视网膜血管内皮细胞的体外培养
作者：钱勇 高健生 张励
单位：中国中医研究院眼科医院(北京100040)
关键词：视网膜内皮细胞培养
中国中医眼科杂志990336 摘要 综述了视网膜微血管内皮细胞的体外培养过程和影响因素，对明确某些视网膜病的发病原因、预防和治疗具有重要意义。
The culture of retinal microvessels endothelial cells in vitro
Qian Yong, Gao Jiansheng，Zhang Li.
Eye Hospital, China Academy of Trad itional Chinese Medicine, Beijing 100040, China
, 百拇医药
Abstract The literature on the processes and influence fa ctors of retinal microvessles endothelial cells cultured in vitro, It is importa nt for us to clarify the etiology, prevention and treatment of some retinal dise ases.
Key words retina endothelial cell culture
视网膜病是一类导致失明的严重眼病，由于其发生、发展机制复杂，目前治疗方法有限而且疗效不佳，因此视网膜病成为困扰眼科界的一大难题。近年来生物医学的飞速发展，尤其是细胞生物学和分子生物学的发展，推动了对视网膜病的更深一步的认识。其中体外培养视网膜内皮细胞的成功和广泛应用对视网膜新生血管发生的机理有了重新认识，如通过对体外培养视网膜内皮细胞各种实验，发现许多肽类和非肽类生长因子和新生血管形成密不可分，并试图利用抑制生长因子产生或表达的药物来治疗视网膜新生血管〔1,2〕。同时由于视网膜血管内皮细胞体外培养的影响因素很多，仍在不断改进其体外培养方法，就近年来国外有关体外培养的过程和影响因素作初步简述。
, 百拇医药
1 视网膜和视网膜微血管的分离
视网膜一般来源于牛眼〔3,4〕、人眼〔5,6〕，牛眼来源广泛、便宜，眼球大，容易分离出含视网膜血管的纤维层，因此成为最多选用的材料。人眼来源于自愿捐献的健康人群，没有年龄限制。一般在48h内分离出离体眼球视网膜，分离后的视网膜经缓冲液漂洗后在均浆器中制成视网膜均浆，以备过滤用。
过滤的目的是分离视网膜微血管，为得到纯化的视网膜血管内皮细胞做准备。目前较多采用两次尼龙筛过滤，尼龙筛孔径分别为53μm和88μmMeezan等发现孔径220μm尼龙筛过滤后视网膜大的血管网都能保留，而选用孔径86μm尼龙筛过滤仅保留小的血管网〔3,7〕。视网膜血管内皮细胞体外培养为避免其他细胞的污染应尽量仅保留小的血管网。
2 细胞的分离
, http://www.100md.com 目前多种消化酶用于消化过滤后的视网膜均浆，以达到初步分离细胞的目的，其中有胶原酶和胰蛋白酶。一般在原代培养中使用胶原酶，Ⅰ、Ⅱ型均可〔8〕。胶原酶消化后得到的细胞数较多，但会混杂周细胞、平滑肌细胞等，而胰蛋白酶对细胞有毒性作用不利于细胞的培养，因此不适合原代培养时用来消化视网膜均浆〔9〕。在视网膜内皮细胞原代培养中使用胶原酶消化所需的时间和深度由于步骤、材料不同而不等〔10,11〕。在传代培养中普遍采用胰蛋白酶是因为原代培养中内皮细胞的生长呈菌落样相互融合的细胞群，胰蛋白酶消化后会形成单个细胞以便进一步传代培养，同时胰蛋白酶还能降低非内皮细胞的贴壁能力〔9〕。
仅有消化酶的作用是不能得到纯化程度很高的视网膜血管内皮细胞，为进一步纯化视网膜内皮细胞，可采用不同的方法〔12～14〕，但最成功的方法是使用密度梯度沉降法〔12〕和荧光素活化的细胞拣出计〔15〕。密度梯度沉降法常用的介质是Percoll，经分离后可以得到纯化程度很高的内皮细胞〔12，15〕。使用荧光素活化的细胞拣出计是通过荧光标记乙酰化低密度脂蛋白(AC-LDL)的作用，利用AC-LDL进入内皮细胞可以被溶酶体降解，并积累在溶酶体膜上，且内皮细胞降解AC-LDL以一个相当高的速度，与其他细胞如平滑肌细胞之间有显著差别的原理，来达到分离细胞的目的〔16〕。荧光标记是用加入1-二甲基氨基-5-磺酰氯荧光素标记的方法。这种分离细胞的方法对细胞培养没有任何影响，并且具有3个优点：首先在标记时只有内皮细胞被完全标记，而且有很好的再现性；其次在标记过程中不需要细胞被固定；最后在纯化培养时，即使经胰蛋白酶消化染色也不消退〔15〕。只是这种仪器(如流式细胞计)十分昂贵，不如密度梯度沉降法简便。
, 百拇医药
3 细胞的培养
