高频电刺激丘脑底核对帕金森病大鼠旋转行为及纹状体多巴胺和兴奋性氨基酸的影响
作者：伦学庆 张延庆 张春芬 章 翔 张剑宁
单位：伦学庆 张延庆(272129 山东济宁医学院附属医院神经外科)；张春芬(山东济宁医学院药理教研室)；章 翔 张剑宁(第四军医大学西京医院神经外科)
关键词：帕金森病；丘脑底核；多巴胺；兴奋性氨基酸；电刺激
中国行为医学科学990307 【摘要】 目的 观察高频电刺激丘脑底核对帕金森病 (Parkinson's disease ,PD)大鼠旋转行为及纹状体神经递质的影响，探讨电刺激治疗PD的作用机理。方法 采用6-OHDA建立纹状体毁损PD大鼠模型， 观察高频电刺激丘脑底核后PD鼠旋转行为的变化， 并同时检测纹状体中多巴胺和兴奋性氨基酸的含量。结果 电刺激丘脑底核后，改善了PD大鼠的旋转行为，纹状体中多巴胺含量明显增加(P<0.01)，谷氨酸含量明显减少(P<0.01)，天门冬氨酸则无明显改变(P>0.05)。结论 高频电刺激丘脑底核促进了双侧纹状体多巴胺的释放， 抑制了同侧谷氨酸的释放，从而有助于PD症状的改善。
, 百拇医药
Effects of the high-frequency stimulation to the subthalamic nucleus on the rotation behaviour and the excitatory amino acids and dopamine content in striatum in rats with Parkinson's Disease
Lun Xueqing, Zhang Yanqing,Zhang Chunfen,et al. Department of Neurosurgery,The Affiliated Hospital of Jining Medical College ,Jining 272129
【Abstract】 Objective To observe the effects of rotation behaviour and the contents of neurotransmitter in the striatum of Parkinson's disease( PD) rats by the high -frequency stimulation to the subthalamic nuclus . Method The model of PD was founded by injecting 6- OHDA into the right striatum of rats .After the stimulation to the STN, we observed the effects of the rotation behaviour of the rats to determine the content of the dopamine(DA) and excitatory amino acids (EAAs) in the striatum . Results After the stimulation ,the rotating behaviour induced by apomorphine and improved distinctly, and DA content in the striatum increased (P<0.01), and Glu content reduced significantly ( P<0. 05).Content of the ASP had no change significantly. Conclusion These results indicate that the high- frequency stimulation to STN can elicit DA's releasing in the bilateral striatum, and block the releasing of Glu in the ipsilateral striatum .These may be benificial for treatment of PD.
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【Key words】 Parkinson's disease Subthalamic nucleus Dopamine Excitatory amino acids Stimulation
近年来研究表明[1～3]，丘脑底核(subthalamic nucleus ， STN)及其兴奋性通路对控制帕金森病(Parkinson's disease， PD)运动症状起关键性的作用。电刺激作为治疗PD的一种方法，以前主要是刺激VIM核，本实验拟探讨电刺激STN治疗PD的效果及作用机理，为临床应用STN刺激术治疗PD奠定理论基础。
