增殖性抗原Ki-67(MIB-1)、p16蛋白和雌激素受体在乳腺导管原位癌中的表达
作者：徐薇苓 张廷 涂小予 施达仁 杨玉妹 虞 缨
单位：上海医科大学肿瘤医院病理科(上海200032)
关键词：乳腺导管原位癌；MIB-1；p16；雌激素受体；免疫组化
肿瘤990420 随着乳腺癌早期发现和早期诊断，乳腺导管原位癌(ductal carcinoma in situ， DCIS)的确诊率已呈上升趋势。本文应用免疫组化法，研究了34例DCIS中增殖抗原Ki67(MIB-1)、抑癌基因p16和雌激素受体(estrogen receptor, ER)的表达以及与临床病理参数的关系。
材料与方法
一、材料
收集1987～1998年我院外科手术切除DCIS标本34例，患者均为女性，年龄在28～67岁之间，平均46岁。34例中，粉刺型9例，乳头状型11例，筛状型10例，实体型4例。
, 百拇医药
主要试剂来源 MIB-1单克隆抗体(Immunotech Biotech, 1∶50)，p16蛋白多克隆抗体(Santa Cruz, 1∶100)，ER单克隆抗体(DAKO，工作液)。
二、方法
1.病理形态分析 根据WHO标准确诊，分为亚型：粉刺型、筛状型、实体型和乳头状型，如为混合型则按占优势的亚型分型。再分别估计坏死(有或无)，核异型性(大或小)(与周围正常乳腺上皮细胞比较)，核分裂相(≥3个/10 HPF，<3个/10 HPF)。
2.免疫组化法检测 MIB-1和ER抗体标记采用枸橼酸-微波-ABC免疫组化法；p16抗体标记采用ABC免疫组化法，不包括微波抗原修复处理步骤[1，2]。
三、结果判断
MIB-1、p16和ER抗体标记均以细胞核出现棕色颗粒为阳性细胞，ER阳性为见到灶性阳性细胞，而p16或MIB-1阳性为阳性细胞数≥10%。
, 百拇医药
结果
一、病理形态
本组DCIS中，乳头状型最常见，占32.4%(11/34)，其次是筛状型和粉刺型；坏死除了出现在所有粉刺型中以外，乳头状型和筛状型中也可见到。核异型性大、核分裂相≥3个/10 HPF主要见于粉刺型和乳头状型(见表1)。
表1 34例乳腺DCIS病理形态分析 亚型
例数
坏死(有)
核异型性(大)
核分裂数(≥3个/10HPF)
粉刺型
9
, 百拇医药
9
7
9
非粉刺型
乳头状型
11
3
3
4
筛状型
10
4
0
1
, 百拇医药
实体型
4
0
0
0
合 计
34
16
10
14
二、病理亚型与MIB-1、p16和ER
本组DCIS中，MIB-1表达的阳性率为41.2%(14/34)，p16、ER表达的阳性率分别为32.4%、52.9%。粉刺型中MIB-1表达的阳性率为77.8%(7/9)，非粉刺型为28.0%(7/25)，粉刺型MIB-1表达的阳性率高于非粉刺型，差异有显著性(P<0.05)；非粉刺型p16、ER表达的阳性率(36.0%和56.0%)分别高于粉刺型(22.2%和44.4%)，但差异无显著性(P>0.05)；筛状型ER表达的阳性率(70.0%)分别高于粉刺型(44.4%)和乳头状型(27.5%)，且与乳头状型的差异有显著性(P<0.05)(见表2)。
, 百拇医药
表2 34例乳腺DCIS病理类型与MIB-1、p16和ER表达 亚型
例数
MIB-1
p16
ER
+
%
+
%
+
%
粉刺型
9
, http://www.100md.com
7
7.8
2
22.2
4
44.4
非粉刺型
25
7
28.0*
9
36.0
14
, 百拇医药
56.0
乳头状型
11
4
36.4
3
27.3
3
27.3#
筛状型
10
2
20.0
, 百拇医药
3
30.0
8
80.0
实体型
4
1
3
3
合 计
34
14
41.2
11
, http://www.100md.com
32.4
18
52.9
*与粉刺型比较，P<0.05；#与筛状型比较，P<0.05
三、形态指标与MIB-1、p16和ER
本组DCIS中，MIB-1在核异型性大组和核分裂相≥3个/10 HPF组表达的阳性率(66.7%和64.3%)分别高于核异型性小组和核分裂相<3个/10 HPF组(32.0%和25.0%)，差异均有显著性(P<0.05)；p16表达与坏死(有或无)、核异型性(大或小)及核分裂相(多或少)无显著性相关(P>0.05)。ER表达阳性率无坏死组、核异型性小组、核分裂相<3个/10 HPF组分别高于有坏死组、核异型性大组和核分裂相≥3个/10 HPF组，但差异均无显著性意义(P>0.05)(见表3)。
, 百拇医药
表3 34例乳腺DCIS形态指标与MIB-1、p16和ER表达 形态指标
例数
MIB-1
p16
ER
+
%
+
%
+
%
坏死 有
16
, 百拇医药
7
41.2
4
25.0
8
50.0
无
18
7
41.2
7
38.9
10
55.6
, 百拇医药
核异型性 大
9
6
66.7
3
33.3
4
44.4
小
25
8
32.0*
8
, http://www.100md.com
32.0
14
56.0
核分裂相
≥3个/10 HPF
14
9
