光化学损伤下大鼠视网膜超氧化物歧化酶基因mRNA表达的实验研究
作者：刘瑜玲* 严 密** 刘柏林***
单位：*华西医科大学第一临床医院眼科(现在北京市眼科研究所，100730)；**华西医科大学第一临床医院眼科；***华西医科大学基础医学院分子生物学研究室
关键词：超氧化物歧化酶；基因；眼损伤；分子生物学
眼科980119 摘 要 通过建立大鼠视网膜光化学损伤模型，应用原位杂交技术对正常及光化学损伤大鼠视网膜超氧化物歧化酶基因mRNA表达情况进行动态观察。结果表明，视网膜组织各层均可见超氧化物歧化酶基因mRNA的表达；连续光照可使其表达水平迅速下降。原位杂交技术为研究视网膜基因表达状况的一种良好方法。
分类号 R779.12
The experimental studies of expression of genes in light-damaged rat retinas/Liu Yuling…//Ophthalmol CHN.-1998，7(1).-57-59(Department of Ophthalmology，First Clinical Medical College，West China University of Medical Sciences，Chengdu 610041)
, http://www.100md.com
The changes of expression of SOD mRNA in light-damaged rat and normal rat retinas were studied in the rat model of retinal photic injury with the technique of in situ hybridization.It was demonstrated that the hybridization signals of SOD mRNA were distributed in any layer of the retinas and the expression level of SOD mRNA dramatically decreased with the increase of light exposure time.It is a good way to analyze the expression level of the gene of retinas with the technique of in situ hybridization.
, 百拇医药
Subject terms SOD；Genes；Eye injuries；Molecular biology
有关视网膜光化学损伤的确切致伤机理尚未完全明了，但广泛的研究表明，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)与视网膜光化学损伤的发生发展过程密切相关[1]。本文通过建立大鼠的视网膜光化学损伤模型，应用原位杂交技术对视网膜中SOD基因mRNA表达部位，光化学损伤状况下其表达水平的变化进行了初步的探索性研究。关于光化学损伤状况下，视网膜中SOD基因mRNA表达水平的研究，目前国内外尚未见报道。
1 材料与方法
1.1 主要实验试剂与动物
地高辛随机引物标记和检测试剂盒购自Bochringer Maunheim；焦碳酸二乙酯(DEPC)，多聚甲醛，多聚赖氨酸，去离子甲酰胺，葡聚糖硫酸酯及蛋白酶K，聚蔗糖等均购自Sigma；牛血清白蛋白(BSA)；鲑精DNA，聚乙烯吡咯烷酮，低溶点琼脂糖，核酸分子量标准(100bp DNA ladder)，胰蛋白胨，酵母浸出汁等购自BRL；限制性核酸内切酶，核糖核酸酶A(RNase A)等购自华美公司；其余试剂均为国产分析纯。实验用水均经Millipore纯水装置处理。Wistar大鼠，重150～180g，由华西医科大学实验动物中心提供。
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1.2 质粒
含有人SOD基因的cDNA探针质粒大肠杆菌菌株由华西医科大学基础医学院分子生物学研究室提供。其中插入片段长度为0.65Kb。
1.3 动物模型的建立及实验动物的分组
自制无色透明有机玻璃光照箱的六面均安装有绿色荧光灯(波长480～560nm)，箱内中心各向照度为1000 lux，平均照度1100±106.9 lux。光照箱各面板上钻有99个0.7cm的通气孔。实验大鼠在暗房内适应24小时后，接受连续光照，光照过程不散瞳、不麻醉、不限活动和进食等。
按不同时间点的各项实验需要，将大鼠随机分为6组，每组4只。其中3组为实验组，分别在连续光照1、3、5天后，乙醚麻醉摘取右眼球；其余3组为对照组，正常循环光环境饲养、于同一时间处死取眼球。
, 百拇医药 1.4 超氧化物歧化酶cDNA探针的制备
1.4.1 质粒DNA的制备
采用Sambrook等[2]的碱裂解法提取质粒，RNase-A消化，酚-氯仿法抽提，乙醇沉淀DNA，经电泳鉴定后，260nm紫外分光法定量，-20℃贮存备用。
1.4.2 质粒DNA限制性内切酶消化及片段回收