材料与方法
一、PD大鼠模型建立 健康雄性SD大鼠，40只，体重250±20g。麻醉后颅平位固定于MDT-V型脑立体定向仪上，按Paxinos等图谱[4]及伦学庆[5]等方法建立PD大鼠模型，结果36只以平均转速超过8r/min者视为成功PD模型，4只不成功者淘汰。
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二、动物分组及处理 将成功PD大鼠36只，随机分为三组，每组12只。 (1)刺激STN组：PD大鼠麻醉并固定于大鼠脑立体定向仪上，确定STN坐 标(前囟后3.8mm，中线外2.5mm，硬膜下7.5mm)；并将埋藏式电极(外径0.25mm,尖端裸露0.2mm)缓慢插入右侧STN区， 然后用牙托粉和医用胶固定于颅骨上，1周后联接电刺激器(上海产)进行刺激。刺激参数： 强度5V，波宽0.2ms,频率90HZ，持续10min，间隔10min，重复3次，共刺激30min。每天1次，共刺激15天。动物完全清醒后观察其行为变化情况，每隔8h观察一次，共观察三次，取其平均值。(2)假刺激组：仅插入STN电极而不作刺激，其余处理与刺激组相同。(3)毁损组：将3μl的无水乙醇缓慢注入右侧STN区7天观察其旋转行为变化情况。(4) 正常大鼠对照组：不作任何处理。
三、 纹状体多巴胺(Dopamine,DA)和兴奋性氨基酸(Excitatory Amino Acids,EAAs)的测定 旋转行为测试完毕， 采用断头法将各 组大鼠处死，立即取出脑组织并在冰盘上分离出双侧纹状体组织， 称 重后置于-70℃液氮中储存待测。用荧光法测定DA的含量。用氨基酸自动分析仪测定EAAs的含量。
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四、 组织学检查 实验结束后，用4%多聚甲醛进行灌注内固定，冰冻切片，进行Nissl染色和酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色。
五、统计学处理 采用t检验进行统计学处理。数据以
±s表示。
结果
一、 刺激STN对PD大鼠旋转行为的影响刺激STN后，PD大鼠易激惹、尾僵直、行走缓慢等情况得到明显改善。 假刺激组无明显变化。 正常大鼠则出现短暂的对侧偏身活动障碍，3～5 天后逐渐恢复。 注射 APO后，刺激组刺激前后PD鼠旋转行为显著改善(P<0.01)，毁损组也明 显减少，但不如刺激组显著；而假刺激组及正常PD 大鼠刺激前后旋转 行为均无明显改善(见表1)。
表1 刺激或毁损STN后，APO诱发大鼠旋转行为的变化(r/min，±s) 行为变化
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组别
例数
刺激前
刺激后
毁损前
毁损后
刺激组
12
6.75±0.64
2.48±1.2**++
毁损组
12
6.69±0.82
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4.37±1.64*+
假刺激组
12
6.54±0.42
6.78±0.70
6.88±0.76
6.68±0.54
正常组
10
6.99±0.81
偏侧活动障碍
6.84±.0.80
, 百拇医药
偏侧活动障碍
与刺激或毁损前比较 *P<0.05, **P<0.01；
与对照组比较 +P<0.05, ++P<0.01
二、 刺激或毁损STN后，PD大鼠纹状体DA、EAAs含量的变化(表2)。由表2可见，电刺激STN后，纹状体多巴胺含量明显增加(P<0.01) ，谷氨酸含量显著减少(P<0.01)，而天门冬氨酸则无明显改变。毁损STN组，毁损侧DA含量稍有增加，但谷氨酸和天门冬氨酸含量均无明显变化。
表2. 刺激或毁损STN后，PD大鼠纹状体DA、Glu、Asp含量变化(±s) 组别
例数
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DA(ng/g 湿脑)
Glu(μg/g 湿脑)
Asp(μg/g 湿脑)
对照组
10
630.2±71.7
117.4±12.3
32.5±4.1
PD组
12
107.2±11.5**
224.5±26.4**
, 百拇医药
45.7±5.4*
刺激组
12
528.4±59.2++
114.6±21.0++
52.6±6.9
毁损组
12
228.1±29.5+
241.2±33.1
51.6±7.7
与刺激或毁损前比较*P<0.05, **P<0.01；
, 百拇医药
与对照组比较+P<0.05, ++P<0.001
三、 组织学检查 Nissl染色发现，刺激部位在STN区，周边组织 结构基本正常，无明显变性及坏死现象，符合实验要求。TH免疫组化证实，注射6-GHDA侧黑质TH阳性神经元数目显著减少(与对侧比较) ，即PD模型的制备是成功的，符合实验要求。
