口腔粘膜下纤维性变患者角朊细胞分泌细胞因子水平变化
作者：冯云枝 凌天牖
单位：冯云枝(湖南医科大学附属第二医院口腔科 410011)；凌天牖(湖南医科大学附属第二医院口腔科 410011)
关键词：口腔粘膜下纤维性变；角朊细胞；内皮素；β1转化生长因子
华西口腔医学杂志000106 摘 要：目的:探讨口腔粘膜上皮角朊细胞(KC)和细胞因子在口腔粘膜下纤维性变(OSF)发生中的作用。方法:分别从正常及OSF组织培养出KC(NM-KC和OSF-KC),用放射免疫法和酶联免疫吸附法测定培养细胞上清液中内皮素(ET)和β1转化生长因子(TGFβ1)的水平。结果:OSF-KC分泌ET和TGFβ1水平均高于NM-KC(P<0.05),且两者呈正相关关系。结论:外源性刺激导致的KC活化及其分泌的ET和TGFβ1的改变可能在OSF发生中起重要作用。
, 百拇医药
Changes of Cytokines Secreted by Human Oral Mucosa Keratinocytes from Oral Submucous Fibrosis in vitro
Feng Yunzhi Ling Tianyou
(Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University)
Abstract：Objective：To assess the significance of oral mucosa keratinocytes (KCs) and cytokines in the development of oral submucous fibrosis (OSF). Methods: KCs were obtained and cultured from the buccal mucosa of healthy subjects who did not chew areca nut and patients with OSF who chewed areca nut. Then radioimmunoassay and enzyme-linked immunosorbent assays were employed, and endothelin (ET) and transforming growth factor β1(TGFβ1) were quantified in culture supernatants. Results: The mean levels of ET and TGFβ1 secreted by OSF-KC were 96.983±17.802 pg/ml and 4661.641±783.893 pg/ml respectively, which were higher than these secreted by NM-KC (P<0.05); There was a positive correlation between the levels of ET and TGFβ1 secreted by OSF-KC. Conclusion: External stimuli such as areca nut components may induce the development of OSF by activating and stimulating the keratinocytes to secret a series of cytokines, including ET and TGFβ1. It is speculated that ET and TGFβ1 may be the contributing factors in the pathological features noted in OSF.
, 百拇医药
Key words：oral submucous fibrosis keratinocytes endothelin transforming growth factor β1▲
口腔粘膜下纤维性变(oral submucous fibrosis,OSF)是一种慢性、隐匿性、具有癌变可能的炎性疾病。尽管研究表明OSF的发生与咀嚼槟榔习惯密切相关[1],但其发病机理仍不明确,多数学者在研究OSF的发病机理时把成纤维细胞(fibroblast,FB)作为主要研究对象。FB位于粘膜下组织中,是合成胶原的主要细胞,无疑在OSF发生中具有重要作用[2，3]。但在咀嚼槟榔过程中,与咀嚼物首先接触的是口腔粘膜上皮,而不是粘膜下组织;而且临床上发现除与咀嚼物密切接触易受摩擦等机械损伤的部位,如颊、舌、牙龈等外,与咀嚼物不密切接触,理化刺激难以直接到达粘膜下组织的部位,如软腭、口底等也可出现纤维病变[4]。近年的研究表明皮肤和粘膜角朊细胞(keratinocyte,KC)能分泌包括内皮素(endothelin,ET)、β1转化生长因子(transforming growth factor β1,TGFβ1)在内的多种细胞因子[5，6],它们与纤维性疾病的发生密切相关。笔者推测:OSF发生中,外源性刺激物除可直接通过被破坏的上皮屏障作用于粘膜下组织外,还可能通过刺激上皮细胞,产生如细胞因子等的间接作用使FB增殖,从而导致胶原堆积。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂及仪器
