顺铂—白蛋白微球狗舌动脉灌注后的药物释放特性研究
作者：温玉明 郑根建 付风华 王昌美
单位：温玉明 付凤华 王昌美(610041成都，华西医科大学口腔医学院)；郑根建(730070兰州，解放军第473医院口腔科)
关键词：顺铂—白蛋白微球；狗舌动脉栓塞；药动学；缓释
临床口腔医学杂志990202 提 要 本实验对CDDP—AMS犬舌动脉栓塞后的药效学进行了研究，发现微球在体内具有缓释作用，起到药物贮存站(deport)的作用，结合血管密度的改变结果，较直接而具体地解释了产生CDDP—AMS栓塞治疗临床效果的机理，认为其效果是通过局部较长时间持续的CDDP释放对肿瘤的杀伤作用和血流阻断后肿瘤组织缺氧、缺血、坏死的协同迭加作用，从而为临床更广泛应用这一技术提供了实验数据。
Study on pharmacokinetics in vivo after lingual arterial emboliz ation of cisplatin albumin microspheres Wen YuMing， Zheng Genjian,Wang Changmei et al. College of stomatology,West China Univesity of Medi cal Sciences, Changdu 610041.
, http://www.100md.com
Abstract Pharmacokinetics after lingual arteria l embolization of cisplatin-albumin microspheres in dog were studied.The result showed that the halflife drug concentration of chemoembolization group(CDDP-AMS) was 37.42 times as much as that of CDDP solution group,and the mean retarding time(MRT) was 7.06 times.The peak time of the drug concentration of CDDP-AMS group is 60.94% of that of CDDP group.These facts suggested that microspheres had su st ain-released effect and was drug deport in the body.These results combining with the varition of tumor vessels explained the machanism of chemoembolization ther apy directly.Effective and steady local drug concentration to kill tumor tissu es cooperated with the hyplxia and ischemia of tumor cell after chemoembolization was the main reason of best clinical curative effects than that of drug solution infusion and blank microspheres embolization.Its side effects were minimal.
, 百拇医药
Key words cisplatin-albumin microspheres dog lingual arterial embolization
pharmacokinetics sustained release
材料与方法
实验动物及分组 选用健康家犬2只，雌雄不限，体重10～12kg/只，分成二组，一只经舌动脉灌注顺铂(CDDP)20mg+0.9%生理盐水5ml溶液，另一只经舌动脉灌注顺铂—白蛋白微球(CDDP_AMS)147mg(含顺铂20mg)与3ml0.9%生理盐水混悬液，另用2ml生理盐水冲洗空针内残余的微球并灌入。
实验材料 牛血清白蛋白微球由华西医科大学药学院药剂教研室研制,直径29～116μm，平均直径56.3μm，40～70μm的微球占总数的82.4%，使用前经钴60照射灭菌。微球中顺铂含量为13.6%(w/w)。
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实验方法
1.顺铂及顺铂白蛋白微球的灌注途径和方法
将动物用3%戊巴比妥钠按每公斤体重30mg，行腹腔注射麻醉，颈部备皮，消毒铺巾，于右侧颈部气管旁，从下颌下缘向下作长约5cm的切口，分层解剖出颈总动脉，颈内动脉、颈外动脉、舌动脉，将舌动脉游离约2～3cm，穿缝线两根，固定备用。用12号针头于暴露的舌动脉表面向远心端穿刺，用已备缝线固定针头，外接三通管，推注美兰1ml，待半舌兰染定位准确后，在30KPa压力下，分别于二只狗中推注顺铂20mg+0.9%生理盐水5ml及顺铂—白蛋白微球147mg(含顺铂20mg)+0.9%生理盐水3ml混悬液。推注微球后，通过三通管另取2ml0.9%生理盐水清洗空针内残余微球并推入。拔出穿刺针，于穿刺部位之近远侧分别作舌动脉双线结扎，冲洗伤口，分层缝合。灌注后10、20、30、40、60、90、120、180分钟，1天、3天、5天、7天、10天分别从二只狗外周静脉中各抽取2ml外周静脉血，以备测血药浓度用。
