牙髓损伤性刺激对三叉神经节中前速激肽原等mRNA的影响*
作者：朱美玲1 赵 皿1 胡三觉2
单位：第四军医大学：1.口腔医学院，2.神经科学研究所，陕西 西安 710032
关键词：急性牙髓炎；开髓；P物质；降钙素基因相关肽；mRNA
牙体牙髓牙周病学杂志990215 摘要 目的：比较和分析急性牙髓炎和牙齿开髓刺激对三叉神经节中PPTA mRNA、β-CGRP mRNA的影响。方法：利用斑点杂交分析方法。结果：开髓1h后两种mRNA表达增高，2h持续增高，4h仍维持较高水平。炎症2h组两种mRNA均有高表达，4h组mRNA含量高于2h组。任何一组的CGRP mRNA杂交信号强于PPTA mRNA杂交信号。结论：两种刺激均增加三叉神经节中P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)的合成。
中图号：R338.3 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0130-03
, http://www.100md.com
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999,9(2):130]
Effect of noxious pulpal stimulation on PPTA mRNA、β-CGRP mRNA in trigiminal ganglion
Zhu Meiling, Zhao Min, Hu Sanjue
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim：To evaluate the effect of the acute pulpitis and the opening of pulp chamber on PPTA mRNA、β-CGRP mRNA in trigiminal ganglion. Method: Dot hybridization. Results: In 1h group of the opening of pulp chamber, the expression of the two kinds of mRNA increased,and the level of the expression rised continually at 2h and maintained in high level at 4h.In the 2h group of the inflammation, the two kinds of mRNA expressed evidently,and the content of mRNA at 4h was larger than that at 2h.In all groups,the signal of CGRP mRNA was stronger than that of PPTA mRNA. Conclusion: Both inflammatory and mechanical stimulation lead to the synthesis of SP and CGRP in the trigiminal ganglion.
, 百拇医药
Key words acute pulpitis；opening of pulp chamber；SP ；CGRP；mRNA
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(2):130]
SP、CGRP主要存在于三叉神经节的中小神经元中[1～3]，这些神经元是参与痛觉信息传递的主要神经元。研究发现大鼠急性牙髓炎时三叉神经节中SP、CGRP免疫阳性结构增多。我们已经观察到大鼠急性牙髓炎早期及牙齿开髓刺激引起三叉神经脊束核尾侧亚核区域SP、CGRP免疫阳性纤维数量减少。尚未明确这一现象的原因是由于纤维末梢大量释放所致，还是由于三叉神经接种神经元合成减少所致。因此，我们将应用斑点杂交分析方法观察大鼠牙齿伤害性刺激后，三叉神经节中PPTA mRNA，β-CGRP mRNA含量的变化。
1 材料和方法
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1.1 实验分组、动物模型制备和取材
选用雄性SD大鼠，165～230g，分6组：①正常对照组(n=4)，②急性牙髓炎2h组(n=6)，③急性牙髓炎4h组(n=6)，④开髓1h组(n=6)，⑤开髓2h组(n=6)，⑥开髓4h组(n=6)。4g/L戊巴比妥钠(1ml/100g)腹腔注射麻醉。麻醉生效后，实验组大鼠第一磨牙面开髓至点状露髓，探针搔刮穿髓点3～4次。炎症组大鼠封1%角叉菜胶2h或4h。开髓组封生理盐水1h、2h或4h。正常对照组麻醉后存活2h处死。待动物达规定时间点后，将动物乙醚吸入麻醉后迅速断头取三叉神经节，放入液氮中速冻。
1.2 提取三叉神经节总RNA并定量
按改良Chomczynski RNA快速提取方法提取三叉神经节组织总RNA，紫外分光光度计测波长260和280的A值。计算各样本总RNA含量和纯度。取A260/A280>1.9者点膜。
, 百拇医药
1.3 杂交膜制备