64.3
3
21.4
6
42.9
<3个/10 HPF
, 百拇医药
20
5
25.0#
8
40.0
12
60.0
*与核异型性大比较，P<0.05
#与核分裂数≥3个/10 HPF比较，P<0.05
讨论
虽然大多数DCIS患者的预后较好，但是，DCIS并不代表一个单一的疾病单元，到目前为止，理想的治疗方法还未找到[3]，对DCIS病理及生物学行为异质性的研究，不仅有利于提高DCIS病理诊断的正确性，而且，可为临床提供复发或潜在恶性的预后指标，有利于患者选择合适的治疗方法[4，5]。
, http://www.100md.com
细胞增殖率一般反映肿瘤的生物学活性，检测细胞增殖广泛用于恶性肿瘤诊断和预后判断。Ki-67核抗原是出现在除G0期和G1早期所有细胞周期中的特异性非组蛋白，与细胞的合成代谢有关，能较正确地反映肿瘤性质。Ki-67单抗的检测只能限于冰冻组织，而MIB-1抗体可识别与Ki-67抗原相同的片段，可用于福尔马林固定组织和档案材料的回顾性分析。据报道[6，7]，MIB-1在乳腺癌中的表达，不仅与核分裂数、组织学分级、DNA异倍体、肿块大小、淋巴结转移和激素受体表达有关，而且低增殖率与5年复发率、死亡率较低，患者缓解期、存活期较长有关。本文以10%为MIB-1阳性标准将34例DCIS分为阴性(低增殖)和阳性(高增殖)，阳性率为41.2%(14/34)，粉刺型中MIB-1表达的阳性率显著高于非粉刺型(P<0.05)，核异型性大组和核分裂相≥3个/10 HPF组MIB-1表达的阳性率分别高于核异型性小组和核分裂相<3个/10 HPF组，且差异均有显著性意义(P<0.05)，提示在乳腺DCIS中，MIB-1检测能发现有较高增殖能力的肿瘤，可能是一有意义的预后指标。
, 百拇医药
细胞周期是癌生长的重要因素，通过细胞周期依赖性激酶(CDKs, cyclin-dependent kinases)调控。p16蛋白是定位于9p21的多肿瘤抑制基因(CDKN2/MTS1)的产物，能与细胞周期蛋白Cyclin D1依赖激酶CDK4结合，抑制CDK4作用，使抗癌基因Rb蛋白回到非磷酸化状态，发挥正常功能，抑制细胞增殖。在正常组织中，不需或只需少量p16表达参加细胞周期的调控，呈低水平状态，而在癌组织中，p16基因缺失、突变或甲基化可导致p16失表达，有时呈反馈性的提高[1，2，8]。因此认为，对p16蛋白的检测有助于了解p16基因的活性状态，判断肿瘤的增殖、侵袭及转移的能力。乳腺癌中p16的阳性率据报道从29.8%～53%不等，DCIS中为31.6%(包括早浸)[9]和75%(导管内癌为主型)[10]；p16与组织学分型、核分级、核分裂数、淋巴结转移及肿块大小无关[1，9]，也有报道淋巴结转移阴性组p16阳性率显著高于阳性组，与肿块大小、临床分期有关[8，10]。本组DCIS标本不用微波进行抗原修复，以核阳性为p16阳性细胞，结果发现p16阳性细胞分布呈不均一性，阳性率为32.4%(11/34)，p16表达与组织学分型无关，与形态学指标坏死、核异型性、核分裂相无关(P>0.05)。
, http://www.100md.com
本组DCIS中ER表达的阳性率为52.9%(18/34)，非粉刺型ER阳性率高于粉刺型(P<0.05)，筛状型高于粉刺型和乳头状型，且筛状型与乳头状型ER表达相差有显著性(P<0.05)；ER表达在无坏死组、核异型性小组和核分裂相少组分别高于有坏死组、核异型性大组和核分裂相多组(P>0.05)。据文献报道[3，11]：DCIS中ER阳性率31.8%～65%，Bur报道ER在非粉刺型中表达高于粉刺型，ER阳性多见于中、小细胞及无坏死的DCIS中；Gini发现17%的粉刺型中ER表达，筛状型为55%；而Malta认为ER表达与分型无关。
乳腺导管原位癌无论病理形态还是生物学行为都是异质性的。增殖性抗原Ki-67(MIB-1)可能是一临床预后判断的重要标志物。
第一作者简介 徐薇苓，女，硕士，副研究员。
参考文献
, 百拇医药
1 Geradts J, Wilson PA. High frequency of aberrant p16(INK4A) expression in human breast cancer. Am J Pathol, 1996,149:15
2 Geradts J, Kratzke RA, Niehans GA, et al. Immunohistochemical detection of the cyclin-dependent kinase inhibitor 2/multiple tumor suppress gene 1 (CDKN2/MTS1) product p16 (INK4A) in archival human solid tumors: Correlation with retinoblastoma protein expression. Cancer Res, 1995, 55(24):6006