细胞培养分原代和传代培养，细胞培养营养液较常用的有M199、DMEM〔12，13〕等，其中以DMEM最为常用。同时加入一定量的抗生素和抗霉素以预防污染。Mourad等发现BSSPlus溶液和HLR溶液比BSS溶液更有利于保持培养内皮细胞的存活力。培养细胞经4h悬溶后，在BSS溶液中细胞死亡率为8.7%h-1，BSSPlus溶液中细胞死亡率为3.3%h-1，HLR溶液细胞死亡率为8.4%h-1，乳酸盐和糖一样适合保持培养内皮细胞的存活力〔17〕。
细胞培养在原代、传代时营养液一般都需要添加血清，较常用的血清有胎牛血清、新生牛血清、人血清等〔10，17，18〕，Gajdusck等认为营养液须加入一定浓度血清的原因是血液凝固过程中血小板聚集时所释放的各种生长因子有刺激内皮细胞生长的作用，尤其是血小板能够释放一种血小板衍生的生长因子(PDGF)〔19〕。有研究表明在含肝素的人血清有利于内皮细胞的生长，因为它可以抑制Ⅷ因子免疫反应细胞的生长〔20〕。
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不同的培养基成发对内皮细胞的生长也有影响〔21、22〕，Capetands等认为内皮细胞最合适的营养基是纤维连接蛋白或透明质酸包埋的培养容器、培养液为DMEM中加入20%的人血清和一定浓度的肝素，在这种培养基下原代培养可得到较纯的内皮细胞并且能在传代培养中保持长时间稳定的形态结构，而周细胞在原代培养中最合适的培养基是明胶包埋的培养容器，培养液为DMEM加入20%胎牛血清〔23〕。Grant等发现纤维连接蛋白碎片有调节培养内皮细胞的增殖和分裂的作用〔24〕。
在培养内皮细胞时如果有周细胞等其他细胞的夹杂，会对内皮细胞的代谢、增殖和其他特性有影响。Orlidge等研究表明，在培养液中血管周细胞或平滑肌细胞能抑制内皮细胞的增殖，甚至当周细胞或平滑肌细胞与内皮细胞比例降低到1：10时也能产生抑制作用，这可能是因为周细胞或平滑肌细胞释放TGF-β，并与内皮细胞接触有关〔25，26〕。
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此外培养箱的环境也能影响细胞的增殖，Yanqin等发现传代培养时缺氧环境能刺激培养内皮细胞的增殖并发生形态改变，细胞数在缺氧环境中第1、4、5天超过在正常环境中的细胞数(缺氧环境为2%O2，5%CO2，93%N2；正常环境为95%空气，5%O2)，细胞数平均增加121%～181%。3H掺入后通过自显影法表明在缺氧环境中细胞数有112%～118%的增多，只是在缺氧环境中内皮细胞较小，显梭形，而在正常环境中细胞较大、显多角多边形〔27〕。还有研究表明，在传代培养8～12天后缺氧环境中细胞的增殖才和正常环境中内皮细胞的增殖没有差别〔28〕。这种缺氧导致细胞形态变化的机制目前尚不清楚，可能是一些细胞支架如酸、微管等组织的重新分布，这些改变都可能导致细胞增殖能力的改变〔27〕；缺氧同时还可以导致内皮细胞产生一些糖蛋白产物，导致内皮细胞糖被膜的破坏，从而改变细胞的渗透性〔29，30〕。
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4 细胞的鉴定
通常有两种方法，第一种是由Gimbrone等提出，他认为内皮细胞有两大特点：内皮细胞有W-P小体和第Ⅷ因子相关抗体(FⅧr-Ag)存在〔31〕。W-P小体仅见于内皮细胞，被认为是鉴定内皮细胞的最好形态学指标。FⅧr-Ag除见于内皮细胞外，还见于巨核细胞和血小板内，也被认为是鉴定的可靠指标。Vanger和Jaffe等还发现FⅧr-Ag是由内皮细胞合成并存储在胞质内的W-P小体中〔32，33〕，此鉴定多采用间接免疫荧光法。第二种方法是乙酰化低密度脂蛋白(AC-LHL)受体的检测〔34〕，多采用直接掺入法。当培养细胞中加入1-二甲基氨基-5-磺酰氯荧光素标记LDL时，如果细胞的胞核周围胞质呈强黄色荧光，表明存在LDL。
参考文献
1 Schultz G S, Grant M B. Neovascular growth factor. Eye, 1991,5:170～ 180
, http://www.100md.com
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16 Stein O, Stein Y. Bovine aortic endothelial calls display macrophage -like properties towards acctylated 〔125 I〕-labellad low density lipopro toin. Biochem Biophy Acto, 1980,620(8)：631～635
