放线共生放线杆菌的分型和基因鉴定方法
作者：刘 宏 综述 吴织芬 王勤涛 审校
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：放线共生放线杆菌；分型；基因鉴定
牙体牙髓牙周病学杂志990265
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0180-03
放线共生放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa) 是革兰氏阴性、兼性厌氧的球杆菌，它在牙周炎患者的牙周袋中检出率较高，有报告 90%‘以上青少年牙周炎的牙周损害部位有此菌定居[1]，因此， 被认为是与牙周炎，尤其是青少年牙周炎的发生紧密相关的口腔致病菌。但不同病种Aa的类型并不完全相同，说明其致病力存在差别，以下就Aa的几种分型方法和与临床牙周状况间关系加以综述。
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1 生物型(biotype)
细菌的生物型是根据其生化反应的不同划分的。Aa的生化特征并不十分一致，其共性特征为：发酵果糖、葡萄糖、不溶血、吲哚反应阴性、产生过氧化氢酶、生长不需要X和V因子，以此与其它菌种相区别。但根据对碳水化合物的发酵，尤其是对糊精、半乳糖、麦芽糖、甘露醇和木糖的发酵能力不同，又将Aa分成10个生物型[1]。由于对Aa生物型的确定费时、复杂、工作量大，现在应用较少。 据研究发现，同一个体口腔内不同牙位分离的Aa基本上为同一生物型，在同一家庭不同成员中分离到的Aa菌也常为同一生物型[1]。
2 血清型(serotype)
细菌的血清型是以菌种抗原结构的差别来划分的，抗原结构不同，则宿主产生的抗体也不同。Aa血清型的研究包括以下几方面：血清型的种类，临床分离菌的血清型鉴定，血清型菌落在不同牙周状况中的分布，血清型抗原的成分等。
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关于Aa血清型的种类,公认的有三种:血清型a、b、c[2],近年,两种新的血清型d和e又分别被发现[3]，同时，少数临床分离菌由于没有抗原性,无法确定其类型，将之称为未确定型(untype)[3]。因此，Aa 菌的血清型分类现在认为至少有5种，至于未确定型，仍有待研究。而且最初的研究认为同一受试者只含一种血清型，目前多数人则认为同一个体可含两种血清型，但这种情况所占比例较少。
Aa菌血清型与临床牙周状况的关系目前仍有争议，国外的报告大多认为血清型b株在牙周炎患者中检出率较高,尤其是青少年牙周炎患者血清型b 株的发生率是a、c两型的2倍,说明b型为高毒力株。 但国内的研究则显示青少年牙周炎患者的分离菌以c型为主[4],因此,究竟哪种血清型为主要致病菌,哪型细菌毒力更强,仍难以确定,这可能与种族、性别、年龄、地理等因素有关。至于Aa 血清型的稳定性，一些研究[3]证明可保持不变，追踪数年其血清型仍保持其稳定性， 即使治疗也不能使其发生改变。
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对血清型的研究在血清型抗原的组成方面较多，而微生物抗原结构和功能的研究则对于确定细菌表面成分、相应的毒力因子，阐明宿主对感染因子的免疫反应都十分有用。Aa血清型抗原是耐热、高分子量、位于细菌表面的碳水化合物。血清型a抗原在不同患者其变异较大，可能是Aa的共同抗原[5]。血清型c 抗原是含大量甘露糖的多糖[5]，是Aa荚膜的一部分。由于多数研究结果认为血清型b株与牙周支持组织的破坏有关[2]，因此对血清型b抗原的结构研究较多，多数研究报告[6]血清型b抗原位于内毒素脂多糖(LPS)的多糖部分，但McArthur[7]的结果则完全相反，认为血清型b抗原是与LPS无关的多糖，是由细胞膜伸出的无定型物质。因此，三种血清型抗原的成分仍存在分歧。另外，由于所采用的研究方法不同，所确定的抗原成分也不同，液体培养基的上清液中分离的血清型a、b、c 抗原是含大量甘露糖的多糖，而用高温灭菌法和超声处理所得血清型b 抗原则不含甘露糖[6]。由于血清型d、e株Aa菌发现较晚[3]，因此，对这两种菌株血清型特异性抗原研究较少，Yamamoto[8]用高温灭菌法报告血清型d抗原主要由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖组成，而血清型e抗原还含有半乳糖和无法确定的糖。
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从以上血清型特异性抗原成分的分析可见：由于成分的不同而导致其抗原性的不同，显示了各不相同的致病性及临床表现。因此，需进一步研究基因水平的差别，从而将表型与基因型联系起来。
3 基因型(genotype)
随着分子生物学技术的发展，对各种疾病的病因、发病机理、诊断和治疗等各方面的研究也逐步深入到分子水平，对Aa菌的研究也是如此，与生物型和血清型依赖于少数基因的表达不同， 基因型的研究完全是从 DNA 的水平对细菌的“指纹”(fingerprint)加以区分，而与以往利用代谢和抗原差别的方法不同， 所以基因型的分类是以使用的方法来划分，并相应地命名。
3.1 限制性内切酶(restrict endonuclease analysis,REA)分析
限制性内切酶分析就是利用某些合适的限制性内切酶对双股全染色体DNA 碱基对的某些特异性部位加以识别和裂解，由于不同菌株之间DNA的差异， 产生的DNA片段的数量和分子量就有差别， 以此分析相互之间基因的异型性和相似性。Han[9]用12种限制性内切酶对12个Aa标准菌株进行分析，产生了10个基因型，同时显示SalⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ是区分Aa的可行性限制性内切酶。van Steebergen[10]用6种方法对32株Aa进行分类，REA法只得到5种基因型，其中血清型a、c各1个，b型3个。Zambon用16种限制性内切酶对143个Aa菌株进行分类， 结果共分成3个基因型，并且EcoRⅠ和HindⅢ对分型较好，产生的条带清晰易辨。 现在公认的观点如某种酶切产生的条带少于30个则该酶较好，否则一般不被采用。