质粒DNA按常规方法用限制性内切酶PstI消化，1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，低溶点琼脂糖法回收0.65Kb片段。-20℃贮存备用。
1.4.3 探针标记
超氧化物歧化酶cDNA探针片段用随机引物法(按试剂盒说明进行)用DIG-11-dUTP标记，乙醇沉淀，分离标记的cDNA，短暂真空干燥后，溶于适量TE缓冲液，置于-20℃贮存备用。
, 百拇医药
1.5 载玻片及盖玻片的处理
载玻片经洗液处理擦净后，分别用流动自来水及去离子水各冲洗30min，160℃烤箱内烘烤过夜以灭活RNA酶，冷却后，室温下置于500μg聚赖氨酸/ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)中浸泡10min，空气干燥，4℃防尘保存。备用于贴附石蜡切片。盖玻片经洗液处理擦净后，浸于1%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液中片刻进行硅化，取出待干，在180℃烘烤4小时，冷却后防尘保存。
1.6 组织标本的制备
实验组及对照组大鼠均由乙醚麻醉方式处死，立即摘取右眼球，按原位核酸杂交要求，浸泡于含4%多聚甲醛的DEPC-PBS缓冲液中，4℃过夜。沿垂直子午线将眼球剖成两半，置DEPC-PBS缓冲液中清洗过液，经梯度酒精脱水，石蜡包埋，在无RNase条件下，切5μm厚的切片，固定于聚赖氨酸浸泡过的玻片上，置于-20℃防尘保存，备用于原位核酸杂交。
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1.7 原位杂交方法
基本采用Toyoko等的方法[3]，并参照Wen等方法[4]略作改动。
2 结果
光镜下观察对照组大鼠视网膜具有正常的组织学结构。同时正常大鼠视网膜各层组织均有SOD mRNA的表达，彼此间强度无明显差异。而且无论在视网膜的各区域，其信号的标记部位及强度是一致的。
接受一天(24hrs)连续光照的实验组大白鼠，视网膜原位杂交信号强度较对照组明显下降；而三天连续光照后，SOD mRNA的表达强度已极为微弱；接受五天连续光照后，其SOD mRNA的表达无法检出(附图见封三)。
另外，在我们所设置的各阴性对照片中均无明显杂交信号出现。
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3 讨论
许多前期的研究资料[5]表明，视网膜的光化学损伤是光照激发产生自由基，引起组织发生过氧化的结果。光感受细胞的外段是体内含长链不饱和脂肪酸量最高的组织，因为它是由与细胞膜结构相同的盘膜叠合而成。这些不饱和脂肪酸，如docosahexaenoic acid(廿二碳六烯酸)具有易受自由基攻击的亚甲基结构，对过氧化反应极为敏感，易与OH反应形成脂质自由基，并攻击其它不饱和脂肪酸引起连锁反应。况且，与其它组织相比，光感受细胞内段富含线粒体，对氧的需要很大，正常时氧从脉络膜毛细血管，通过Bruch膜、视网膜色素上皮(RPE)及光感受细胞外段向内层扩散，使光感受细胞外段处在一高张氧的环境中，当光子被视紫红质吸收时，可激发电离，产生自由基，从而使核膜、盘膜、线粒体膜和内质网膜内的脂类发生过氧化，导致膜中蛋白质、酶和磷脂交联失活，使膜的流动性、通透性改变而受到不可逆的损害，严重者导致这些生物膜溶解和细胞死亡，从而造成视网膜组织的光性损伤。
, http://www.100md.com 已知在正常情况下，机体内自由基的产生与清除过程处于动态平衡，如果遭受各种外界因素和影响，这一平衡被破坏，将对机体造成损害。研究资料还表明，视网膜各层细胞内均存在清除自由基的天然保护系统，包括抗过氧化物酶系统和自然抗氧化剂[6]。其中SOD是生物体内存在的主要的自由基清除剂之一，它可以促进O2-的歧化反应，清除O2-的毒性作用，减轻和防止脂质过氧化。以往的研究已经证实视网膜各层组织内均含有丰富的SOD；光损伤可使视网膜中SOD的含量大为下降[7]。笔者认为本实验结果显示了SOD mRNA在视网膜中的表达部位。这是因为我们所使用的cDNA探针和大鼠SOD基因的核苷酸序列具有较高的同源性，故探针应与大鼠视网膜组织细胞内的靶mRNA，通过碱基配对互补而形成稳定的杂交体。而且，以前的研究[3，8]也已经表明，本研究所采用的实验方法用于检测大鼠视网膜中其它蛋白质mRNA表达水平的研究是切实可行的。
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本实验结果还表明，接受连续光照后，大鼠视网膜SOD mRNA的表达迅速下降。说明连续光照可从某种途径影响SOD mRNA表达，使组织细胞内SOD的合成下降，有害自由基得不到及时清除，从而对视网膜组织造成损害。这一结果也从另一个侧面揭示，视网膜光化学损伤过程中，存在着多种因素的调控与影响，其损伤机制是多层次多方面的，我们的工作只是从一个层次及侧面为光损伤机制的阐明提供了一个理论与实验依据。
附图 大鼠视网膜超氧化物歧化酶mRNA原位杂交切片
