干扰素抑制晶体上皮细胞生长的实验研究
作者：胡楠 邱孝芝 龚启荣 管怀进
单位：226001 江苏南通医学院附属医院眼科(胡楠、龚启荣、管怀进)；上海医科大学附属眼耳鼻喉科医院眼科(邱孝芝)
关键词：干扰素类Ⅰ型；干扰素类Ⅱ型；晶体；上皮细胞
中华眼科杂志990208 【摘要】 目的 研究α-干扰素(α-interferon，α-IFN)和γ-干扰素(γ-IFN)对体外培养的兔晶体上皮细胞生长的抑制作用及有效药物浓度。方法 取第2、3代传代培养的晶体上皮细胞做药物抑制试验。在培养皿中加入不同浓度的α-IFN和γ-IFN药物作用24小时和72小时后，用细胞计数法和MTT比色测定法确定药物对兔晶体上皮细胞增殖的抑制作用。结果 α-IFN和γ-IFN在103～104 IU/ml浓度能抑制兔晶体上皮细胞的生长，γ-IFN的抑制作用略强于α-IFN。结论 该结果可为临床筛选防治后发性白内障的药物提供依据。
, 百拇医药
An experimental investigation of inhibition of interferon on lens epithelial cell growth in vitro HU Nan, QIU Xiaozhi, GONG Qirong, et al. Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital of Nantong Medical College, Nantong 226001
【Abstract】 Objective To investigate the inhibition of α-interferon (α-IFN) and γ-interferon (γ-IFN) on rabbit lens epithelial cell (RLEC) proliferation in vitro and their effective concentrations. Methods The second and third passage of RLEC were used for assay. Various concentrations of α-IFN or γ-IFN were added into the culture medium and RLECs were exposed to these drugs. After 24 and 72 hours, the inhibition of RLECs was determined by counting the RLEC numbers on a counting plate and MTT colorimetric assay. Results α-IFN and γ-IFN may reduce the proliferation of RLECs at the concentration of 103～104 IU/ml. The inhibition of γ-IFN was a little stronger than that of α-IFN. Conclusion The experiment provides a scientific basis for selection of drugs to prevent after cataract.
, 百拇医药
【Key words】 Interferon type Ⅰ Interferon type Ⅱ Lens Epithalial cells
现代白内障囊外摘除术后，后囊混浊是影响术后视功能恢复的主要障碍之一。后囊混浊是因术中残留的晶体上皮细胞增殖和变性纤维化所致[1]，尽管混浊的后囊膜可以通过再次手术或激光的方法去除，但这会破坏晶体后囊的屏障作用，增加视网膜脱离、黄斑囊样水肿等并发症的发生率。如能用药物抑制晶体上皮细胞的增殖，则能预防后囊混浊的发生。干扰素(interferon，IFN)，是病毒侵入机体后诱导产生的一种低分子糖蛋白，除具有抗病毒繁殖作用以外，还能抑制纤维化反应的多个环节。我们在体外培养的兔晶体上皮细胞中加入α-干扰素(α-IFN)和γ-干扰素(γ-IFN)，观察它们对晶体上皮细胞增殖的作用，以了解干扰素对预防后囊混浊的意义。
材料和方法
一、细胞培养
, 百拇医药
取成年家兔晶体前囊膜，用含15%胎牛血清的1640培养液(美国Sigma公司)进行植块培养和传代。
二、药物抑制试验
1.细胞计数法：取第2或第3代晶体上皮细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，按5×105个/ml的浓度将晶体上皮细胞接种到24孔培养板上，加入培养液后置入培养箱中。24小时后细胞贴壁，分别加入用培养液稀释的α-IFN(卫生部成都生物制品研究所)，γ-IFN(上海克隆生物高技术有限公司)。α-IFN和γ-IFN的浓度分别为10 IU/ml、102 IU/ml、103 IU/ml、104 IU/ml，每个药物剂量设置3孔，同时设置对照组。加药后继续培养，作用24小时和72小时后分别取出，用胰酶消化，制成细胞悬液，细胞计数板上计数，计算各孔的细胞数，取各组的平均值。