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3.2 限制性片段长度的多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析
DNA分子在进化过程中，由于突变和重排，可使DNA顺序发生改变，其中某些中性突变，虽不改变基因表达产物性质，但可能造成限制酶切位点的增加、缺失、异位，致使DNA分子的限制酶切位点数目和限制性长度发生改变， 即所谓限制性片段长度的多态性(RFLP)。方法上是将待检染色体DNA 酶切后用标记了的特异性DNA探针与之杂交(Southern blot)，显示菌株酶切后长度的差异。DiRienzo[11]用4.7kb DNA探针检查133株分离菌，得到6种RFLP型，而且B型与青少年牙周炎有关，因有3名牙周健康转为青少年牙周炎都是B型，而成人牙周炎者无一人为B型，说明B型为高毒性菌株。DiRienzo[12]的另一项118人的研究结果得到13个RFLP型，因此，虽然所选用的探针相同，但因所选病人及分离菌株的差异，得到的基因型并不统一，则其重复性仍有待研究。当然，如果所选探针不同，则所得到的“指纹”不会相同，基因型数目也不会相同。
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3.3 核糖型(ribotype)
本法与RFLP分析较相似，只是所选择探针不同，它是以含大肠杆菌rRNA操纵子的质粒为探针，与限制性酶切后的DNA杂交后显示不同分型， 本法较之以上两者的优点是产生的条带数目少，便于鉴别。van Steenbergen[10]以BamHI和BglI对32个菌株分型，分别得到24和32个核糖型基因型，表明用不同的限制性内切酶产生的结果不同。
3.4 随机引物-聚合酶链反应(Arbitrary primer-polymerase chain reaction,AP-PCR)分析
由于PCR技术的敏感性，其应用日益增多，对细菌的检测可达106个菌中只含10个靶细菌的敏感度，AP-PCR法是用一段短的随机合成的寡核苷酸(约10～20bp)作引物，与DNA杂交后加以扩增，由于细菌不同类型之间在DNA全长上的少数差别而得到不同长度的片段，最后根据电泳条带的数目和分子量差别对同种细菌分型。Asikainen[13]对93株临床分离菌分析，产生15个基因型，其中有7个基因型只在牙周炎中发现，Preus[14]将20个菌株分成14个基因型， 同一个体的菌落其基因型相同。
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4 结语
找出确切、敏感、特异、重复性好的、公认的分型方法，从而进行流行病学调查，比较各种不同类型菌与口腔牙周病之间的关系，尤其是与青少年牙周炎的相关性；对确定高毒性菌株、发现高危人群、做到定期随访、监控牙周状况和变化、在发病早期即采取针对性的治疗有重要意义；采用基因工程的方法对高毒性株进行改造，使之毒性降低；以及制作疫苗对高危人群进行免疫，将可望有效地预防牙周炎的发生。
参考文献
1 Zambon JJ, Christersson LA, Slots J. Actinobacillus actinomycetemcomitans in human periodontal disease.Pevalence in patient group and distribution of biotype and serotype within families.J Periodontol, 1983,54(12):707
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2 Zambon JJ, Slots J,Genco RJ.Serology of oral Actinobacillus actinomycetemcomitans and serotype distribution in human periodontal disease.Infect Immun,1983,41(1):19
3 Saarele M,Asikainen S,Alaluusua S et al. Frequency and stability of mono-or polo-infection by Actinobacillus actinomycetemcomitans serotype a,b,c,d, and e.Oral Microbiol Immunol,1992,7(5):277
4 王者玲,杨圣辉, 尚佳健.放线共生放线杆菌的血清型分布. 中华口腔医学杂志,1997,32(1):7
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5 Califano JV, Schenkein HA, Tew JG. Immunodominant antigens of Actinobacillus actinomy -cetemcomitans serotypes a and c in high-responder patients. Oral Microbiol Immunol, 1991,6(4):228
6 Rage RC, Sims TJ, Engel LD et al. The immunodominant outer membrane antigen of Actinobacillus actinomycetemcomitans is located in the serotype-specific high-molecular mass carbohydrate moiety of lipopolysaccharide. Infect Immun, 1991,59(10):3451