取总RNA加等体积RNA变性液65℃变性30min。取10μg(PPTA mRNA杂交用)或5μg(CGRP mRNA杂交用)变性RNA点于硝酸纤维素膜，室温静止20min，80℃烘烤2h待用。
1.4 探针制备和标记
实验用探针由Applied Biosystem 381A DNA合成仪合成。均为寡核苷酸探针。PPTA探针含30个碱基，其序列与大鼠脑内PPTA mRNA的第175号碱基到第204号碱基互补。β-CGRP探针含有35个碱基，其序列与大鼠脑内β-CGRP mRNA的第656～690号碱基互补。合成的探针由3'末端标记法进行γ-32PdATP标记。
1.5 斑点杂交及分析
将硝酸纤维素膜和预杂交液封于杂交袋中，42℃预杂交16h。将标记探针(2μg)加入杂交袋中，42℃，12h。洗膜后，暗盒内X光胶片放射自显影3d，洗片。扫描仪扫描，计算各样本灰度值。
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2 结果
放射自显影结果显示，未经处理的对照组PPTA mRNA和β-CGRP mRNA均有较高水平表达，开髓1h后两种mRNA表达增高，2h持续增高，4h仍维持较高水平。炎症2h组两种mRNA均有高表达，4h组mRNA含量高于2h组。任何一组的CGRP mRNA杂交信号强于PPTA mRNA杂交信号(图1 ,2,3,4)。
图1 图2
A：正常组；B：开髓1h组；C：开髓2h组；
D：开髓4h组；E：牙髓炎2h组；F：牙髓炎4h组
图1 牙齿伤害性刺激对三叉神经节中PPTA mRNA的影响
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图2 牙齿伤害性刺激对三叉神经节中β-CGRP mRNA的影响
图3 牙齿开髓组三叉神经节神经元PPTA mRNA、β-CGRP mRNA的表达
图4 牙髓炎组三叉神经节神经元PPTA mRNA、β-CGRP mRNA的表达
3 讨论
PPTA(前速激肽原A)是编码SP的前体。PPTA mRNA 主要存在于三叉神经节的中、小神经元中，三叉神经节中只有少量神经元表达PPTA mRNA[8]。β-CGRP mRNA主要位于三叉神经节的中、小神经元中[6]，β-CGRP可能与痛觉传递有关。
, 百拇医药
Donaldson发现[4]鼠后肢注射佐剂后8h，背根神经元中PPTA mRNA和CGRP mRNA增多。同侧坐骨神经麻醉后可以防止PPTA mRNA和CGRP mRNA的变化。本实验也证实给予牙髓炎性及机械损伤性刺激，增加三叉神经节中PPTA mRNA和CGRP mRNA的表达，证实伤害性刺激增加背根神经节中和三叉神经节中PPTA mRNA和CGRP mRNA的表达增加，加速合成SP和CGRP，其意义在于大量合成的SP和CGRP通过轴浆运输到达末梢区域，为伤害性刺激引起的SP和CGRP的释放提供底物。逆行标记牙髓神经结合酶免疫组织化学研究证实[5～7]，三叉神经节中支配牙髓的神经元胞体有大、中、小三种神经元。被标记的SP阳性胞体主要是中、小神经元，占标记细胞的极少部分。被标记的CGRP阳性胞体，占被标记细胞的一半以上，60%以上小型细胞为CGRP阳性，70%以上大型细胞为CGRP阳性。武胜昔进一步证实[6]α-CGRP mRNA可见于大、中、小细胞中 ，而β-CGRP只见于中、小细胞，PPTA mRNA和CGRP mRNA可共存于同一神经元中。这些结果支持SP和β-CGRP参与痛信息传递过程。但是CGRP阳性胞体明显多于SP阳性胞体，三叉神经节中有大量大的牙髓神经标记细胞，本实验结果显示相同条件下三叉神经节中CGRP mRNA量多于SP mRNA ，其它实验也有类似的结果，提示牙髓神经除感受伤害性刺激并传递伤害性信息外，可能还有其它功能。CGRP除具有传递伤害性信息的作用外，可能还有其它功能。三叉神经节支配牙髓大细胞的功能以及CGRP的生物学效应都有待进一步研究。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目(39370736)
参考文献
1 Ng YK, Wong WC, Ling EA. A qualitative and quantitative study of substance P immuno-cytochemistry of the trigeminal ganglion in the monkey. Anat Embryol Berl, 1993,188(1):53
2 Reuss S, Riemann R, Vollrath L. Substance P-and calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive neurons in the rat trigeminal ganglion-with special reference to meningeal and pineal innervation. Acta Histochem, 1992,92(1):104
, 百拇医药
3 Henry MA. Johnson LR, Nousek GN. Light microscopic localization of calcitonin gene-related peptide in the normal feline trigeminal system and following retrogasserian rhizotomy. J Comp Neurol, 1996,365(4):526