2.MTT测定法[2]：取第2、3代晶体上皮细胞，消化后按1×105个/ml浓度接种于96孔培养板，每孔注入100 μl，培养24小时后取出加药。药物及浓度与细胞计数法相同，但每个药物浓度设置6孔。加药作用后3天，每孔加入MTT 10 μl，37℃培养箱中培养4小时，然后加0.04 mol/L盐酸异丙醇100 μl/孔，室温下静置数分钟后进行比色测定，测定仪为DG 3022 A型酶联免疫检测仪，波长为570 nm。
, 百拇医药
三、统计学方法
采用t检验。
结果
一、细胞计数法
药物作用24小时和72小时后进行细胞计数，然后行t检验，结果见表1。
表1 α-IFN、γ-IFN对兔晶体上皮细胞增殖的作用 组别
24小时
72小时
细胞数(×105个)
抑制率(%)
t值
, 百拇医药
P值
细胞数(×105个)
抑制率(%)
t值
P值
对照组
18.166±4.390
28.333±6.411
α-IFN组
10 IU/ml
17.080±3.818
6.00
, 百拇医药
0.325
>0.05
21.667±5.916
23.53
1.322
>0.05
102 IU/ml
16.250±3.748
10.55
0.577
>0.05
18.750±5.000
, 百拇医药
33.82
2.041
>0.05
103 IU/ml
13.750±3.301
24.31
2.041
>0.05
15.462±2.881
45.43
3.183
<0.05
, 百拇医药
104 IU/ml
9.583±1.787
47.25
3.173
<0.05
11.667±2.598
58.82
4.175
<0.05
γ-IFN组
10 IU/ml
16.667±4.387
, 百拇医药
8.25
0.419
>0.05
20.413±2.679
27.95
1.975
>0.05
102 IU/ml
15.000±3.750
17.43
0.951
>0.05
, http://www.100md.com
16.671±4.389
41.16
2.599
>0.05
103 IU/ml
10.833±3.146
40.37
2.354
>0.05
14.167±2.887
50.00
3.489
, 百拇医药
<0.05
104 IU/ml
7.500±3.758
58.71
3.201
<0.05
10.000±1.250
64.71
4.862
<0.01
二、MTT测定法
测定吸光度(A)值后，进行t检验，结果见表2。
, 百拇医药
表2 MTT法测定α-IFN、γ-IFN对兔晶体上皮细胞的作用 组别
吸光度(A)值
t值
P值
对照组
0.293±0.070
α-IFN组
10 IU/ml
0.283±0.031
0.309
>0.05
102 IU/ml
, 百拇医药
0.253±0.065
1.028
>0.05
103 IU/ml
0.214±0.055
2.176
>0.05
104 IU/ml
0.192±0.035
3.156
<0.05
γ-IFN组
, http://www.100md.com
10 IU/ml
0.261±0.048
0.922
>0.05
102 IU/ml
0.240±0.060
1.409
>0.05
103 IU/ml
0.196±0.037
3.001
, 百拇医药 <0.05
104 IU/ml
0.162±0.043
3.910
<0.01
讨论
白内障囊外摘除术后，残留的前囊膜下及赤道部晶体上皮细胞因失去了“接触抑制”，转化为纤维细胞，大量增殖并向后囊迁徙，形成后发性白内障。目前清除和抑制晶体上皮细胞的方法主要有：(1)术中连续环形撕囊、水力分离及使用特殊设计的人工晶体。(2)采用超声波、冷冻、激光、β射线、生物粘胶等方法，减少和破坏晶体上皮细胞[3]。但这些机械、物理的刺激并发症多、效果差，难以推广。(3)利用药物和免疫方法抑制晶体上皮细胞的增殖和纤维化反应。在这一方法中，研究较多的是抗代谢类药物。体外培养证明，柔红霉素(daunomycin)、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)、高三尖杉酯碱(homeharringtonine)及秋水仙素(colchicine)等[4]均能有效抑制晶体上皮细胞的增殖和迁徙，但大多数抗代谢药物无细胞特异性，它们对眼内其他组织的毒副作用限制了其应用。
, 百拇医药