, 百拇医药
2.外周静脉血中血铂含量的测定
将各时间点抽取的外周静脉血2ml，转移入烧杯中，残余血液用蒸馏水冲洗并入，加纯硝酸2ml，于80℃下消化72小时，等溶液澄清透明后加蒸馏水定容至10ml，置于美国J—A公司生产ICAP9000型等离子光谱仪上测量(四川联合大学分析测试中心提供)，算出每ml全血中所含的铂含量(μg/ml)。仪器工作条件：功率P=1.1kw，观察高度h=16mm,载气流量Qs=0.41(L)/min,温度20±2℃，相对湿度56%。
结果
采用等离子光谱仪测定外周静脉血中铂含量(表1)。
表1 灌注后不同时间外周静脉血中铂含量的动态变化结果(μg/ml) 组 别
10
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20
30
40
60
90
120
180min
1
3
5
7
10d
CDDP组
10.42
, http://www.100md.com
9.65
9.71
7.85
7.25
7.00
6.80
4.30
1.61
0.18
-
-
-
CDDP-AMS组
, 百拇医药
0.80
1.23
1.60
3.55
6.30
6.35
5.30
4.18
3.85
3.40
0.85
0.65
0.43
, 百拇医药
将所得的数据于《实用药代动力学计算程序3P87非室模型处理软件》下进行拟合，计算出有关动力学参数(表2)。表2 动脉灌注CDDP及CDDP—AMS后的药物动力学参数 组 别
T1/2(hr)
Ke(hr)
Cmax(obs,μg/ml)
Cmax(cal,μg/ml)
AUC
MRT
CDDP
2.5750
, 百拇医药
0.2692
10.420
9.381
130.3730
16.6817
CDDP-AMS
96.3653
0.0072
6.350
3.776
524.3567
117.7162
, 百拇医药
将表1数据绘制成曲线，如图1所示。
图1 犬舌动脉灌注CDDP及CDDP—AMS后外周血铂浓度的动态变化
从图、表中可知，单纯顺铂灌注后外周静脉血药浓度达峰时tp极短，仅10min,峰值(cmax)为10.42μg/ml，达到峰值后迅速下降，血药消除半衰期t1/2，为2.5750hr，血药消除速率常数(ke)为0.2692，血药平均滞留时间(MRT)为16.6817hr，灌注后三天外周血中基本上已无法测出CDDP浓度。而CDDP—AMS灌注组外周血药浓度上升和下降均较缓慢，达峰时tp90min，峰值Cmax为6.35μg/ml,是CDDP组的60.94%，血药消除半衰期t1/2为96.3653hr，是CDDP组的37.42倍，血药消除速率常数(ke)为0.0072，平均滞留时间MRT为117.7162hr，是CDDP组的7.06倍。利用等离子光谱仪，灌注后10天仍能在外周血中测到一定水平的铂。因此，CDDP—AMS灌注后，CDDP在血中的消除较缓慢，滞留时间较长，能充分被靶组织所利用，可见它具有缓释作用。
, 百拇医药
讨论
顺铂自70年代始广泛用于头颈部鳞癌的化疗,是头颈部鳞癌的首选药物之一。为了减小顺铂对全身正常细胞非选择性的杀伤，改变顺铂在全身的分布，从而减小单纯顺铂经动、静脉途径施药所带来的严重毒副作用，我们制备了顺铂—白蛋白微球，并经舌动脉行微球栓塞性化疗,试图通过改变药物的剂型而使药物的全身分布发生改变，实现靶组织血供的阻断和药物的被动靶向，从而达到治疗肿瘤的目的。
从实验结果看，单纯顺铂灌注后外周静脉血药浓度在10min内达到高峰，血药消除半衰期为2.5750hr，消除速率常数较大。，平均滞留时间较短，灌注后三天外周静脉血中已无法测出CDDP浓度，已完全被机体消除。而CDDP—AMS舌动脉灌注后，外周血药浓度上升和下降均较缓慢，在90min内达到高峰，其Cmax为6.35μg/ml，是CDDP组的60.94%，血药消除半衰期为96.36535hr，是CDDP组的37.42倍，血药消除速率常数较小，故平均滞留时间较长，是CDDP的7.06倍。灌注后10天，利用等离子光谱仪，在外周静脉血中仍可测到一定水平的铂。由此可见，顺铂白蛋白微球改变了顺铂的剂型，从而改变了该剂在全身的分布，提高了生物利用度，制成的顺铂白蛋白微球有缓释作用。这是由于微球动脉栓塞后，本身受到血流冲击，在体内外药物浓度梯度的作用下，药物通过微球表面细小的裂隙缓慢释放而维护稳定的血药浓度，这样，不但使靶区的药物长时间地维持较高的浓度水平，而且降低循环中的药物浓度，从而提高了药物的治疗指数，减少全身性毒副作用。Kato〔1〕等用MMC乙基纤维素微球使犬肾动脉栓塞，经组织匀浆的生物学测定表明，栓塞后6小时，肾脏仍有MMC的生物活性，而外周血中的MMC水平比对照组中的MMC水平明显降低。Fujimoto〔2〕用丝裂霉素C溶液和MMC—AMS微球对荷瘤(VX2)家兔作肝动脉灌注，发现MMC组外周静脉血药浓度达峰时(tp)极短，达峰后迅速下降，血药消除半衰期(t1/2仅7～10分钟，而微球组血药上升与下降均较缓慢，t1/2为20分钟。Goldberg〔2〕等用标记有141I的白蛋白微球进行肝动脉栓塞，发现整个肝脏的放射活性半衰期为1.5～11.7天，平均为2.4天，而肿瘤部位的放射活性存在时间比非肿瘤区的肝脏存在时间要长得多，所有这些均证实了微球内药物在体内具有缓释作用。因此，作为药物载体的微球，栓塞于动脉末梢时，起到了“药物贮存站”的作用，不断向邻近靶组织释放药物，在靶组织局部产生持久、恒定的血药浓度，从而有效地杀伤靶细胞，减少全身性毒副作用。
, 百拇医药