DMEM培养基、小牛血清(杭州四季青生物制品厂)、分散酶Dispase Ⅱ、胰蛋白酶、兔抗人细胞角蛋白抗体(Zymed公司)、鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(Zymed公司)、内皮素放射免疫检测试剂盒(购自北京东亚免疫技术研究所)TGFβ1 ELISA试剂盒(购自深圳晶美生物工程有限公司,为美国Genzyme公司产品)、24孔培养板(Nunclon公司)、γ计数器(中国科学技术大学开发研究院)。
1.2 方法
1.2.1 KC的培养与鉴定 标本来源及KC的培养、鉴定方法见参考文献[7]。
1.2.2 ET的测定 将KC细胞以2×105/ml的密度接种于24孔板,待细胞达70%～80%融合时,换用新鲜培养基。培养48 h,收集培养细胞上清液,-70℃保存,用于检测ET和TGFβ1。采用ET放射免疫药盒,使用GC-911放射免疫伽马计数器,严格按药盒要求的操作方法检测标本中的ET值。每1组均设3个平行孔。
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1.2.3 TGFβ1的测定 由于细胞分泌的TGFβ1一般为非活化型,需进行激活后再检测,取200 μl稀释液加入到200 μl细胞上清液标本中,再加入1 mol/L HCl2 20 μl 2～8℃放置1 h,使TGFβ1激活,然后加入1 mol/L NaOH 15 μl进行中和。采用市售TGFβ1 ELISA试剂盒检测样品中TGFβ1含量。在450 nm处读数,记录OD值,绘制标准曲线,以样本的OD值推算TGFβ1浓度。
1.2.4 统计学方法 应用SPSS软件进行数据分析,均数比较采用方差分析,OSF-KC分泌ET和TGFβ1的关系采用直线相关分析,检验标准α=0.05。
2 结 果
KC分泌的ET及TGFβ1水平：由表1可见,口腔粘膜KC能分泌一定基础水平的ET和TGFβ1,而且OSF-KC分泌的ET及TGFβ1水平均高于NM-KC的分泌量(P<0.05),经直线相关分析发现OSF-KC分泌的ET和TGFβ1之间呈正相关(r=0.968,P<0.05)。
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表1 口腔粘膜KC分泌的ET和TGFβ1水平(
±s) 组别
ET(pg/ml)
TGFβ1(pg/ml)
NM-KC
14.641±15.796
2505.025±1486.676
OSF-KC
96.983±17.802*
4661.642±783.893*
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* OSF-KC与NM-KC比较P<0.05
3 讨 论
口腔粘膜上皮细胞多为KC,近年的研究表明KC不但能产生许多大分子量分子(如细胞角蛋白及粘多糖)保持口腔粘膜生化及物理的完整性;而且可分泌一系列具有免疫、炎性、增殖性特点的细胞因子[5，6]。KC可作为“信号传感器”,外源性刺激可使之产生细胞因子、粘附分子及趋化因子等,进而导致炎症反应。但是KC及其分泌的细胞因子是否参与了OSF的发病过程,目前国内外报道较少,本研究结果显示OSF-KC分泌的ET和TGFβ1水平明显高于NM-KC,且两者呈正相关,说明KC及其分泌的ET和TGFβ1可能在OSF发生中起重要作用。
ET是一类由21个氨基酸组成的血管活性肽,有3种异构体。ET被认为是一种内源性损伤因子[8],它不仅具有血管收缩功能,而且具有丝裂原作用。ET可以通过刺激FB增殖,促进其胶原合成、抑制胶原降解以及使FB向肌纤维母细胞转换等作用而引起组织纤维化[9],与动脉粥样硬化、肺纤维化、肝纤维化、肾小球硬化、硬皮病等纤维性疾病的发生密切相关[8]。TGFβ1是一类具有多种生物学活性的细胞因子,与一些纤维性疾病的发生、发展密切相关。高义军等[6]研究发现OSF组织KC内TGFβ1 mRNA呈阳性表达,结合本研究结果可以推断TGFβ1确实与OSF的发生密切相关。ET与TGFβ1是调节细胞生长和细胞外基质代谢的两种重要介质,最近的研究发现ET和TGFβ1可相互调节其产生和活性。结合以往的资料和本研究结果,作者认为ET和TGFβ1是复杂的细胞因子网络中的两个重要成员,OSF-KC分泌的ET和TGFβ1水平均显著高于正常,两者呈正相关,证明两者间存在着相互影响,相互协调,最终导致FB增殖,细胞外基质堆积。
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尽管目前还未彻底了解到ET和TGFβ1是如何由KC分泌及它们在OSF发生中的确切作用,但是可以推测外源性刺激物如槟榔及其有效成份可使KC微环境改变,导致其分泌一系列细胞因子,从而参与诱发OSF。因此作者认为可以采用ET和TGFβ1受体拮抗剂和相应的抗体等来拮抗和阻断ET及TGFβ1的致病作用。■
参考文献：
[1]冯云枝,凌天牖.咀嚼槟榔习惯与口腔疾病.国外医学口腔医学分册,1997,24(6):335～337
[2]Ma RH, Tsai CC, Shieh TY. Increased lysyl oxidase activity in fibroblasts cultured from oral submucous fibrosis associated with betel nut chewing in Taiwan. J Oral Pathol Med, 1995,24(9):407～412