(地高辛标记探针)× 500
A：(对照组)正常循环光环境饲养组 B：续光照1天
C：连续光照3天 D：连续光照5天
, http://www.100md.com 4 参考文献
1 李文松，方谦逊，罗成仁，等.光氧化损伤视网膜中的过氧化物歧化酶和过氧化脂质变化.眼底病，1993；9：14
2 Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T，et al.Molecular coloning，Second edition cold Spring Harbor laboratory Press，1989：26
3 Yanagita T，Uehara F，Nakashima Y，et al. Demonstration of peripherin/rds mRNA in normal and light-damaged rat retinas by in situ hybridizafion histochemistry.Jpn J Ophthalmol，1993；37：1
, 百拇医药 4 Wong P，Kutty RK，Darrow RM，et al.Changes in clusterin expression associated with light-induced retinal damage in rats.Biochem-Cell-Biol，1994 Nov-Dec，72(11-12)：499
5 陈为亨，张惠蓉.眼光性损伤的自由基机理.国外医学眼科学分册，1992；16：199
6 曹锡清.脂质过氧化对细胞与机体的作用.生物化学与生物物理进展，1986；2：17
7 Rao NA，Thaete LG，Delmage JM，et al.Superoxide Dismutase in ocular structures.Invest Ophthalmol Vis Sci，1985；26：1778
, 百拇医药 8 Uehara F，Ohba N，Nakashima Y，et al.Developmental change of distribution of β-galactoside α-2，6-sialyltransferase mRNA in rat retina.Exp Eye Res.1993；56：89
(1997-01-14收搞)
关于作者撰写中、英文摘要的说明
论著稿请附中、英文摘要、字数在200～400字以内。内容包括四要素：目的、方法、结果、结论，中、英文摘要内容应一致。
本刊编辑部, http://www.100md.com
单位：*华西医科大学第一临床医院眼科(现在北京市眼科研究所，100730)；**华西医科大学第一临床医院眼科；***华西医科大学基础医学院分子生物学研究室
关键词：超氧化物歧化酶；基因；眼损伤；分子生物学
眼科980119 摘 要 通过建立大鼠视网膜光化学损伤模型，应用原位杂交技术对正常及光化学损伤大鼠视网膜超氧化物歧化酶基因mRNA表达情况进行动态观察。结果表明，视网膜组织各层均可见超氧化物歧化酶基因mRNA的表达；连续光照可使其表达水平迅速下降。原位杂交技术为研究视网膜基因表达状况的一种良好方法。
分类号 R779.12
The experimental studies of expression of genes in light-damaged rat retinas/Liu Yuling…//Ophthalmol CHN.-1998，7(1).-57-59(Department of Ophthalmology，First Clinical Medical College，West China University of Medical Sciences，Chengdu 610041)
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The changes of expression of SOD mRNA in light-damaged rat and normal rat retinas were studied in the rat model of retinal photic injury with the technique of in situ hybridization.It was demonstrated that the hybridization signals of SOD mRNA were distributed in any layer of the retinas and the expression level of SOD mRNA dramatically decreased with the increase of light exposure time.It is a good way to analyze the expression level of the gene of retinas with the technique of in situ hybridization.