结合血管密度改变的结果我们可以推知，顺铂白蛋白微球对肿瘤细胞的杀伤作用机制是肿瘤局部持续、有效浓度CDDP诱发的舌癌细胞的凋亡过程及肿瘤血管栓塞导致肿瘤细胞缺血、缺氧所致的肿瘤细胞坏死过程的迭加协同作用，而且巧妙地实现了“缺血条件可增强肿瘤对化疗药物的反应”之原理。从而使CDDP—AMS对肿瘤组织的损伤更为迅速、彻底，杀瘤效应更加增强，毒副作用减少。
参考文献
[1]Kato T, Nemoto R, Mori H, et al. Sustained_release properties of m icroencapsulated mitomycin C with ethylcellulose infused into the renal artery o f the dog. Cancer. 1980;46:14
[2]Fujimoto S, Miyazaki M, Endoh F, et al. Mitomycin C carrying micro spheres as a novel method of drug delivery. Cancer Drug Deliv. 1985;2(3):173.
, http://www.100md.com
[3]Goldberg JA, Wlmott NS, Anderson TH, et al. The biodegradation of album in microspheres used for regional chemotherapy in patients with colorectal liver m etastases. Nucl Med Commun. 1991;12(1):57
[4]Lichtenstein AK,Peude D.Enhancement of natural killer cytotoxicity by cis-diamminedichloroplatinum(Ⅱ) in vivo and CancerRes.1986;46:639.
(收稿：1999—03—04), 百拇医药
单位：温玉明 付凤华 王昌美(610041成都，华西医科大学口腔医学院)；郑根建(730070兰州，解放军第473医院口腔科)
关键词：顺铂—白蛋白微球；狗舌动脉栓塞；药动学；缓释
临床口腔医学杂志990202 提 要 本实验对CDDP—AMS犬舌动脉栓塞后的药效学进行了研究，发现微球在体内具有缓释作用，起到药物贮存站(deport)的作用，结合血管密度的改变结果，较直接而具体地解释了产生CDDP—AMS栓塞治疗临床效果的机理，认为其效果是通过局部较长时间持续的CDDP释放对肿瘤的杀伤作用和血流阻断后肿瘤组织缺氧、缺血、坏死的协同迭加作用，从而为临床更广泛应用这一技术提供了实验数据。
Study on pharmacokinetics in vivo after lingual arterial emboliz ation of cisplatin albumin microspheres Wen YuMing， Zheng Genjian,Wang Changmei et al. College of stomatology,West China Univesity of Medi cal Sciences, Changdu 610041.
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Abstract Pharmacokinetics after lingual arteria l embolization of cisplatin-albumin microspheres in dog were studied.The result showed that the halflife drug concentration of chemoembolization group(CDDP-AMS) was 37.42 times as much as that of CDDP solution group,and the mean retarding time(MRT) was 7.06 times.The peak time of the drug concentration of CDDP-AMS group is 60.94% of that of CDDP group.These facts suggested that microspheres had su st ain-released effect and was drug deport in the body.These results combining with the varition of tumor vessels explained the machanism of chemoembolization ther apy directly.Effective and steady local drug concentration to kill tumor tissu es cooperated with the hyplxia and ischemia of tumor cell after chemoembolization was the main reason of best clinical curative effects than that of drug solution infusion and blank microspheres embolization.Its side effects were minimal.