讨论
一、 STN在PD发病中的作用及高频电刺激的治疗效果临床和动物实验研究发现，STN与黑质(SN)在运动功能上与纹状体关系密切，STN通过纹状体也参与了肢体运动功能的调节。有文献报道[6]毁损STN可减轻PD动物的运动困难、强直及震颤等症状，提示STN参与了PD运动 症状的发生和发展。
本研究借鉴于VIM刺激术治疗PD以及毁损STN改善PD运动症状的实 验结果对PD大鼠进行了高频电刺激研究,发现高频电刺激或毁损STN均可以改善APO所诱发的PD大鼠的旋转行为，并且前者效果更为显著；同时发现STN刺激可以缓解PD鼠的运动迟缓状态，进一步证实了STN在PD运动症状控制中发挥了关键性的作用，高频刺激STN可用于治疗各种类型PD。
, 百拇医药
二、 高频电刺激STN治疗PD的可能作用机理[7～9](1) 促进纹状体DA释放或抑制其分解。本实验发现毁损侧纹状体DA下降达87%以上，故当注射 APO时，动物出现了典型的旋转行为，但刺激一侧STN后，旋转行为则明显减少，此时检测纹状体中DA水平，发现较对照组明显增高并基本接近正常。说明高频电刺激STN促进纹状体DA的释放或抑制其降解，有利于PD大鼠旋转行为的改善。 (2)阻滞Glu能神经通路的兴奋性毒性。近来研究发现[10]，STN通路为谷氨酸能性，STN接受皮层Glu能神经纤维的投射，主要输出至黑质网状部 (SNr)、苍白球内侧部(GPe)以及丘脑腹外侧部(VL)。所以，STN刺激可以影响SNr、GPi、VL的兴奋性。STN活性降低时，SNr和GPi活性随之降低，最终使VL至皮层的兴奋性下降，从而阻滞了Glu能神经通路的兴奋性毒性作用。
我们认为，STN的谷氨酸能神经元过度兴奋是帕金森病的主要特征，通过高频电刺激抑制STN的过度兴奋，进而导致纹状体DA、Glu 等神经 递质的改变，可能是高频电刺激治疗PD的作用机理和理论基础。
, 百拇医药
参考文献
1 Greenamyre JT. Glutamate- dopamine interaction in the basal gonglia ;relationship to parkinson's disease . J Neural Transm[Gem sect]，1993，91：255～269.
2 Greenamyre JT， O'Brien CF. NMDA antagonists in the treatment of parkinson's disease . Arch neurol，1991， 48:977～981
3 Klockgether T， Tarski L. Excitatory amino acids and the basal ganglia : implication for the therapy of parkinson's disease. Trends neurosci，1989，12:285～286.
, http://www.100md.com
4 Paxinos G， Watson C. The rat brain in stereotactic coorchonates (1985). Academic Press. Sydney.
5 伦学庆，章翔，张剑宁等.毁损大鼠纹状体帕金森病模型的建立.中国病理生理杂志，1999，15(2)：188～190.
6 Bergman H,Wichmann T,Delong MR. Reversal of experimental parkinson's disease of the subthalamic nucleus. Science，1990,249:1436～1437.
7 Ditazio MC， Hollingsworth Z， Young AB，et al. Glutamate receptors in the substantia nigro of parkinson's disease brain. Neurology,1992，42:402～406.
, http://www.100md.com
8 Mitchell IJ， Lawson S， Moser B，et al. Glutamate-induced apoptosis results in a loss of striatal neurons in the parkinson's rat . Neurosci，1994，63(1):1～5.
9 Amano T， Ujihara H， matsubayashi H， et al. Dopamine -induced protection of striatal neurons against kainate receptor-mediated glutamate cytotoxicity in vitro. Brain Res，1994，655:61～69.