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Subject terms SOD；Genes；Eye injuries；Molecular biology
有关视网膜光化学损伤的确切致伤机理尚未完全明了，但广泛的研究表明，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)与视网膜光化学损伤的发生发展过程密切相关[1]。本文通过建立大鼠的视网膜光化学损伤模型，应用原位杂交技术对视网膜中SOD基因mRNA表达部位，光化学损伤状况下其表达水平的变化进行了初步的探索性研究。关于光化学损伤状况下，视网膜中SOD基因mRNA表达水平的研究，目前国内外尚未见报道。
1 材料与方法
1.1 主要实验试剂与动物
地高辛随机引物标记和检测试剂盒购自Bochringer Maunheim；焦碳酸二乙酯(DEPC)，多聚甲醛，多聚赖氨酸，去离子甲酰胺，葡聚糖硫酸酯及蛋白酶K，聚蔗糖等均购自Sigma；牛血清白蛋白(BSA)；鲑精DNA，聚乙烯吡咯烷酮，低溶点琼脂糖，核酸分子量标准(100bp DNA ladder)，胰蛋白胨，酵母浸出汁等购自BRL；限制性核酸内切酶，核糖核酸酶A(RNase A)等购自华美公司；其余试剂均为国产分析纯。实验用水均经Millipore纯水装置处理。Wistar大鼠，重150～180g，由华西医科大学实验动物中心提供。
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1.2 质粒
含有人SOD基因的cDNA探针质粒大肠杆菌菌株由华西医科大学基础医学院分子生物学研究室提供。其中插入片段长度为0.65Kb。
1.3 动物模型的建立及实验动物的分组
自制无色透明有机玻璃光照箱的六面均安装有绿色荧光灯(波长480～560nm)，箱内中心各向照度为1000 lux，平均照度1100±106.9 lux。光照箱各面板上钻有99个0.7cm的通气孔。实验大鼠在暗房内适应24小时后，接受连续光照，光照过程不散瞳、不麻醉、不限活动和进食等。
按不同时间点的各项实验需要，将大鼠随机分为6组，每组4只。其中3组为实验组，分别在连续光照1、3、5天后，乙醚麻醉摘取右眼球；其余3组为对照组，正常循环光环境饲养、于同一时间处死取眼球。
, 百拇医药 1.4 超氧化物歧化酶cDNA探针的制备
1.4.1 质粒DNA的制备
采用Sambrook等[2]的碱裂解法提取质粒，RNase-A消化，酚-氯仿法抽提，乙醇沉淀DNA，经电泳鉴定后，260nm紫外分光法定量，-20℃贮存备用。
1.4.2 质粒DNA限制性内切酶消化及片段回收
质粒DNA按常规方法用限制性内切酶PstI消化，1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，低溶点琼脂糖法回收0.65Kb片段。-20℃贮存备用。
1.4.3 探针标记
超氧化物歧化酶cDNA探针片段用随机引物法(按试剂盒说明进行)用DIG-11-dUTP标记，乙醇沉淀，分离标记的cDNA，短暂真空干燥后，溶于适量TE缓冲液，置于-20℃贮存备用。
, 百拇医药
1.5 载玻片及盖玻片的处理
载玻片经洗液处理擦净后，分别用流动自来水及去离子水各冲洗30min，160℃烤箱内烘烤过夜以灭活RNA酶，冷却后，室温下置于500μg聚赖氨酸/ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)中浸泡10min，空气干燥，4℃防尘保存。备用于贴附石蜡切片。盖玻片经洗液处理擦净后，浸于1%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液中片刻进行硅化，取出待干，在180℃烘烤4小时，冷却后防尘保存。
1.6 组织标本的制备
实验组及对照组大鼠均由乙醚麻醉方式处死，立即摘取右眼球，按原位核酸杂交要求，浸泡于含4%多聚甲醛的DEPC-PBS缓冲液中，4℃过夜。沿垂直子午线将眼球剖成两半，置DEPC-PBS缓冲液中清洗过液，经梯度酒精脱水，石蜡包埋，在无RNase条件下，切5μm厚的切片，固定于聚赖氨酸浸泡过的玻片上，置于-20℃防尘保存，备用于原位核酸杂交。
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1.7 原位杂交方法
基本采用Toyoko等的方法[3]，并参照Wen等方法[4]略作改动。
2 结果
光镜下观察对照组大鼠视网膜具有正常的组织学结构。同时正常大鼠视网膜各层组织均有SOD mRNA的表达，彼此间强度无明显差异。而且无论在视网膜的各区域，其信号的标记部位及强度是一致的。
接受一天(24hrs)连续光照的实验组大白鼠，视网膜原位杂交信号强度较对照组明显下降；而三天连续光照后，SOD mRNA的表达强度已极为微弱；接受五天连续光照后，其SOD mRNA的表达无法检出(附图见封三)。
另外，在我们所设置的各阴性对照片中均无明显杂交信号出现。
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3 讨论