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[3]Van Wyk CW, Oliver A, De Miranda, et al. Observation on the effect of areca nut extracts on oral fibroblast proliferation. J Oral Pathol Med, 1994, 23(4):145～148
[4]唐杰清,凌天牖,朱兆通,等.335例口腔粘膜下纤维性变的临床分析.华西口腔医学杂志,1993,11(2):130～132
[5]Yohn JJ, Morelli JG, Walchak SJ, et al. Cultured human keratinocytes synthesize and secrete endothelin-1. J Invest Dermatol, 1993,100(1):23～26
[6]高义军,凌天牖,吴汉江,等.转化生长因子β1在口腔粘膜下纤维性变角朊细胞中的表达.中华口腔医学杂志,1997,32(4):239～241
, 百拇医药
[7]冯云枝,凌天牖.槟榔提取物抑制人类口腔粘膜角朊细胞生长的实验研究.华西口腔医学杂志,1999,17(3):233～235
[8]Levin ER. Endothelins. N Engl J Med, 1995,333(6):356～363
[9]Guarda E, Katwa LC, Myers PR, et al. Effects of endothelins on collagen turnover in cardiac fibroblasts. Cardivovascular Res, 1993, 27(12):2130～2134
收稿日期：1998-09-24
修稿日期：1999-12-30, http://www.100md.com
单位：冯云枝(湖南医科大学附属第二医院口腔科 410011)；凌天牖(湖南医科大学附属第二医院口腔科 410011)
关键词：口腔粘膜下纤维性变；角朊细胞；内皮素；β1转化生长因子
华西口腔医学杂志000106 摘 要：目的:探讨口腔粘膜上皮角朊细胞(KC)和细胞因子在口腔粘膜下纤维性变(OSF)发生中的作用。方法:分别从正常及OSF组织培养出KC(NM-KC和OSF-KC),用放射免疫法和酶联免疫吸附法测定培养细胞上清液中内皮素(ET)和β1转化生长因子(TGFβ1)的水平。结果:OSF-KC分泌ET和TGFβ1水平均高于NM-KC(P<0.05),且两者呈正相关关系。结论:外源性刺激导致的KC活化及其分泌的ET和TGFβ1的改变可能在OSF发生中起重要作用。
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Changes of Cytokines Secreted by Human Oral Mucosa Keratinocytes from Oral Submucous Fibrosis in vitro
Feng Yunzhi Ling Tianyou
(Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University)
Abstract：Objective：To assess the significance of oral mucosa keratinocytes (KCs) and cytokines in the development of oral submucous fibrosis (OSF). Methods: KCs were obtained and cultured from the buccal mucosa of healthy subjects who did not chew areca nut and patients with OSF who chewed areca nut. Then radioimmunoassay and enzyme-linked immunosorbent assays were employed, and endothelin (ET) and transforming growth factor β1(TGFβ1) were quantified in culture supernatants. Results: The mean levels of ET and TGFβ1 secreted by OSF-KC were 96.983±17.802 pg/ml and 4661.641±783.893 pg/ml respectively, which were higher than these secreted by NM-KC (P<0.05); There was a positive correlation between the levels of ET and TGFβ1 secreted by OSF-KC. Conclusion: External stimuli such as areca nut components may induce the development of OSF by activating and stimulating the keratinocytes to secret a series of cytokines, including ET and TGFβ1. It is speculated that ET and TGFβ1 may be the contributing factors in the pathological features noted in OSF.