17 Mourad K M, Edelhauser H F. Effect of introcular irrigating solution s on the viability of cultured retinal vascular endothelial cells. Curr Eye Res , 1997, 16(3):239～243
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20 Gajdusek C.An endothelial cell-derived growth factor. J Cell Biol, 1 980,85(5):467～470
21 Throntor S C. Using of heparin in cloning and long-term seried culti vation seience, 1983, 222(7):623～630
22 Kleinman H K, lunchenbill-Edds L. Use of extraculluar matrix compeno nents for cell culture. Anal Biochem, 1987, 166(1):1
, 百拇医药
23 Gerritsen M E, Carley U V. Isolation. Idenlification and cultivatio n of microvascular endothelial cells. Adv Cell Culture, 1987, 6(1):36～40
24 Grant M B, Caballero S, Spoerri P E. Fibroneectin fragments modulate human retinal capillary cell proliferation and migration. Diabetes, 1998, 47(8 ):1335～1340
25 Capetandes A, Gerritsen M E. Simplified methods for consistent and selective culture of bovine retinal endothelial cell and pericytes. Invest Ophth almol Vis Sei, 1990,31(9):1738～1744
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26 Orlidge A, D'Amone P A. Inhibiton of capillary endothelial cell grow th by peritytes and smooth muscle cell. J Cell Biol, 1981, 108(8):1455
27 Antorellir O A, Saunders K B. An activated form of transformin g growth factor beta produced by cocultures of endothelial cells and pericytes. Proc Nat Acad Soel USA, 1989, 26:4544
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33 Jaffe E A, Hoyer L M, Nachman R L. Synthesis of antiemophilic fact or antigen by cultural human endothelial cells. J Clin Invest, 1973,52(2):757
34 Wanger D D, Marder V J. Biosynthesis of von willebranb protein by hu man endothelial cell: processing steps and their interacelluar localization. J Cell Biol, 1984, 99(6):2123
收稿：1999-01-24；修回：1999-06-14, 百拇医药
单位：中国中医研究院眼科医院(北京100040)
关键词：视网膜内皮细胞培养
中国中医眼科杂志990336 摘要 综述了视网膜微血管内皮细胞的体外培养过程和影响因素，对明确某些视网膜病的发病原因、预防和治疗具有重要意义。
The culture of retinal microvessels endothelial cells in vitro
Qian Yong, Gao Jiansheng，Zhang Li.