, 百拇医药
7 McArthur WP,Stroup S,McClenllan S et al. Differentiation of serotype b and species -specific antigens of Actinobacillus actinomycetemcomitans recognized by monoclonal antibodies.Oral Microbiol Immunolm, 1996,11(4):209
8 Yomamoto M.Purification of serotype d and e- specific antigens from Actinobacillus actinomycetemcomitans and seroclassification of clinical isolates from periodontal patients. Kokubyo Gakkai Zasshi, 1996,63(1):174
, 百拇医药
9 Han NM, Hoover CI, Winkler JR et al. Identification of genomic clonal types of Actinobacillus actinomycetemcomitans by restriction endonu- clease analysis. J Clin Microbiol, 1991,29(8):1574
10 van Steenbergen TJM, Bosch-Tijhof GJ,van Winkelhoff AJ et al. Comparision of six typing methods for Actinobacillus actinomycetem-comitans.J Clin Microbiol, 1994,32(11):2769
11 DiRienzo JM, Slots J.Genetic approach to the study of epidemiology and pathogenesis of Actinobacillus actinomycetemcomitans in localized juvenile periodontitis. Arch Oral Biol, 1990,35(suppl):79s
, 百拇医药
12 DiRienzo JM, Slots J,Sixou M et al. Specific genetic variants of Actinobacillus actinomy -cetemcomitans correlate with disease and health in a regional population of families with localized juvenile periodontitis. Infect Immun, 1994,62(8):3058
13 Asikainen S,Chen C,Slots J.Actinobacillus actinomycetemcomitans genotypes in relation to serotypes and periodontal status. Oral Microbol Immunol, 1995,10(2):65
14 Preus HR, Haraszthy VI, Zambon JJ et al. Differentiation of strains of Actinobacillus actinomycetemcomitan by arbitrarily primed polywerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1993,31(10):2773
收稿日期：1997-12-29, http://www.100md.com
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：放线共生放线杆菌；分型；基因鉴定
牙体牙髓牙周病学杂志990265
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0180-03
放线共生放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa) 是革兰氏阴性、兼性厌氧的球杆菌，它在牙周炎患者的牙周袋中检出率较高，有报告 90%‘以上青少年牙周炎的牙周损害部位有此菌定居[1]，因此， 被认为是与牙周炎，尤其是青少年牙周炎的发生紧密相关的口腔致病菌。但不同病种Aa的类型并不完全相同，说明其致病力存在差别，以下就Aa的几种分型方法和与临床牙周状况间关系加以综述。
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1 生物型(biotype)
细菌的生物型是根据其生化反应的不同划分的。Aa的生化特征并不十分一致，其共性特征为：发酵果糖、葡萄糖、不溶血、吲哚反应阴性、产生过氧化氢酶、生长不需要X和V因子，以此与其它菌种相区别。但根据对碳水化合物的发酵，尤其是对糊精、半乳糖、麦芽糖、甘露醇和木糖的发酵能力不同，又将Aa分成10个生物型[1]。由于对Aa生物型的确定费时、复杂、工作量大，现在应用较少。 据研究发现，同一个体口腔内不同牙位分离的Aa基本上为同一生物型，在同一家庭不同成员中分离到的Aa菌也常为同一生物型[1]。
2 血清型(serotype)
细菌的血清型是以菌种抗原结构的差别来划分的，抗原结构不同，则宿主产生的抗体也不同。Aa血清型的研究包括以下几方面：血清型的种类，临床分离菌的血清型鉴定，血清型菌落在不同牙周状况中的分布，血清型抗原的成分等。