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Key words：oral submucous fibrosis keratinocytes endothelin transforming growth factor β1▲
口腔粘膜下纤维性变(oral submucous fibrosis,OSF)是一种慢性、隐匿性、具有癌变可能的炎性疾病。尽管研究表明OSF的发生与咀嚼槟榔习惯密切相关[1],但其发病机理仍不明确,多数学者在研究OSF的发病机理时把成纤维细胞(fibroblast,FB)作为主要研究对象。FB位于粘膜下组织中,是合成胶原的主要细胞,无疑在OSF发生中具有重要作用[2，3]。但在咀嚼槟榔过程中,与咀嚼物首先接触的是口腔粘膜上皮,而不是粘膜下组织;而且临床上发现除与咀嚼物密切接触易受摩擦等机械损伤的部位,如颊、舌、牙龈等外,与咀嚼物不密切接触,理化刺激难以直接到达粘膜下组织的部位,如软腭、口底等也可出现纤维病变[4]。近年的研究表明皮肤和粘膜角朊细胞(keratinocyte,KC)能分泌包括内皮素(endothelin,ET)、β1转化生长因子(transforming growth factor β1,TGFβ1)在内的多种细胞因子[5，6],它们与纤维性疾病的发生密切相关。笔者推测:OSF发生中,外源性刺激物除可直接通过被破坏的上皮屏障作用于粘膜下组织外,还可能通过刺激上皮细胞,产生如细胞因子等的间接作用使FB增殖,从而导致胶原堆积。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂及仪器
DMEM培养基、小牛血清(杭州四季青生物制品厂)、分散酶Dispase Ⅱ、胰蛋白酶、兔抗人细胞角蛋白抗体(Zymed公司)、鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(Zymed公司)、内皮素放射免疫检测试剂盒(购自北京东亚免疫技术研究所)TGFβ1 ELISA试剂盒(购自深圳晶美生物工程有限公司,为美国Genzyme公司产品)、24孔培养板(Nunclon公司)、γ计数器(中国科学技术大学开发研究院)。
1.2 方法
1.2.1 KC的培养与鉴定 标本来源及KC的培养、鉴定方法见参考文献[7]。
1.2.2 ET的测定 将KC细胞以2×105/ml的密度接种于24孔板,待细胞达70%～80%融合时,换用新鲜培养基。培养48 h,收集培养细胞上清液,-70℃保存,用于检测ET和TGFβ1。采用ET放射免疫药盒,使用GC-911放射免疫伽马计数器,严格按药盒要求的操作方法检测标本中的ET值。每1组均设3个平行孔。
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1.2.3 TGFβ1的测定 由于细胞分泌的TGFβ1一般为非活化型,需进行激活后再检测,取200 μl稀释液加入到200 μl细胞上清液标本中,再加入1 mol/L HCl2 20 μl 2～8℃放置1 h,使TGFβ1激活,然后加入1 mol/L NaOH 15 μl进行中和。采用市售TGFβ1 ELISA试剂盒检测样品中TGFβ1含量。在450 nm处读数,记录OD值,绘制标准曲线,以样本的OD值推算TGFβ1浓度。
1.2.4 统计学方法 应用SPSS软件进行数据分析,均数比较采用方差分析,OSF-KC分泌ET和TGFβ1的关系采用直线相关分析,检验标准α=0.05。
2 结 果
KC分泌的ET及TGFβ1水平：由表1可见,口腔粘膜KC能分泌一定基础水平的ET和TGFβ1,而且OSF-KC分泌的ET及TGFβ1水平均高于NM-KC的分泌量(P<0.05),经直线相关分析发现OSF-KC分泌的ET和TGFβ1之间呈正相关(r=0.968,P<0.05)。
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表1 口腔粘膜KC分泌的ET和TGFβ1水平(
±s) 组别ET(pg/ml)
TGFβ1(pg/ml)
NM-KC
14.641±15.796
2505.025±1486.676
OSF-KC
96.983±17.802*
4661.642±783.893*
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* OSF-KC与NM-KC比较P<0.05
3 讨 论