干扰素是一组免疫应答过程中自然形成的多肽，α-IFN由白细胞尤其是单核细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞分泌，γ-IFN则由T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生。最初人们仅发现它有干扰病毒复制、抑制病毒繁殖的作用，故一直用于病毒性疾病的治疗。此后，其抑制细胞分泌、免疫调节、抗肿瘤及抗纤维化等一系列生物活性逐渐得到证实。有人报道，干扰素能抑制纤维细胞的分化、增殖及胶原产生[5]。α-IFN可抑制成纤维细胞产生葡萄糖胺聚糖而增加胶原酶的生成。在小鼠腹腔内植入异物，在有γ-IFN存在的情况下包膜形成减少。在眼科学方面，Latina等[6]研究γ-IFN对体外培养的人Tenon囊纤维细胞生长、胶原合成及创口愈合的作用，发现其抑制创口愈合的作用与γ-IFN浓度成正比，在103 IU/ml时可抑制57%的胶原合成。迟惠等[7]也报道干扰素对青光眼术后滤过泡的纤维化有抑制作用，可明显改善滤过功能。此外，α-IFN玻璃体内注射能防治增殖性玻璃体视网膜病变。本实验应用直接细胞计数法及MTT法检测α-IFN及γ-IFN对兔晶体上皮细胞增殖的作用，结果表明二者均有抑制晶体上皮细胞增殖的作用，且其抑制作用随药物浓度的升高而增大。MTT法是一种快速、简便的测定方法，其作用原理是哺乳类动物活细胞线粒体内膜中的呼吸链上与呼吸链有关的酶，可将MTT降解成紫蓝色的甲赞结晶，结晶量与活细胞的数目成正比。加入盐酸异丙醇终止反应，通过比色测定即可推算出活细胞数目的多少，该方法结果准确、可靠。
, http://www.100md.com
在α、β、γ三种类型干扰素中，γ-IFN最引人注目，有报道表明γ-IFN抑制人纤维细胞胶原合成的作用比α-IFN和β-IFN强[6]，国内亦报道γ-IFN对体外培养的人视网膜色素上皮细胞的抑制作用比α-IFN强。本实验中γ-IFN对晶体上皮细胞的生长抑制优于α-IFN，与文献报道的结果相符。
干扰素抑制细胞增殖及抗纤维化的原理尚未完全明了，一般认为它是通过延缓细胞DNA合成和有丝分裂而实现的，而非细胞毒性作用。其作用主要发生在G0期，但细胞周期的其它阶段亦受干扰素的影响。有人提出干扰素可使细胞对阻碍细胞周期的某些因素更为敏感，能抑制血清或生长因子对细胞的诱导作用。由于干扰素是一种天然产生的蛋白质，故其不像5-Fu等抗代谢类药物一样有较大的毒副作用。Granstein等[8]用创口内注射γ-IFN的方法治疗瘢痕疙瘩时，患者可出现头痛、肌肉酸痛及低热等反应，但无局部毒性作用。玻璃体内一次性注射104 IU的干扰素，对角膜、视网膜等未见明显毒副作用。干扰素的这一特性无疑为其临床应用创造了条件。
, 百拇医药
参考文献
1 Apple DJ, Solomon KD, Tetz MR, et al. Posterior capsule opacification. Surv Ophthalmol, 1992,37：73-116.
2 东京大学医科学研究所制癌研究部.新细胞工学实验.东京：秀润社，1993.321-328.
3 才娜，张劲松，张烽.白内障术后防治晶体后囊混浊方法的研究现状.中国实用眼科杂志，1996，14：454.
4 郭海科，李绍珍，曹心，等.人类晶体上皮细胞培养及其生长抑制的实验研究.中华眼科杂志，1995，31：102-104.
5 Duncan MR, Berman B. Gamma interferon in the lymphokine and beta interferon the monokine responsible for inhibition of fibroblast collagen production and late but not early fibroblast proliferation. J Exp Med, 1985,162：516-527.
, 百拇医药
6 Latina MA, Belmonte SJ, Park C, et al. Gamma-interferon effects on human fibroblasts from Tenon′s capsule. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1991,32：2806-2815.
7 迟惠，费兴波，赖炽香.干扰素对兔眼小梁切除术后滤过泡的影响.中华眼科杂志，1995，31：218-220.
8 Granstein RD, Rook A, Flotte TJ, et al. A controlled trial of intralesional recombinant interferon-gamma in the treatment of keloidal scarring: clinical and histologic findings. Arch Dermatol, 1990,126：1295-1302.