4 Dohrn CS, Beitz AJ. NMDA receptor mRNA expression in NOS-containing neurons in the spinal trigeminal nucleus of the rat. Neurosci Lett, 1994,175(1-2) :28
5 Tuisku F, Hildebrand C. Combined retrograde tracing and immunohisto chemistry of trigeminal ganglion neurons projecting to gingiva or tooth pulps in the lower jaw of the cichlid tilapia mariae. J Neurocytol, 1997,26(1):33
, 百拇医药
6 武胜昔，吕真，李继硕. α-和β-CGRP及PPTA mRNAs在大鼠三叉神经节神经元中的共同表达. 神经科学杂志，1997,4(1):1
7 Fried K, Arvidsson J, Robertson B et al. Combined retrograde tracing and enzyme/immunohistochemistry of trigeminal ganglion cell bodies innervating tooth pulps in the rat. Neuroscience, 1989,33(1):101
8 Iyama H, Morita Y, Noguchi K et al. Demonstration of rat preprotachy kinin A mRNA in the rat trigeminal ganglion by in situ hybridization histochemis try J. Chem Neuroanatomy, 1988,1:1
收稿日期：1999-03-15, http://www.100md.com(朱美玲1 赵 皿1 胡三觉2)
单位：第四军医大学：1.口腔医学院，2.神经科学研究所，陕西 西安 710032
关键词：急性牙髓炎；开髓；P物质；降钙素基因相关肽；mRNA
牙体牙髓牙周病学杂志990215 摘要 目的：比较和分析急性牙髓炎和牙齿开髓刺激对三叉神经节中PPTA mRNA、β-CGRP mRNA的影响。方法：利用斑点杂交分析方法。结果：开髓1h后两种mRNA表达增高，2h持续增高，4h仍维持较高水平。炎症2h组两种mRNA均有高表达，4h组mRNA含量高于2h组。任何一组的CGRP mRNA杂交信号强于PPTA mRNA杂交信号。结论：两种刺激均增加三叉神经节中P物质(SP)、降钙素基因相关肽(CGRP)的合成。
中图号：R338.3 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0130-03
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[牙体牙髓牙周病学杂志，1999,9(2):130]
Effect of noxious pulpal stimulation on PPTA mRNA、β-CGRP mRNA in trigiminal ganglion
Zhu Meiling, Zhao Min, Hu Sanjue
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aim：To evaluate the effect of the acute pulpitis and the opening of pulp chamber on PPTA mRNA、β-CGRP mRNA in trigiminal ganglion. Method: Dot hybridization. Results: In 1h group of the opening of pulp chamber, the expression of the two kinds of mRNA increased,and the level of the expression rised continually at 2h and maintained in high level at 4h.In the 2h group of the inflammation, the two kinds of mRNA expressed evidently,and the content of mRNA at 4h was larger than that at 2h.In all groups,the signal of CGRP mRNA was stronger than that of PPTA mRNA. Conclusion: Both inflammatory and mechanical stimulation lead to the synthesis of SP and CGRP in the trigiminal ganglion.