3 Leal CB, Schmitt FC, Bento MJ, et al. Ductal carcinoma in situ of the breast:Histologic characterization and its relationship to ploidy and immunohistochemical expression of hormone receptors, p53 and c-erbB-2 protein. Cancer, 1995, 75(8):2123
, 百拇医药
4 Schnitt SJ, Harris JR, Smith BL. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Cancer, 1996, 77(11):2189
5 徐薇苓，涂小予，张廷
，等.乳腺导管原位癌病理形态及c-erbB-2、p53和PCNA表达.临床与实验病理学杂志，1997，13(3)：241
6 Keshgegian AA, Cnaan A. Proliferation markers in breast carcinoma. Mitotic figure count, S-phase fraction, proliferating cell nuclear antigen, Ki-67 and MIB-1. Am J Clin Pathol, 1995,104(1):42
, 百拇医药
7 Querzoli P, Albonico G, Ferreti S, et al. MIB-1 proliferative activity in invasive breast cancer measured by image analysis. J Clin Pathol; 1996,49(11):926
8 Ito Y, Kobayashi T, Takeda T, et al. Expression of p16 and cyclin-dependent kinase 4 proteins in primary breast carcinomas. Oncology, 1997, 54(6):508
9 张亚伟，沈坤炜，沈镇宙，等.乳腺癌中p16的表达与细胞增殖的关系.中华外科学杂志；1997，35(10)：638
10 郭山春，廖松林，丁华野，等.p16蛋白在乳腺癌中的表达及其与预后的关系.中华病理学杂志，1997，26(3)：175
11 Poller DN, Snead DRJ, Roberts EC, et al. Oestrogen receptor expression in ductal carcinoma in situ of the breast: relationship to flow cytometric analysis of DNA and expression of the C-erbB-2 oncoprotein. Br J Cancer, 1993, 68:156
(收稿：1998-11-12 修回：1999-04-01), http://www.100md.com
单位：上海医科大学肿瘤医院病理科(上海200032)
关键词：乳腺导管原位癌；MIB-1；p16；雌激素受体；免疫组化
肿瘤990420 随着乳腺癌早期发现和早期诊断，乳腺导管原位癌(ductal carcinoma in situ， DCIS)的确诊率已呈上升趋势。本文应用免疫组化法，研究了34例DCIS中增殖抗原Ki67(MIB-1)、抑癌基因p16和雌激素受体(estrogen receptor, ER)的表达以及与临床病理参数的关系。
材料与方法
一、材料
收集1987～1998年我院外科手术切除DCIS标本34例，患者均为女性，年龄在28～67岁之间，平均46岁。34例中，粉刺型9例，乳头状型11例，筛状型10例，实体型4例。
, 百拇医药
主要试剂来源 MIB-1单克隆抗体(Immunotech Biotech, 1∶50)，p16蛋白多克隆抗体(Santa Cruz, 1∶100)，ER单克隆抗体(DAKO，工作液)。
二、方法
1.病理形态分析 根据WHO标准确诊，分为亚型：粉刺型、筛状型、实体型和乳头状型，如为混合型则按占优势的亚型分型。再分别估计坏死(有或无)，核异型性(大或小)(与周围正常乳腺上皮细胞比较)，核分裂相(≥3个/10 HPF，<3个/10 HPF)。
2.免疫组化法检测 MIB-1和ER抗体标记采用枸橼酸-微波-ABC免疫组化法；p16抗体标记采用ABC免疫组化法，不包括微波抗原修复处理步骤[1，2]。
三、结果判断
MIB-1、p16和ER抗体标记均以细胞核出现棕色颗粒为阳性细胞，ER阳性为见到灶性阳性细胞，而p16或MIB-1阳性为阳性细胞数≥10%。
, 百拇医药
结果
一、病理形态
本组DCIS中，乳头状型最常见，占32.4%(11/34)，其次是筛状型和粉刺型；坏死除了出现在所有粉刺型中以外，乳头状型和筛状型中也可见到。核异型性大、核分裂相≥3个/10 HPF主要见于粉刺型和乳头状型(见表1)。
表1 34例乳腺DCIS病理形态分析 亚型
例数
坏死(有)