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Key words cisplatin-albumin microspheres dog lingual arterial embolization
pharmacokinetics sustained release
材料与方法
实验动物及分组 选用健康家犬2只，雌雄不限，体重10～12kg/只，分成二组，一只经舌动脉灌注顺铂(CDDP)20mg+0.9%生理盐水5ml溶液，另一只经舌动脉灌注顺铂—白蛋白微球(CDDP_AMS)147mg(含顺铂20mg)与3ml0.9%生理盐水混悬液，另用2ml生理盐水冲洗空针内残余的微球并灌入。
实验材料 牛血清白蛋白微球由华西医科大学药学院药剂教研室研制,直径29～116μm，平均直径56.3μm，40～70μm的微球占总数的82.4%，使用前经钴60照射灭菌。微球中顺铂含量为13.6%(w/w)。
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实验方法
1.顺铂及顺铂白蛋白微球的灌注途径和方法
将动物用3%戊巴比妥钠按每公斤体重30mg，行腹腔注射麻醉，颈部备皮，消毒铺巾，于右侧颈部气管旁，从下颌下缘向下作长约5cm的切口，分层解剖出颈总动脉，颈内动脉、颈外动脉、舌动脉，将舌动脉游离约2～3cm，穿缝线两根，固定备用。用12号针头于暴露的舌动脉表面向远心端穿刺，用已备缝线固定针头，外接三通管，推注美兰1ml，待半舌兰染定位准确后，在30KPa压力下，分别于二只狗中推注顺铂20mg+0.9%生理盐水5ml及顺铂—白蛋白微球147mg(含顺铂20mg)+0.9%生理盐水3ml混悬液。推注微球后，通过三通管另取2ml0.9%生理盐水清洗空针内残余微球并推入。拔出穿刺针，于穿刺部位之近远侧分别作舌动脉双线结扎，冲洗伤口，分层缝合。灌注后10、20、30、40、60、90、120、180分钟，1天、3天、5天、7天、10天分别从二只狗外周静脉中各抽取2ml外周静脉血，以备测血药浓度用。
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2.外周静脉血中血铂含量的测定
将各时间点抽取的外周静脉血2ml，转移入烧杯中，残余血液用蒸馏水冲洗并入，加纯硝酸2ml，于80℃下消化72小时，等溶液澄清透明后加蒸馏水定容至10ml，置于美国J—A公司生产ICAP9000型等离子光谱仪上测量(四川联合大学分析测试中心提供)，算出每ml全血中所含的铂含量(μg/ml)。仪器工作条件：功率P=1.1kw，观察高度h=16mm,载气流量Qs=0.41(L)/min,温度20±2℃，相对湿度56%。
结果
采用等离子光谱仪测定外周静脉血中铂含量(表1)。
表1 灌注后不同时间外周静脉血中铂含量的动态变化结果(μg/ml) 组 别
10
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20
30
40
60
90
120
180min
1
3
5
7
10d
CDDP组
10.42
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9.65
9.71
7.85
7.25
7.00
6.80
4.30
1.61
0.18
-
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CDDP-AMS组
, 百拇医药
0.80
1.23
1.60
3.55
6.30
6.35
5.30
4.18
3.85
3.40
0.85
0.65
0.43
, 百拇医药
将所得的数据于《实用药代动力学计算程序3P87非室模型处理软件》下进行拟合，计算出有关动力学参数(表2)。表2 动脉灌注CDDP及CDDP—AMS后的药物动力学参数 组 别
T1/2(hr)
Ke(hr)
Cmax(obs,μg/ml)
Cmax(cal,μg/ml)
AUC
MRT
CDDP
2.5750
, 百拇医药
0.2692
10.420
9.381
130.3730
16.6817
CDDP-AMS
96.3653
0.0072
6.350
3.776
524.3567
117.7162
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将表1数据绘制成曲线，如图1所示。
图1 犬舌动脉灌注CDDP及CDDP—AMS后外周血铂浓度的动态变化
从图、表中可知，单纯顺铂灌注后外周静脉血药浓度达峰时tp极短，仅10min,峰值(cmax)为10.42μg/ml，达到峰值后迅速下降，血药消除半衰期t1/2，为2.5750hr，血药消除速率常数(ke)为0.2692，血药平均滞留时间(MRT)为16.6817hr，灌注后三天外周血中基本上已无法测出CDDP浓度。而CDDP—AMS灌注组外周血药浓度上升和下降均较缓慢，达峰时tp90min，峰值Cmax为6.35μg/ml,是CDDP组的60.94%，血药消除半衰期t1/2为96.3653hr，是CDDP组的37.42倍，血药消除速率常数(ke)为0.0072，平均滞留时间MRT为117.7162hr，是CDDP组的7.06倍。利用等离子光谱仪，灌注后10天仍能在外周血中测到一定水平的铂。因此，CDDP—AMS灌注后，CDDP在血中的消除较缓慢，滞留时间较长，能充分被靶组织所利用，可见它具有缓释作用。