(收稿：1998-09-16 修回：1998-11-30), http://www.100md.com
单位：226001 江苏南通医学院附属医院眼科(胡楠、龚启荣、管怀进)；上海医科大学附属眼耳鼻喉科医院眼科(邱孝芝)
关键词：干扰素类Ⅰ型；干扰素类Ⅱ型；晶体；上皮细胞
中华眼科杂志990208 【摘要】 目的 研究α-干扰素(α-interferon，α-IFN)和γ-干扰素(γ-IFN)对体外培养的兔晶体上皮细胞生长的抑制作用及有效药物浓度。方法 取第2、3代传代培养的晶体上皮细胞做药物抑制试验。在培养皿中加入不同浓度的α-IFN和γ-IFN药物作用24小时和72小时后，用细胞计数法和MTT比色测定法确定药物对兔晶体上皮细胞增殖的抑制作用。结果 α-IFN和γ-IFN在103～104 IU/ml浓度能抑制兔晶体上皮细胞的生长，γ-IFN的抑制作用略强于α-IFN。结论 该结果可为临床筛选防治后发性白内障的药物提供依据。
, 百拇医药
An experimental investigation of inhibition of interferon on lens epithelial cell growth in vitro HU Nan, QIU Xiaozhi, GONG Qirong, et al. Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital of Nantong Medical College, Nantong 226001
【Abstract】 Objective To investigate the inhibition of α-interferon (α-IFN) and γ-interferon (γ-IFN) on rabbit lens epithelial cell (RLEC) proliferation in vitro and their effective concentrations. Methods The second and third passage of RLEC were used for assay. Various concentrations of α-IFN or γ-IFN were added into the culture medium and RLECs were exposed to these drugs. After 24 and 72 hours, the inhibition of RLECs was determined by counting the RLEC numbers on a counting plate and MTT colorimetric assay. Results α-IFN and γ-IFN may reduce the proliferation of RLECs at the concentration of 103～104 IU/ml. The inhibition of γ-IFN was a little stronger than that of α-IFN. Conclusion The experiment provides a scientific basis for selection of drugs to prevent after cataract.
, 百拇医药
【Key words】 Interferon type Ⅰ Interferon type Ⅱ Lens Epithalial cells
现代白内障囊外摘除术后，后囊混浊是影响术后视功能恢复的主要障碍之一。后囊混浊是因术中残留的晶体上皮细胞增殖和变性纤维化所致[1]，尽管混浊的后囊膜可以通过再次手术或激光的方法去除，但这会破坏晶体后囊的屏障作用，增加视网膜脱离、黄斑囊样水肿等并发症的发生率。如能用药物抑制晶体上皮细胞的增殖，则能预防后囊混浊的发生。干扰素(interferon，IFN)，是病毒侵入机体后诱导产生的一种低分子糖蛋白，除具有抗病毒繁殖作用以外，还能抑制纤维化反应的多个环节。我们在体外培养的兔晶体上皮细胞中加入α-干扰素(α-IFN)和γ-干扰素(γ-IFN)，观察它们对晶体上皮细胞增殖的作用，以了解干扰素对预防后囊混浊的意义。
材料和方法
一、细胞培养
, 百拇医药
取成年家兔晶体前囊膜，用含15%胎牛血清的1640培养液(美国Sigma公司)进行植块培养和传代。
二、药物抑制试验