口腔粘膜上皮细胞多为KC,近年的研究表明KC不但能产生许多大分子量分子(如细胞角蛋白及粘多糖)保持口腔粘膜生化及物理的完整性;而且可分泌一系列具有免疫、炎性、增殖性特点的细胞因子[5，6]。KC可作为“信号传感器”,外源性刺激可使之产生细胞因子、粘附分子及趋化因子等,进而导致炎症反应。但是KC及其分泌的细胞因子是否参与了OSF的发病过程,目前国内外报道较少,本研究结果显示OSF-KC分泌的ET和TGFβ1水平明显高于NM-KC,且两者呈正相关,说明KC及其分泌的ET和TGFβ1可能在OSF发生中起重要作用。
ET是一类由21个氨基酸组成的血管活性肽,有3种异构体。ET被认为是一种内源性损伤因子[8],它不仅具有血管收缩功能,而且具有丝裂原作用。ET可以通过刺激FB增殖,促进其胶原合成、抑制胶原降解以及使FB向肌纤维母细胞转换等作用而引起组织纤维化[9],与动脉粥样硬化、肺纤维化、肝纤维化、肾小球硬化、硬皮病等纤维性疾病的发生密切相关[8]。TGFβ1是一类具有多种生物学活性的细胞因子,与一些纤维性疾病的发生、发展密切相关。高义军等[6]研究发现OSF组织KC内TGFβ1 mRNA呈阳性表达,结合本研究结果可以推断TGFβ1确实与OSF的发生密切相关。ET与TGFβ1是调节细胞生长和细胞外基质代谢的两种重要介质,最近的研究发现ET和TGFβ1可相互调节其产生和活性。结合以往的资料和本研究结果,作者认为ET和TGFβ1是复杂的细胞因子网络中的两个重要成员,OSF-KC分泌的ET和TGFβ1水平均显著高于正常,两者呈正相关,证明两者间存在着相互影响,相互协调,最终导致FB增殖,细胞外基质堆积。
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尽管目前还未彻底了解到ET和TGFβ1是如何由KC分泌及它们在OSF发生中的确切作用,但是可以推测外源性刺激物如槟榔及其有效成份可使KC微环境改变,导致其分泌一系列细胞因子,从而参与诱发OSF。因此作者认为可以采用ET和TGFβ1受体拮抗剂和相应的抗体等来拮抗和阻断ET及TGFβ1的致病作用。■
参考文献：
[1]冯云枝,凌天牖.咀嚼槟榔习惯与口腔疾病.国外医学口腔医学分册,1997,24(6):335～337
[2]Ma RH, Tsai CC, Shieh TY. Increased lysyl oxidase activity in fibroblasts cultured from oral submucous fibrosis associated with betel nut chewing in Taiwan. J Oral Pathol Med, 1995,24(9):407～412
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[3]Van Wyk CW, Oliver A, De Miranda, et al. Observation on the effect of areca nut extracts on oral fibroblast proliferation. J Oral Pathol Med, 1994, 23(4):145～148
[4]唐杰清,凌天牖,朱兆通,等.335例口腔粘膜下纤维性变的临床分析.华西口腔医学杂志,1993,11(2):130～132
[5]Yohn JJ, Morelli JG, Walchak SJ, et al. Cultured human keratinocytes synthesize and secrete endothelin-1. J Invest Dermatol, 1993,100(1):23～26
[6]高义军,凌天牖,吴汉江,等.转化生长因子β1在口腔粘膜下纤维性变角朊细胞中的表达.中华口腔医学杂志,1997,32(4):239～241
, 百拇医药
[7]冯云枝,凌天牖.槟榔提取物抑制人类口腔粘膜角朊细胞生长的实验研究.华西口腔医学杂志,1999,17(3):233～235
[8]Levin ER. Endothelins. N Engl J Med, 1995,333(6):356～363
[9]Guarda E, Katwa LC, Myers PR, et al. Effects of endothelins on collagen turnover in cardiac fibroblasts. Cardivovascular Res, 1993, 27(12):2130～2134
收稿日期：1998-09-24
修稿日期：1999-12-30, http://www.100md.com