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Key words acute pulpitis；opening of pulp chamber；SP ；CGRP；mRNA
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(2):130]
SP、CGRP主要存在于三叉神经节的中小神经元中[1～3]，这些神经元是参与痛觉信息传递的主要神经元。研究发现大鼠急性牙髓炎时三叉神经节中SP、CGRP免疫阳性结构增多。我们已经观察到大鼠急性牙髓炎早期及牙齿开髓刺激引起三叉神经脊束核尾侧亚核区域SP、CGRP免疫阳性纤维数量减少。尚未明确这一现象的原因是由于纤维末梢大量释放所致，还是由于三叉神经接种神经元合成减少所致。因此，我们将应用斑点杂交分析方法观察大鼠牙齿伤害性刺激后，三叉神经节中PPTA mRNA，β-CGRP mRNA含量的变化。
1 材料和方法
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1.1 实验分组、动物模型制备和取材
选用雄性SD大鼠，165～230g，分6组：①正常对照组(n=4)，②急性牙髓炎2h组(n=6)，③急性牙髓炎4h组(n=6)，④开髓1h组(n=6)，⑤开髓2h组(n=6)，⑥开髓4h组(n=6)。4g/L戊巴比妥钠(1ml/100g)腹腔注射麻醉。麻醉生效后，实验组大鼠第一磨牙面开髓至点状露髓，探针搔刮穿髓点3～4次。炎症组大鼠封1%角叉菜胶2h或4h。开髓组封生理盐水1h、2h或4h。正常对照组麻醉后存活2h处死。待动物达规定时间点后，将动物乙醚吸入麻醉后迅速断头取三叉神经节，放入液氮中速冻。
1.2 提取三叉神经节总RNA并定量
按改良Chomczynski RNA快速提取方法提取三叉神经节组织总RNA，紫外分光光度计测波长260和280的A值。计算各样本总RNA含量和纯度。取A260/A280>1.9者点膜。
, 百拇医药
1.3 杂交膜制备
取总RNA加等体积RNA变性液65℃变性30min。取10μg(PPTA mRNA杂交用)或5μg(CGRP mRNA杂交用)变性RNA点于硝酸纤维素膜，室温静止20min，80℃烘烤2h待用。
1.4 探针制备和标记
实验用探针由Applied Biosystem 381A DNA合成仪合成。均为寡核苷酸探针。PPTA探针含30个碱基，其序列与大鼠脑内PPTA mRNA的第175号碱基到第204号碱基互补。β-CGRP探针含有35个碱基，其序列与大鼠脑内β-CGRP mRNA的第656～690号碱基互补。合成的探针由3'末端标记法进行γ-32PdATP标记。
1.5 斑点杂交及分析
将硝酸纤维素膜和预杂交液封于杂交袋中，42℃预杂交16h。将标记探针(2μg)加入杂交袋中，42℃，12h。洗膜后，暗盒内X光胶片放射自显影3d，洗片。扫描仪扫描，计算各样本灰度值。
, http://www.100md.com
2 结果
放射自显影结果显示，未经处理的对照组PPTA mRNA和β-CGRP mRNA均有较高水平表达，开髓1h后两种mRNA表达增高，2h持续增高，4h仍维持较高水平。炎症2h组两种mRNA均有高表达，4h组mRNA含量高于2h组。任何一组的CGRP mRNA杂交信号强于PPTA mRNA杂交信号(图1 ,2,3,4)。
图1 图2
A：正常组；B：开髓1h组；C：开髓2h组；
D：开髓4h组；E：牙髓炎2h组；F：牙髓炎4h组
图1 牙齿伤害性刺激对三叉神经节中PPTA mRNA的影响
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图2 牙齿伤害性刺激对三叉神经节中β-CGRP mRNA的影响
图3 牙齿开髓组三叉神经节神经元PPTA mRNA、β-CGRP mRNA的表达
图4 牙髓炎组三叉神经节神经元PPTA mRNA、β-CGRP mRNA的表达
3 讨论
PPTA(前速激肽原A)是编码SP的前体。PPTA mRNA 主要存在于三叉神经节的中、小神经元中，三叉神经节中只有少量神经元表达PPTA mRNA[8]。β-CGRP mRNA主要位于三叉神经节的中、小神经元中[6]，β-CGRP可能与痛觉传递有关。