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Abstract The literature on the processes and influence fa ctors of retinal microvessles endothelial cells cultured in vitro, It is importa nt for us to clarify the etiology, prevention and treatment of some retinal dise ases.
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1 视网膜和视网膜微血管的分离
视网膜一般来源于牛眼〔3,4〕、人眼〔5,6〕，牛眼来源广泛、便宜，眼球大，容易分离出含视网膜血管的纤维层，因此成为最多选用的材料。人眼来源于自愿捐献的健康人群，没有年龄限制。一般在48h内分离出离体眼球视网膜，分离后的视网膜经缓冲液漂洗后在均浆器中制成视网膜均浆，以备过滤用。
过滤的目的是分离视网膜微血管，为得到纯化的视网膜血管内皮细胞做准备。目前较多采用两次尼龙筛过滤，尼龙筛孔径分别为53μm和88μmMeezan等发现孔径220μm尼龙筛过滤后视网膜大的血管网都能保留，而选用孔径86μm尼龙筛过滤仅保留小的血管网〔3,7〕。视网膜血管内皮细胞体外培养为避免其他细胞的污染应尽量仅保留小的血管网。
2 细胞的分离
, http://www.100md.com 目前多种消化酶用于消化过滤后的视网膜均浆，以达到初步分离细胞的目的，其中有胶原酶和胰蛋白酶。一般在原代培养中使用胶原酶，Ⅰ、Ⅱ型均可〔8〕。胶原酶消化后得到的细胞数较多，但会混杂周细胞、平滑肌细胞等，而胰蛋白酶对细胞有毒性作用不利于细胞的培养，因此不适合原代培养时用来消化视网膜均浆〔9〕。在视网膜内皮细胞原代培养中使用胶原酶消化所需的时间和深度由于步骤、材料不同而不等〔10,11〕。在传代培养中普遍采用胰蛋白酶是因为原代培养中内皮细胞的生长呈菌落样相互融合的细胞群，胰蛋白酶消化后会形成单个细胞以便进一步传代培养，同时胰蛋白酶还能降低非内皮细胞的贴壁能力〔9〕。
仅有消化酶的作用是不能得到纯化程度很高的视网膜血管内皮细胞，为进一步纯化视网膜内皮细胞，可采用不同的方法〔12～14〕，但最成功的方法是使用密度梯度沉降法〔12〕和荧光素活化的细胞拣出计〔15〕。密度梯度沉降法常用的介质是Percoll，经分离后可以得到纯化程度很高的内皮细胞〔12，15〕。使用荧光素活化的细胞拣出计是通过荧光标记乙酰化低密度脂蛋白(AC-LDL)的作用，利用AC-LDL进入内皮细胞可以被溶酶体降解，并积累在溶酶体膜上，且内皮细胞降解AC-LDL以一个相当高的速度，与其他细胞如平滑肌细胞之间有显著差别的原理，来达到分离细胞的目的〔16〕。荧光标记是用加入1-二甲基氨基-5-磺酰氯荧光素标记的方法。这种分离细胞的方法对细胞培养没有任何影响，并且具有3个优点：首先在标记时只有内皮细胞被完全标记，而且有很好的再现性；其次在标记过程中不需要细胞被固定；最后在纯化培养时，即使经胰蛋白酶消化染色也不消退〔15〕。只是这种仪器(如流式细胞计)十分昂贵，不如密度梯度沉降法简便。
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3 细胞的培养
细胞培养分原代和传代培养，细胞培养营养液较常用的有M199、DMEM〔12，13〕等，其中以DMEM最为常用。同时加入一定量的抗生素和抗霉素以预防污染。Mourad等发现BSSPlus溶液和HLR溶液比BSS溶液更有利于保持培养内皮细胞的存活力。培养细胞经4h悬溶后，在BSS溶液中细胞死亡率为8.7%h-1，BSSPlus溶液中细胞死亡率为3.3%h-1，HLR溶液细胞死亡率为8.4%h-1，乳酸盐和糖一样适合保持培养内皮细胞的存活力〔17〕。