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关于Aa血清型的种类,公认的有三种:血清型a、b、c[2],近年,两种新的血清型d和e又分别被发现[3]，同时，少数临床分离菌由于没有抗原性,无法确定其类型，将之称为未确定型(untype)[3]。因此，Aa 菌的血清型分类现在认为至少有5种，至于未确定型，仍有待研究。而且最初的研究认为同一受试者只含一种血清型，目前多数人则认为同一个体可含两种血清型，但这种情况所占比例较少。
Aa菌血清型与临床牙周状况的关系目前仍有争议，国外的报告大多认为血清型b株在牙周炎患者中检出率较高,尤其是青少年牙周炎患者血清型b 株的发生率是a、c两型的2倍,说明b型为高毒力株。 但国内的研究则显示青少年牙周炎患者的分离菌以c型为主[4],因此,究竟哪种血清型为主要致病菌,哪型细菌毒力更强,仍难以确定,这可能与种族、性别、年龄、地理等因素有关。至于Aa 血清型的稳定性，一些研究[3]证明可保持不变，追踪数年其血清型仍保持其稳定性， 即使治疗也不能使其发生改变。
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对血清型的研究在血清型抗原的组成方面较多，而微生物抗原结构和功能的研究则对于确定细菌表面成分、相应的毒力因子，阐明宿主对感染因子的免疫反应都十分有用。Aa血清型抗原是耐热、高分子量、位于细菌表面的碳水化合物。血清型a抗原在不同患者其变异较大，可能是Aa的共同抗原[5]。血清型c 抗原是含大量甘露糖的多糖[5]，是Aa荚膜的一部分。由于多数研究结果认为血清型b株与牙周支持组织的破坏有关[2]，因此对血清型b抗原的结构研究较多，多数研究报告[6]血清型b抗原位于内毒素脂多糖(LPS)的多糖部分，但McArthur[7]的结果则完全相反，认为血清型b抗原是与LPS无关的多糖，是由细胞膜伸出的无定型物质。因此，三种血清型抗原的成分仍存在分歧。另外，由于所采用的研究方法不同，所确定的抗原成分也不同，液体培养基的上清液中分离的血清型a、b、c 抗原是含大量甘露糖的多糖，而用高温灭菌法和超声处理所得血清型b 抗原则不含甘露糖[6]。由于血清型d、e株Aa菌发现较晚[3]，因此，对这两种菌株血清型特异性抗原研究较少，Yamamoto[8]用高温灭菌法报告血清型d抗原主要由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖组成，而血清型e抗原还含有半乳糖和无法确定的糖。
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从以上血清型特异性抗原成分的分析可见：由于成分的不同而导致其抗原性的不同，显示了各不相同的致病性及临床表现。因此，需进一步研究基因水平的差别，从而将表型与基因型联系起来。
3 基因型(genotype)
随着分子生物学技术的发展，对各种疾病的病因、发病机理、诊断和治疗等各方面的研究也逐步深入到分子水平，对Aa菌的研究也是如此，与生物型和血清型依赖于少数基因的表达不同， 基因型的研究完全是从 DNA 的水平对细菌的“指纹”(fingerprint)加以区分，而与以往利用代谢和抗原差别的方法不同， 所以基因型的分类是以使用的方法来划分，并相应地命名。
3.1 限制性内切酶(restrict endonuclease analysis,REA)分析
限制性内切酶分析就是利用某些合适的限制性内切酶对双股全染色体DNA 碱基对的某些特异性部位加以识别和裂解，由于不同菌株之间DNA的差异， 产生的DNA片段的数量和分子量就有差别， 以此分析相互之间基因的异型性和相似性。Han[9]用12种限制性内切酶对12个Aa标准菌株进行分析，产生了10个基因型，同时显示SalⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ是区分Aa的可行性限制性内切酶。van Steebergen[10]用6种方法对32株Aa进行分类，REA法只得到5种基因型，其中血清型a、c各1个，b型3个。Zambon用16种限制性内切酶对143个Aa菌株进行分类， 结果共分成3个基因型，并且EcoRⅠ和HindⅢ对分型较好，产生的条带清晰易辨。 现在公认的观点如某种酶切产生的条带少于30个则该酶较好，否则一般不被采用。
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3.2 限制性片段长度的多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析
DNA分子在进化过程中，由于突变和重排，可使DNA顺序发生改变，其中某些中性突变，虽不改变基因表达产物性质，但可能造成限制酶切位点的增加、缺失、异位，致使DNA分子的限制酶切位点数目和限制性长度发生改变， 即所谓限制性片段长度的多态性(RFLP)。方法上是将待检染色体DNA 酶切后用标记了的特异性DNA探针与之杂交(Southern blot)，显示菌株酶切后长度的差异。DiRienzo[11]用4.7kb DNA探针检查133株分离菌，得到6种RFLP型，而且B型与青少年牙周炎有关，因有3名牙周健康转为青少年牙周炎都是B型，而成人牙周炎者无一人为B型，说明B型为高毒性菌株。DiRienzo[12]的另一项118人的研究结果得到13个RFLP型，因此，虽然所选用的探针相同，但因所选病人及分离菌株的差异，得到的基因型并不统一，则其重复性仍有待研究。当然，如果所选探针不同，则所得到的“指纹”不会相同，基因型数目也不会相同。
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3.3 核糖型(ribotype)
