法(nuclear fast red)染色后显微镜下观察。
, http://www.100md.com 结 果
由于本实验所用腺病毒携带有细菌lacZ基因，后者表达的蛋白产物β-半乳糖苷酶与底物x-gal发生化学反应后呈蓝色，故本实验极易观察到基因是否得到表达及基因表达的部位与范围。经双球囊导管侧孔(图1)注入0.3 mL约含3.0×109 pfu之重组腺病入剥脱内皮后股动脉，经组织化学分析发现，lacZ基因在血管内侧的表达面积近乎100%(图2B)，组织切片示lacZ基因表达的深度近血管中膜的2/3(图2C)。而导入对照腺病毒之血管未见蓝染(图2A)。
图2 双球囊导管法基因导入犬股动脉后组织化学分析结果
A.对照血管大体标本，×6； B.导基因后7天血管大体标本，×8；C.图2B血管组织切片标本，×120.M：中膜；O：外膜
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继之，我们观察了lacZ基因在血管中表达的时间曲线。20只犬分别于基因导入后24小时，3、7、14、21、28及35天处死动物，取出股动脉，经组织化学分析发现，导基因入血管24小时后即可见lacZ基因表达，3天后达峰值的75%，7天达高峰，后渐退并维持28天，35天后则消失。说明腺病毒介导性基因导入血管后其外源基因之表达呈一过性特点。
讨 论
心血管疾病的基因治疗是近年来心血管研究的热点之一。血管平滑肌细胞(VSMC)作为基因治疗的重要靶细胞倍受重视，其主要原因是它参与了疗效确切的冠状动脉腔内成形术(PTCA)后血管再狭窄的发生与发展[4]。导基因入血管，抑制VSMC的增殖与游走可能为PTCA术后再狭窄的治疗带来新的契机。迄今为止，高效率导基因入血管的研究报道甚少。因此，在体直接对动脉壁进行高效的基因转移，至今对各国学者仍是一个具有挑战性的研究课题[5]。
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腺病毒载体具有高转染性，可转染增殖和非增殖细胞，且可携带大的基因片断，视为心血管系统基因转导和基因治疗的合理载体[6]。本研究使用双球囊导管法将重组腺病毒导入犬剥脱内皮后股动脉，经30分钟常规压力下培养，7天后的组织化学分析结果表明，lacZ基因在血管内侧的表达面积高达95%以上，其深度亦达血管中膜2/3以上(见图2B和图2C)。提示腺病毒载体转基因入在体血管具有高效性。
然而，因腺病毒载体不能整合入宿主细胞的染色体，其携带基因的表达具有一过性的特点[7]。本观察发现，腺病毒介导性基因导入血管后，其基因在血管中表达于第7天达高峰，此后渐退至4周左右消失。有关其消失的机制尚不十分清楚，多认为与宿主产生的免疫反应有关[8]。
值得指出的是，双球囊导管法基因于血管壁，因需较长时间地阻断血流，故应用有一定限制，作者认为用于外周血管性疾病的研究与治疗仍是可取的。多孔气囊导管、水凝胶(hydrogel)包被气囊导管及血管内皮包被支架等新型经导管转基因技术作为双球囊导管技术的逻辑性延伸已在开发应用之中。
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参考文献
1，Nabel EG, Pompili VJ, Plautz GE, et al. Gene transfer and vascular disease. Cardiovasc Res, 1994, 28: 445～454
2，Li J-J, Ueno H, Yamamoto H, et al. Adenovirus-mediated arterial gene transfer does not require prior injury for submaximal gene expression. Gene Ther, 1995, 2:351～354
3，Ueno H, Li J-J, Tomita H, et al. Quantitative analysis of gene expression after a repetitive infection into the same arterial wall. Arterioscler Tnromb Vasc Biol, 1995, 15: 2246～2251
, 百拇医药
4，上野光，李建军，竹下彰. 动脉硬化ヒ生长因子. 脉管と内皮，1994， 4：487～492
5，牛杰，顾依群，陈明哲，等. 四种球囊导管基因转移系统作用的比较. 中国循环杂志，1988， 13：170～171
6，Li J-J, Ueno H, Pan Y, et al. Percutaneous transluminal gene transfer into canine myocardium in vivo by replication-defective adenovirus. Cardiovasc Res, 1995, 30: 97～105
7，李建军，李庚山，黄从新，等. 自制针型导管在基因导入心脏中的应用. 中国循环杂志， 1998， 13： 283～284
8，Quantin B, Perricaudet LD, Jajbaksh S, et al. Adenovirus as an expression vector in muscle cells in vivo. Proc. Natl Acad Sci USA, 1992, 99: 2581～2592, http://www.100md.com