细胞培养在原代、传代时营养液一般都需要添加血清，较常用的血清有胎牛血清、新生牛血清、人血清等〔10，17，18〕，Gajdusck等认为营养液须加入一定浓度血清的原因是血液凝固过程中血小板聚集时所释放的各种生长因子有刺激内皮细胞生长的作用，尤其是血小板能够释放一种血小板衍生的生长因子(PDGF)〔19〕。有研究表明在含肝素的人血清有利于内皮细胞的生长，因为它可以抑制Ⅷ因子免疫反应细胞的生长〔20〕。
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不同的培养基成发对内皮细胞的生长也有影响〔21、22〕，Capetands等认为内皮细胞最合适的营养基是纤维连接蛋白或透明质酸包埋的培养容器、培养液为DMEM中加入20%的人血清和一定浓度的肝素，在这种培养基下原代培养可得到较纯的内皮细胞并且能在传代培养中保持长时间稳定的形态结构，而周细胞在原代培养中最合适的培养基是明胶包埋的培养容器，培养液为DMEM加入20%胎牛血清〔23〕。Grant等发现纤维连接蛋白碎片有调节培养内皮细胞的增殖和分裂的作用〔24〕。
在培养内皮细胞时如果有周细胞等其他细胞的夹杂，会对内皮细胞的代谢、增殖和其他特性有影响。Orlidge等研究表明，在培养液中血管周细胞或平滑肌细胞能抑制内皮细胞的增殖，甚至当周细胞或平滑肌细胞与内皮细胞比例降低到1：10时也能产生抑制作用，这可能是因为周细胞或平滑肌细胞释放TGF-β，并与内皮细胞接触有关〔25，26〕。
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此外培养箱的环境也能影响细胞的增殖，Yanqin等发现传代培养时缺氧环境能刺激培养内皮细胞的增殖并发生形态改变，细胞数在缺氧环境中第1、4、5天超过在正常环境中的细胞数(缺氧环境为2%O2，5%CO2，93%N2；正常环境为95%空气，5%O2)，细胞数平均增加121%～181%。3H掺入后通过自显影法表明在缺氧环境中细胞数有112%～118%的增多，只是在缺氧环境中内皮细胞较小，显梭形，而在正常环境中细胞较大、显多角多边形〔27〕。还有研究表明，在传代培养8～12天后缺氧环境中细胞的增殖才和正常环境中内皮细胞的增殖没有差别〔28〕。这种缺氧导致细胞形态变化的机制目前尚不清楚，可能是一些细胞支架如酸、微管等组织的重新分布，这些改变都可能导致细胞增殖能力的改变〔27〕；缺氧同时还可以导致内皮细胞产生一些糖蛋白产物，导致内皮细胞糖被膜的破坏，从而改变细胞的渗透性〔29，30〕。
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4 细胞的鉴定
通常有两种方法，第一种是由Gimbrone等提出，他认为内皮细胞有两大特点：内皮细胞有W-P小体和第Ⅷ因子相关抗体(FⅧr-Ag)存在〔31〕。W-P小体仅见于内皮细胞，被认为是鉴定内皮细胞的最好形态学指标。FⅧr-Ag除见于内皮细胞外，还见于巨核细胞和血小板内，也被认为是鉴定的可靠指标。Vanger和Jaffe等还发现FⅧr-Ag是由内皮细胞合成并存储在胞质内的W-P小体中〔32，33〕，此鉴定多采用间接免疫荧光法。第二种方法是乙酰化低密度脂蛋白(AC-LHL)受体的检测〔34〕，多采用直接掺入法。当培养细胞中加入1-二甲基氨基-5-磺酰氯荧光素标记LDL时，如果细胞的胞核周围胞质呈强黄色荧光，表明存在LDL。
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14 Schor A M, Schor S L. The isolation and culture of endthelial cells and pericytes from the bovine retinal microvasulature:A comparation study with l arge vascular cells. Micro Res, 1986,32(1):31
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收稿：1999-01-24；修回：1999-06-14, 百拇医药