10 Delong MR,Crutcher MD, Georgopoulos AP. Primate globus pallidus and subthalamic nucleus :functional organization . J Neurophysiol，1995，53 :530～543.
收稿日期：1998—07—08, http://www.100md.com
单位：伦学庆 张延庆(272129 山东济宁医学院附属医院神经外科)；张春芬(山东济宁医学院药理教研室)；章 翔 张剑宁(第四军医大学西京医院神经外科)
关键词：帕金森病；丘脑底核；多巴胺；兴奋性氨基酸；电刺激
中国行为医学科学990307 【摘要】 目的 观察高频电刺激丘脑底核对帕金森病 (Parkinson's disease ,PD)大鼠旋转行为及纹状体神经递质的影响，探讨电刺激治疗PD的作用机理。方法 采用6-OHDA建立纹状体毁损PD大鼠模型， 观察高频电刺激丘脑底核后PD鼠旋转行为的变化， 并同时检测纹状体中多巴胺和兴奋性氨基酸的含量。结果 电刺激丘脑底核后，改善了PD大鼠的旋转行为，纹状体中多巴胺含量明显增加(P<0.01)，谷氨酸含量明显减少(P<0.01)，天门冬氨酸则无明显改变(P>0.05)。结论 高频电刺激丘脑底核促进了双侧纹状体多巴胺的释放， 抑制了同侧谷氨酸的释放，从而有助于PD症状的改善。
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Effects of the high-frequency stimulation to the subthalamic nucleus on the rotation behaviour and the excitatory amino acids and dopamine content in striatum in rats with Parkinson's Disease
Lun Xueqing, Zhang Yanqing,Zhang Chunfen,et al. Department of Neurosurgery,The Affiliated Hospital of Jining Medical College ,Jining 272129
【Abstract】 Objective To observe the effects of rotation behaviour and the contents of neurotransmitter in the striatum of Parkinson's disease( PD) rats by the high -frequency stimulation to the subthalamic nuclus . Method The model of PD was founded by injecting 6- OHDA into the right striatum of rats .After the stimulation to the STN, we observed the effects of the rotation behaviour of the rats to determine the content of the dopamine(DA) and excitatory amino acids (EAAs) in the striatum . Results After the stimulation ,the rotating behaviour induced by apomorphine and improved distinctly, and DA content in the striatum increased (P<0.01), and Glu content reduced significantly ( P<0. 05).Content of the ASP had no change significantly. Conclusion These results indicate that the high- frequency stimulation to STN can elicit DA's releasing in the bilateral striatum, and block the releasing of Glu in the ipsilateral striatum .These may be benificial for treatment of PD.
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【Key words】 Parkinson's disease Subthalamic nucleus Dopamine Excitatory amino acids Stimulation
近年来研究表明[1～3]，丘脑底核(subthalamic nucleus ， STN)及其兴奋性通路对控制帕金森病(Parkinson's disease， PD)运动症状起关键性的作用。电刺激作为治疗PD的一种方法，以前主要是刺激VIM核，本实验拟探讨电刺激STN治疗PD的效果及作用机理，为临床应用STN刺激术治疗PD奠定理论基础。
材料与方法