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讨论
顺铂自70年代始广泛用于头颈部鳞癌的化疗,是头颈部鳞癌的首选药物之一。为了减小顺铂对全身正常细胞非选择性的杀伤，改变顺铂在全身的分布，从而减小单纯顺铂经动、静脉途径施药所带来的严重毒副作用，我们制备了顺铂—白蛋白微球，并经舌动脉行微球栓塞性化疗,试图通过改变药物的剂型而使药物的全身分布发生改变，实现靶组织血供的阻断和药物的被动靶向，从而达到治疗肿瘤的目的。
从实验结果看，单纯顺铂灌注后外周静脉血药浓度在10min内达到高峰，血药消除半衰期为2.5750hr，消除速率常数较大。，平均滞留时间较短，灌注后三天外周静脉血中已无法测出CDDP浓度，已完全被机体消除。而CDDP—AMS舌动脉灌注后，外周血药浓度上升和下降均较缓慢，在90min内达到高峰，其Cmax为6.35μg/ml，是CDDP组的60.94%，血药消除半衰期为96.36535hr，是CDDP组的37.42倍，血药消除速率常数较小，故平均滞留时间较长，是CDDP的7.06倍。灌注后10天，利用等离子光谱仪，在外周静脉血中仍可测到一定水平的铂。由此可见，顺铂白蛋白微球改变了顺铂的剂型，从而改变了该剂在全身的分布，提高了生物利用度，制成的顺铂白蛋白微球有缓释作用。这是由于微球动脉栓塞后，本身受到血流冲击，在体内外药物浓度梯度的作用下，药物通过微球表面细小的裂隙缓慢释放而维护稳定的血药浓度，这样，不但使靶区的药物长时间地维持较高的浓度水平，而且降低循环中的药物浓度，从而提高了药物的治疗指数，减少全身性毒副作用。Kato〔1〕等用MMC乙基纤维素微球使犬肾动脉栓塞，经组织匀浆的生物学测定表明，栓塞后6小时，肾脏仍有MMC的生物活性，而外周血中的MMC水平比对照组中的MMC水平明显降低。Fujimoto〔2〕用丝裂霉素C溶液和MMC—AMS微球对荷瘤(VX2)家兔作肝动脉灌注，发现MMC组外周静脉血药浓度达峰时(tp)极短，达峰后迅速下降，血药消除半衰期(t1/2仅7～10分钟，而微球组血药上升与下降均较缓慢，t1/2为20分钟。Goldberg〔2〕等用标记有141I的白蛋白微球进行肝动脉栓塞，发现整个肝脏的放射活性半衰期为1.5～11.7天，平均为2.4天，而肿瘤部位的放射活性存在时间比非肿瘤区的肝脏存在时间要长得多，所有这些均证实了微球内药物在体内具有缓释作用。因此，作为药物载体的微球，栓塞于动脉末梢时，起到了“药物贮存站”的作用，不断向邻近靶组织释放药物，在靶组织局部产生持久、恒定的血药浓度，从而有效地杀伤靶细胞，减少全身性毒副作用。
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结合血管密度改变的结果我们可以推知，顺铂白蛋白微球对肿瘤细胞的杀伤作用机制是肿瘤局部持续、有效浓度CDDP诱发的舌癌细胞的凋亡过程及肿瘤血管栓塞导致肿瘤细胞缺血、缺氧所致的肿瘤细胞坏死过程的迭加协同作用，而且巧妙地实现了“缺血条件可增强肿瘤对化疗药物的反应”之原理。从而使CDDP—AMS对肿瘤组织的损伤更为迅速、彻底，杀瘤效应更加增强，毒副作用减少。
参考文献
[1]Kato T, Nemoto R, Mori H, et al. Sustained_release properties of m icroencapsulated mitomycin C with ethylcellulose infused into the renal artery o f the dog. Cancer. 1980;46:14
[2]Fujimoto S, Miyazaki M, Endoh F, et al. Mitomycin C carrying micro spheres as a novel method of drug delivery. Cancer Drug Deliv. 1985;2(3):173.
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[3]Goldberg JA, Wlmott NS, Anderson TH, et al. The biodegradation of album in microspheres used for regional chemotherapy in patients with colorectal liver m etastases. Nucl Med Commun. 1991;12(1):57
[4]Lichtenstein AK,Peude D.Enhancement of natural killer cytotoxicity by cis-diamminedichloroplatinum(Ⅱ) in vivo and CancerRes.1986;46:639.
(收稿：1999—03—04), 百拇医药