1.细胞计数法：取第2或第3代晶体上皮细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，按5×105个/ml的浓度将晶体上皮细胞接种到24孔培养板上，加入培养液后置入培养箱中。24小时后细胞贴壁，分别加入用培养液稀释的α-IFN(卫生部成都生物制品研究所)，γ-IFN(上海克隆生物高技术有限公司)。α-IFN和γ-IFN的浓度分别为10 IU/ml、102 IU/ml、103 IU/ml、104 IU/ml，每个药物剂量设置3孔，同时设置对照组。加药后继续培养，作用24小时和72小时后分别取出，用胰酶消化，制成细胞悬液，细胞计数板上计数，计算各孔的细胞数，取各组的平均值。
2.MTT测定法[2]：取第2、3代晶体上皮细胞，消化后按1×105个/ml浓度接种于96孔培养板，每孔注入100 μl，培养24小时后取出加药。药物及浓度与细胞计数法相同，但每个药物浓度设置6孔。加药作用后3天，每孔加入MTT 10 μl，37℃培养箱中培养4小时，然后加0.04 mol/L盐酸异丙醇100 μl/孔，室温下静置数分钟后进行比色测定，测定仪为DG 3022 A型酶联免疫检测仪，波长为570 nm。
, 百拇医药
三、统计学方法
采用t检验。
结果
一、细胞计数法
药物作用24小时和72小时后进行细胞计数，然后行t检验，结果见表1。
表1 α-IFN、γ-IFN对兔晶体上皮细胞增殖的作用 组别
24小时
72小时
细胞数(×105个)
抑制率(%)
t值
, 百拇医药
P值
细胞数(×105个)
抑制率(%)
t值
P值
对照组
18.166±4.390
28.333±6.411
α-IFN组
10 IU/ml
17.080±3.818
6.00
, 百拇医药
0.325
>0.05
21.667±5.916
23.53
1.322
>0.05
102 IU/ml
16.250±3.748
10.55
0.577
>0.05
18.750±5.000
, 百拇医药
33.82
2.041
>0.05
103 IU/ml
13.750±3.301
24.31
2.041
>0.05
15.462±2.881
45.43
3.183
<0.05
, 百拇医药
104 IU/ml
9.583±1.787
47.25
3.173
<0.05
11.667±2.598
58.82
4.175
<0.05
γ-IFN组
10 IU/ml
16.667±4.387
, 百拇医药
8.25
0.419
>0.05
20.413±2.679
27.95
1.975
>0.05
102 IU/ml
15.000±3.750
17.43
0.951
>0.05
, http://www.100md.com
16.671±4.389
41.16
2.599
>0.05
103 IU/ml
10.833±3.146
40.37
2.354
>0.05
14.167±2.887
50.00
3.489
, 百拇医药
<0.05
104 IU/ml
7.500±3.758
58.71
3.201
<0.05
10.000±1.250
64.71
4.862
<0.01
二、MTT测定法
测定吸光度(A)值后，进行t检验，结果见表2。
, 百拇医药
表2 MTT法测定α-IFN、γ-IFN对兔晶体上皮细胞的作用 组别
吸光度(A)值
t值
P值
对照组
0.293±0.070
α-IFN组
10 IU/ml
0.283±0.031
0.309
>0.05
102 IU/ml
, 百拇医药
0.253±0.065
1.028
>0.05
103 IU/ml
0.214±0.055
2.176
>0.05
104 IU/ml
0.192±0.035
3.156
<0.05
γ-IFN组
, http://www.100md.com
10 IU/ml
0.261±0.048
0.922
>0.05
102 IU/ml
0.240±0.060
1.409
>0.05
103 IU/ml
0.196±0.037
3.001
, 百拇医药 <0.05
104 IU/ml
0.162±0.043
3.910
<0.01
讨论
白内障囊外摘除术后，残留的前囊膜下及赤道部晶体上皮细胞因失去了“接触抑制”，转化为纤维细胞，大量增殖并向后囊迁徙，形成后发性白内障。目前清除和抑制晶体上皮细胞的方法主要有：(1)术中连续环形撕囊、水力分离及使用特殊设计的人工晶体。(2)采用超声波、冷冻、激光、β射线、生物粘胶等方法，减少和破坏晶体上皮细胞[3]。但这些机械、物理的刺激并发症多、效果差，难以推广。(3)利用药物和免疫方法抑制晶体上皮细胞的增殖和纤维化反应。在这一方法中，研究较多的是抗代谢类药物。体外培养证明，柔红霉素(daunomycin)、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)、高三尖杉酯碱(homeharringtonine)及秋水仙素(colchicine)等[4]均能有效抑制晶体上皮细胞的增殖和迁徙，但大多数抗代谢药物无细胞特异性，它们对眼内其他组织的毒副作用限制了其应用。