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Donaldson发现[4]鼠后肢注射佐剂后8h，背根神经元中PPTA mRNA和CGRP mRNA增多。同侧坐骨神经麻醉后可以防止PPTA mRNA和CGRP mRNA的变化。本实验也证实给予牙髓炎性及机械损伤性刺激，增加三叉神经节中PPTA mRNA和CGRP mRNA的表达，证实伤害性刺激增加背根神经节中和三叉神经节中PPTA mRNA和CGRP mRNA的表达增加，加速合成SP和CGRP，其意义在于大量合成的SP和CGRP通过轴浆运输到达末梢区域，为伤害性刺激引起的SP和CGRP的释放提供底物。逆行标记牙髓神经结合酶免疫组织化学研究证实[5～7]，三叉神经节中支配牙髓的神经元胞体有大、中、小三种神经元。被标记的SP阳性胞体主要是中、小神经元，占标记细胞的极少部分。被标记的CGRP阳性胞体，占被标记细胞的一半以上，60%以上小型细胞为CGRP阳性，70%以上大型细胞为CGRP阳性。武胜昔进一步证实[6]α-CGRP mRNA可见于大、中、小细胞中 ，而β-CGRP只见于中、小细胞，PPTA mRNA和CGRP mRNA可共存于同一神经元中。这些结果支持SP和β-CGRP参与痛信息传递过程。但是CGRP阳性胞体明显多于SP阳性胞体，三叉神经节中有大量大的牙髓神经标记细胞，本实验结果显示相同条件下三叉神经节中CGRP mRNA量多于SP mRNA ，其它实验也有类似的结果，提示牙髓神经除感受伤害性刺激并传递伤害性信息外，可能还有其它功能。CGRP除具有传递伤害性信息的作用外，可能还有其它功能。三叉神经节支配牙髓大细胞的功能以及CGRP的生物学效应都有待进一步研究。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目(39370736)
参考文献
1 Ng YK, Wong WC, Ling EA. A qualitative and quantitative study of substance P immuno-cytochemistry of the trigeminal ganglion in the monkey. Anat Embryol Berl, 1993,188(1):53
2 Reuss S, Riemann R, Vollrath L. Substance P-and calcitonin gene-related peptide-like immunoreactive neurons in the rat trigeminal ganglion-with special reference to meningeal and pineal innervation. Acta Histochem, 1992,92(1):104
, 百拇医药
3 Henry MA. Johnson LR, Nousek GN. Light microscopic localization of calcitonin gene-related peptide in the normal feline trigeminal system and following retrogasserian rhizotomy. J Comp Neurol, 1996,365(4):526
4 Dohrn CS, Beitz AJ. NMDA receptor mRNA expression in NOS-containing neurons in the spinal trigeminal nucleus of the rat. Neurosci Lett, 1994,175(1-2) :28
5 Tuisku F, Hildebrand C. Combined retrograde tracing and immunohisto chemistry of trigeminal ganglion neurons projecting to gingiva or tooth pulps in the lower jaw of the cichlid tilapia mariae. J Neurocytol, 1997,26(1):33
, 百拇医药
6 武胜昔，吕真，李继硕. α-和β-CGRP及PPTA mRNAs在大鼠三叉神经节神经元中的共同表达. 神经科学杂志，1997,4(1):1
7 Fried K, Arvidsson J, Robertson B et al. Combined retrograde tracing and enzyme/immunohistochemistry of trigeminal ganglion cell bodies innervating tooth pulps in the rat. Neuroscience, 1989,33(1):101
8 Iyama H, Morita Y, Noguchi K et al. Demonstration of rat preprotachy kinin A mRNA in the rat trigeminal ganglion by in situ hybridization histochemis try J. Chem Neuroanatomy, 1988,1:1
收稿日期：1999-03-15, http://www.100md.com(朱美玲1 赵 皿1 胡三觉2)