一、PD大鼠模型建立 健康雄性SD大鼠，40只，体重250±20g。麻醉后颅平位固定于MDT-V型脑立体定向仪上，按Paxinos等图谱[4]及伦学庆[5]等方法建立PD大鼠模型，结果36只以平均转速超过8r/min者视为成功PD模型，4只不成功者淘汰。
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二、动物分组及处理 将成功PD大鼠36只，随机分为三组，每组12只。 (1)刺激STN组：PD大鼠麻醉并固定于大鼠脑立体定向仪上，确定STN坐 标(前囟后3.8mm，中线外2.5mm，硬膜下7.5mm)；并将埋藏式电极(外径0.25mm,尖端裸露0.2mm)缓慢插入右侧STN区， 然后用牙托粉和医用胶固定于颅骨上，1周后联接电刺激器(上海产)进行刺激。刺激参数： 强度5V，波宽0.2ms,频率90HZ，持续10min，间隔10min，重复3次，共刺激30min。每天1次，共刺激15天。动物完全清醒后观察其行为变化情况，每隔8h观察一次，共观察三次，取其平均值。(2)假刺激组：仅插入STN电极而不作刺激，其余处理与刺激组相同。(3)毁损组：将3μl的无水乙醇缓慢注入右侧STN区7天观察其旋转行为变化情况。(4) 正常大鼠对照组：不作任何处理。
三、 纹状体多巴胺(Dopamine,DA)和兴奋性氨基酸(Excitatory Amino Acids,EAAs)的测定 旋转行为测试完毕， 采用断头法将各 组大鼠处死，立即取出脑组织并在冰盘上分离出双侧纹状体组织， 称 重后置于-70℃液氮中储存待测。用荧光法测定DA的含量。用氨基酸自动分析仪测定EAAs的含量。
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四、 组织学检查 实验结束后，用4%多聚甲醛进行灌注内固定，冰冻切片，进行Nissl染色和酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色。
五、统计学处理 采用t检验进行统计学处理。数据以
±s表示。结果
一、 刺激STN对PD大鼠旋转行为的影响刺激STN后，PD大鼠易激惹、尾僵直、行走缓慢等情况得到明显改善。 假刺激组无明显变化。 正常大鼠则出现短暂的对侧偏身活动障碍，3～5 天后逐渐恢复。 注射 APO后，刺激组刺激前后PD鼠旋转行为显著改善(P<0.01)，毁损组也明 显减少，但不如刺激组显著；而假刺激组及正常PD 大鼠刺激前后旋转 行为均无明显改善(见表1)。
表1 刺激或毁损STN后，APO诱发大鼠旋转行为的变化(r/min，
±s) 行为变化, http://www.100md.com
组别
例数
刺激前
刺激后
毁损前
毁损后
刺激组
12
6.75±0.64
2.48±1.2**++
毁损组
12
6.69±0.82
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4.37±1.64*+
假刺激组
12
6.54±0.42
6.78±0.70
6.88±0.76
6.68±0.54
正常组
10
6.99±0.81
偏侧活动障碍
6.84±.0.80
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偏侧活动障碍
与刺激或毁损前比较 *P<0.05, **P<0.01；
与对照组比较 +P<0.05, ++P<0.01
二、 刺激或毁损STN后，PD大鼠纹状体DA、EAAs含量的变化(表2)。由表2可见，电刺激STN后，纹状体多巴胺含量明显增加(P<0.01) ，谷氨酸含量显著减少(P<0.01)，而天门冬氨酸则无明显改变。毁损STN组，毁损侧DA含量稍有增加，但谷氨酸和天门冬氨酸含量均无明显变化。
表2. 刺激或毁损STN后，PD大鼠纹状体DA、Glu、Asp含量变化(
±s) 组别例数
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DA(ng/g 湿脑)
Glu(μg/g 湿脑)
Asp(μg/g 湿脑)
对照组
10
630.2±71.7
117.4±12.3
32.5±4.1
PD组
12
107.2±11.5**
224.5±26.4**
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45.7±5.4*
刺激组
12
528.4±59.2++
114.6±21.0++
52.6±6.9
毁损组
12
228.1±29.5+
241.2±33.1
51.6±7.7
与刺激或毁损前比较*P<0.05, **P<0.01；
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与对照组比较+P<0.05, ++P<0.001
三、 组织学检查 Nissl染色发现，刺激部位在STN区，周边组织 结构基本正常，无明显变性及坏死现象，符合实验要求。TH免疫组化证实，注射6-GHDA侧黑质TH阳性神经元数目显著减少(与对侧比较) ，即PD模型的制备是成功的，符合实验要求。
讨论
一、 STN在PD发病中的作用及高频电刺激的治疗效果临床和动物实验研究发现，STN与黑质(SN)在运动功能上与纹状体关系密切，STN通过纹状体也参与了肢体运动功能的调节。有文献报道[6]毁损STN可减轻PD动物的运动困难、强直及震颤等症状，提示STN参与了PD运动 症状的发生和发展。