, 百拇医药
干扰素是一组免疫应答过程中自然形成的多肽，α-IFN由白细胞尤其是单核细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞分泌，γ-IFN则由T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生。最初人们仅发现它有干扰病毒复制、抑制病毒繁殖的作用，故一直用于病毒性疾病的治疗。此后，其抑制细胞分泌、免疫调节、抗肿瘤及抗纤维化等一系列生物活性逐渐得到证实。有人报道，干扰素能抑制纤维细胞的分化、增殖及胶原产生[5]。α-IFN可抑制成纤维细胞产生葡萄糖胺聚糖而增加胶原酶的生成。在小鼠腹腔内植入异物，在有γ-IFN存在的情况下包膜形成减少。在眼科学方面，Latina等[6]研究γ-IFN对体外培养的人Tenon囊纤维细胞生长、胶原合成及创口愈合的作用，发现其抑制创口愈合的作用与γ-IFN浓度成正比，在103 IU/ml时可抑制57%的胶原合成。迟惠等[7]也报道干扰素对青光眼术后滤过泡的纤维化有抑制作用，可明显改善滤过功能。此外，α-IFN玻璃体内注射能防治增殖性玻璃体视网膜病变。本实验应用直接细胞计数法及MTT法检测α-IFN及γ-IFN对兔晶体上皮细胞增殖的作用，结果表明二者均有抑制晶体上皮细胞增殖的作用，且其抑制作用随药物浓度的升高而增大。MTT法是一种快速、简便的测定方法，其作用原理是哺乳类动物活细胞线粒体内膜中的呼吸链上与呼吸链有关的酶，可将MTT降解成紫蓝色的甲赞结晶，结晶量与活细胞的数目成正比。加入盐酸异丙醇终止反应，通过比色测定即可推算出活细胞数目的多少，该方法结果准确、可靠。
, http://www.100md.com
在α、β、γ三种类型干扰素中，γ-IFN最引人注目，有报道表明γ-IFN抑制人纤维细胞胶原合成的作用比α-IFN和β-IFN强[6]，国内亦报道γ-IFN对体外培养的人视网膜色素上皮细胞的抑制作用比α-IFN强。本实验中γ-IFN对晶体上皮细胞的生长抑制优于α-IFN，与文献报道的结果相符。
干扰素抑制细胞增殖及抗纤维化的原理尚未完全明了，一般认为它是通过延缓细胞DNA合成和有丝分裂而实现的，而非细胞毒性作用。其作用主要发生在G0期，但细胞周期的其它阶段亦受干扰素的影响。有人提出干扰素可使细胞对阻碍细胞周期的某些因素更为敏感，能抑制血清或生长因子对细胞的诱导作用。由于干扰素是一种天然产生的蛋白质，故其不像5-Fu等抗代谢类药物一样有较大的毒副作用。Granstein等[8]用创口内注射γ-IFN的方法治疗瘢痕疙瘩时，患者可出现头痛、肌肉酸痛及低热等反应，但无局部毒性作用。玻璃体内一次性注射104 IU的干扰素，对角膜、视网膜等未见明显毒副作用。干扰素的这一特性无疑为其临床应用创造了条件。
, 百拇医药
参考文献
1 Apple DJ, Solomon KD, Tetz MR, et al. Posterior capsule opacification. Surv Ophthalmol, 1992,37：73-116.
2 东京大学医科学研究所制癌研究部.新细胞工学实验.东京：秀润社，1993.321-328.
3 才娜，张劲松，张烽.白内障术后防治晶体后囊混浊方法的研究现状.中国实用眼科杂志，1996，14：454.
4 郭海科，李绍珍，曹心，等.人类晶体上皮细胞培养及其生长抑制的实验研究.中华眼科杂志，1995，31：102-104.
5 Duncan MR, Berman B. Gamma interferon in the lymphokine and beta interferon the monokine responsible for inhibition of fibroblast collagen production and late but not early fibroblast proliferation. J Exp Med, 1985,162：516-527.
, 百拇医药
6 Latina MA, Belmonte SJ, Park C, et al. Gamma-interferon effects on human fibroblasts from Tenon′s capsule. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1991,32：2806-2815.
7 迟惠，费兴波，赖炽香.干扰素对兔眼小梁切除术后滤过泡的影响.中华眼科杂志，1995，31：218-220.
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(收稿：1998-09-16 修回：1998-11-30), http://www.100md.com