本法与RFLP分析较相似，只是所选择探针不同，它是以含大肠杆菌rRNA操纵子的质粒为探针，与限制性酶切后的DNA杂交后显示不同分型， 本法较之以上两者的优点是产生的条带数目少，便于鉴别。van Steenbergen[10]以BamHI和BglI对32个菌株分型，分别得到24和32个核糖型基因型，表明用不同的限制性内切酶产生的结果不同。
3.4 随机引物-聚合酶链反应(Arbitrary primer-polymerase chain reaction,AP-PCR)分析
由于PCR技术的敏感性，其应用日益增多，对细菌的检测可达106个菌中只含10个靶细菌的敏感度，AP-PCR法是用一段短的随机合成的寡核苷酸(约10～20bp)作引物，与DNA杂交后加以扩增，由于细菌不同类型之间在DNA全长上的少数差别而得到不同长度的片段，最后根据电泳条带的数目和分子量差别对同种细菌分型。Asikainen[13]对93株临床分离菌分析，产生15个基因型，其中有7个基因型只在牙周炎中发现，Preus[14]将20个菌株分成14个基因型， 同一个体的菌落其基因型相同。
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4 结语
找出确切、敏感、特异、重复性好的、公认的分型方法，从而进行流行病学调查，比较各种不同类型菌与口腔牙周病之间的关系，尤其是与青少年牙周炎的相关性；对确定高毒性菌株、发现高危人群、做到定期随访、监控牙周状况和变化、在发病早期即采取针对性的治疗有重要意义；采用基因工程的方法对高毒性株进行改造，使之毒性降低；以及制作疫苗对高危人群进行免疫，将可望有效地预防牙周炎的发生。
参考文献
1 Zambon JJ, Christersson LA, Slots J. Actinobacillus actinomycetemcomitans in human periodontal disease.Pevalence in patient group and distribution of biotype and serotype within families.J Periodontol, 1983,54(12):707
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6 Rage RC, Sims TJ, Engel LD et al. The immunodominant outer membrane antigen of Actinobacillus actinomycetemcomitans is located in the serotype-specific high-molecular mass carbohydrate moiety of lipopolysaccharide. Infect Immun, 1991,59(10):3451
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7 McArthur WP,Stroup S,McClenllan S et al. Differentiation of serotype b and species -specific antigens of Actinobacillus actinomycetemcomitans recognized by monoclonal antibodies.Oral Microbiol Immunolm, 1996,11(4):209
8 Yomamoto M.Purification of serotype d and e- specific antigens from Actinobacillus actinomycetemcomitans and seroclassification of clinical isolates from periodontal patients. Kokubyo Gakkai Zasshi, 1996,63(1):174
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10 van Steenbergen TJM, Bosch-Tijhof GJ,van Winkelhoff AJ et al. Comparision of six typing methods for Actinobacillus actinomycetem-comitans.J Clin Microbiol, 1994,32(11):2769
11 DiRienzo JM, Slots J.Genetic approach to the study of epidemiology and pathogenesis of Actinobacillus actinomycetemcomitans in localized juvenile periodontitis. Arch Oral Biol, 1990,35(suppl):79s
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13 Asikainen S,Chen C,Slots J.Actinobacillus actinomycetemcomitans genotypes in relation to serotypes and periodontal status. Oral Microbol Immunol, 1995,10(2):65
14 Preus HR, Haraszthy VI, Zambon JJ et al. Differentiation of strains of Actinobacillus actinomycetemcomitan by arbitrarily primed polywerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1993,31(10):2773
收稿日期：1997-12-29, http://www.100md.com