本研究借鉴于VIM刺激术治疗PD以及毁损STN改善PD运动症状的实 验结果对PD大鼠进行了高频电刺激研究,发现高频电刺激或毁损STN均可以改善APO所诱发的PD大鼠的旋转行为，并且前者效果更为显著；同时发现STN刺激可以缓解PD鼠的运动迟缓状态，进一步证实了STN在PD运动症状控制中发挥了关键性的作用，高频刺激STN可用于治疗各种类型PD。
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二、 高频电刺激STN治疗PD的可能作用机理[7～9](1) 促进纹状体DA释放或抑制其分解。本实验发现毁损侧纹状体DA下降达87%以上，故当注射 APO时，动物出现了典型的旋转行为，但刺激一侧STN后，旋转行为则明显减少，此时检测纹状体中DA水平，发现较对照组明显增高并基本接近正常。说明高频电刺激STN促进纹状体DA的释放或抑制其降解，有利于PD大鼠旋转行为的改善。 (2)阻滞Glu能神经通路的兴奋性毒性。近来研究发现[10]，STN通路为谷氨酸能性，STN接受皮层Glu能神经纤维的投射，主要输出至黑质网状部 (SNr)、苍白球内侧部(GPe)以及丘脑腹外侧部(VL)。所以，STN刺激可以影响SNr、GPi、VL的兴奋性。STN活性降低时，SNr和GPi活性随之降低，最终使VL至皮层的兴奋性下降，从而阻滞了Glu能神经通路的兴奋性毒性作用。
我们认为，STN的谷氨酸能神经元过度兴奋是帕金森病的主要特征，通过高频电刺激抑制STN的过度兴奋，进而导致纹状体DA、Glu 等神经 递质的改变，可能是高频电刺激治疗PD的作用机理和理论基础。
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参考文献
1 Greenamyre JT. Glutamate- dopamine interaction in the basal gonglia ;relationship to parkinson's disease . J Neural Transm[Gem sect]，1993，91：255～269.
2 Greenamyre JT， O'Brien CF. NMDA antagonists in the treatment of parkinson's disease . Arch neurol，1991， 48:977～981
3 Klockgether T， Tarski L. Excitatory amino acids and the basal ganglia : implication for the therapy of parkinson's disease. Trends neurosci，1989，12:285～286.
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4 Paxinos G， Watson C. The rat brain in stereotactic coorchonates (1985). Academic Press. Sydney.
5 伦学庆，章翔，张剑宁等.毁损大鼠纹状体帕金森病模型的建立.中国病理生理杂志，1999，15(2)：188～190.
6 Bergman H,Wichmann T,Delong MR. Reversal of experimental parkinson's disease of the subthalamic nucleus. Science，1990,249:1436～1437.
7 Ditazio MC， Hollingsworth Z， Young AB，et al. Glutamate receptors in the substantia nigro of parkinson's disease brain. Neurology,1992，42:402～406.
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8 Mitchell IJ， Lawson S， Moser B，et al. Glutamate-induced apoptosis results in a loss of striatal neurons in the parkinson's rat . Neurosci，1994，63(1):1～5.
9 Amano T， Ujihara H， matsubayashi H， et al. Dopamine -induced protection of striatal neurons against kainate receptor-mediated glutamate cytotoxicity in vitro. Brain Res，1994，655:61～69.
10 Delong MR,Crutcher MD, Georgopoulos AP. Primate globus pallidus and subthalamic nucleus :functional organization . J Neurophysiol，1995，53 :530～543.
收稿日期：1998—07—08, http://www.100md.com