许多前期的研究资料[5]表明，视网膜的光化学损伤是光照激发产生自由基，引起组织发生过氧化的结果。光感受细胞的外段是体内含长链不饱和脂肪酸量最高的组织，因为它是由与细胞膜结构相同的盘膜叠合而成。这些不饱和脂肪酸，如docosahexaenoic acid(廿二碳六烯酸)具有易受自由基攻击的亚甲基结构，对过氧化反应极为敏感，易与OH反应形成脂质自由基，并攻击其它不饱和脂肪酸引起连锁反应。况且，与其它组织相比，光感受细胞内段富含线粒体，对氧的需要很大，正常时氧从脉络膜毛细血管，通过Bruch膜、视网膜色素上皮(RPE)及光感受细胞外段向内层扩散，使光感受细胞外段处在一高张氧的环境中，当光子被视紫红质吸收时，可激发电离，产生自由基，从而使核膜、盘膜、线粒体膜和内质网膜内的脂类发生过氧化，导致膜中蛋白质、酶和磷脂交联失活，使膜的流动性、通透性改变而受到不可逆的损害，严重者导致这些生物膜溶解和细胞死亡，从而造成视网膜组织的光性损伤。
, http://www.100md.com 已知在正常情况下，机体内自由基的产生与清除过程处于动态平衡，如果遭受各种外界因素和影响，这一平衡被破坏，将对机体造成损害。研究资料还表明，视网膜各层细胞内均存在清除自由基的天然保护系统，包括抗过氧化物酶系统和自然抗氧化剂[6]。其中SOD是生物体内存在的主要的自由基清除剂之一，它可以促进O2-的歧化反应，清除O2-的毒性作用，减轻和防止脂质过氧化。以往的研究已经证实视网膜各层组织内均含有丰富的SOD；光损伤可使视网膜中SOD的含量大为下降[7]。笔者认为本实验结果显示了SOD mRNA在视网膜中的表达部位。这是因为我们所使用的cDNA探针和大鼠SOD基因的核苷酸序列具有较高的同源性，故探针应与大鼠视网膜组织细胞内的靶mRNA，通过碱基配对互补而形成稳定的杂交体。而且，以前的研究[3，8]也已经表明，本研究所采用的实验方法用于检测大鼠视网膜中其它蛋白质mRNA表达水平的研究是切实可行的。
, http://www.100md.com
本实验结果还表明，接受连续光照后，大鼠视网膜SOD mRNA的表达迅速下降。说明连续光照可从某种途径影响SOD mRNA表达，使组织细胞内SOD的合成下降，有害自由基得不到及时清除，从而对视网膜组织造成损害。这一结果也从另一个侧面揭示，视网膜光化学损伤过程中，存在着多种因素的调控与影响，其损伤机制是多层次多方面的，我们的工作只是从一个层次及侧面为光损伤机制的阐明提供了一个理论与实验依据。
附图 大鼠视网膜超氧化物歧化酶mRNA原位杂交切片
(地高辛标记探针)× 500
A：(对照组)正常循环光环境饲养组 B：续光照1天
C：连续光照3天 D：连续光照5天
, http://www.100md.com 4 参考文献
1 李文松，方谦逊，罗成仁，等.光氧化损伤视网膜中的过氧化物歧化酶和过氧化脂质变化.眼底病，1993；9：14
2 Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T，et al.Molecular coloning，Second edition cold Spring Harbor laboratory Press，1989：26
3 Yanagita T，Uehara F，Nakashima Y，et al. Demonstration of peripherin/rds mRNA in normal and light-damaged rat retinas by in situ hybridizafion histochemistry.Jpn J Ophthalmol，1993；37：1
, 百拇医药 4 Wong P，Kutty RK，Darrow RM，et al.Changes in clusterin expression associated with light-induced retinal damage in rats.Biochem-Cell-Biol，1994 Nov-Dec，72(11-12)：499
5 陈为亨，张惠蓉.眼光性损伤的自由基机理.国外医学眼科学分册，1992；16：199
6 曹锡清.脂质过氧化对细胞与机体的作用.生物化学与生物物理进展，1986；2：17
7 Rao NA，Thaete LG，Delmage JM，et al.Superoxide Dismutase in ocular structures.Invest Ophthalmol Vis Sci，1985；26：1778
, 百拇医药 8 Uehara F，Ohba N，Nakashima Y，et al.Developmental change of distribution of β-galactoside α-2，6-sialyltransferase mRNA in rat retina.Exp Eye Res.1993；56：89
(1997-01-14收搞)
关于作者撰写中、英文摘要的说明
论著稿请附中、英文摘要、字数在200～400字以内。内容包括四要素：目的、方法、结果、结论，中、英文摘要内容应一致。
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