核异型性(大)
核分裂数(≥3个/10HPF)
粉刺型
9
, 百拇医药
9
7
9
非粉刺型
乳头状型
11
3
3
4
筛状型
10
4
0
1
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实体型
4
0
0
0
合 计
34
16
10
14
二、病理亚型与MIB-1、p16和ER
本组DCIS中，MIB-1表达的阳性率为41.2%(14/34)，p16、ER表达的阳性率分别为32.4%、52.9%。粉刺型中MIB-1表达的阳性率为77.8%(7/9)，非粉刺型为28.0%(7/25)，粉刺型MIB-1表达的阳性率高于非粉刺型，差异有显著性(P<0.05)；非粉刺型p16、ER表达的阳性率(36.0%和56.0%)分别高于粉刺型(22.2%和44.4%)，但差异无显著性(P>0.05)；筛状型ER表达的阳性率(70.0%)分别高于粉刺型(44.4%)和乳头状型(27.5%)，且与乳头状型的差异有显著性(P<0.05)(见表2)。
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表2 34例乳腺DCIS病理类型与MIB-1、p16和ER表达 亚型
例数
MIB-1
p16
ER
+
%
+
%
+
%
粉刺型
9
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7
7.8
2
22.2
4
44.4
非粉刺型
25
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28.0*
9
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14
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56.0
乳头状型
11
4
36.4
3
27.3
3
27.3#
筛状型
10
2
20.0
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3
30.0
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80.0
实体型
4
1
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合 计
34
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41.2
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32.4
18
52.9
*与粉刺型比较，P<0.05；#与筛状型比较，P<0.05
三、形态指标与MIB-1、p16和ER
本组DCIS中，MIB-1在核异型性大组和核分裂相≥3个/10 HPF组表达的阳性率(66.7%和64.3%)分别高于核异型性小组和核分裂相<3个/10 HPF组(32.0%和25.0%)，差异均有显著性(P<0.05)；p16表达与坏死(有或无)、核异型性(大或小)及核分裂相(多或少)无显著性相关(P>0.05)。ER表达阳性率无坏死组、核异型性小组、核分裂相<3个/10 HPF组分别高于有坏死组、核异型性大组和核分裂相≥3个/10 HPF组，但差异均无显著性意义(P>0.05)(见表3)。
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表3 34例乳腺DCIS形态指标与MIB-1、p16和ER表达 形态指标
例数
MIB-1
p16
ER
+
%
+
%
+
%
坏死 有
16
, 百拇医药
7
41.2
4
25.0
8
50.0
无
18
7
41.2
7
38.9
10
55.6
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核异型性 大
9
6
66.7
3
33.3
4
44.4
小
25
8
32.0*
8
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32.0
14
56.0
核分裂相
≥3个/10 HPF
14
9
64.3
3
21.4
6
42.9
<3个/10 HPF
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25.0#
8
40.0
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60.0
*与核异型性大比较，P<0.05
#与核分裂数≥3个/10 HPF比较，P<0.05
讨论
虽然大多数DCIS患者的预后较好，但是，DCIS并不代表一个单一的疾病单元，到目前为止，理想的治疗方法还未找到[3]，对DCIS病理及生物学行为异质性的研究，不仅有利于提高DCIS病理诊断的正确性，而且，可为临床提供复发或潜在恶性的预后指标，有利于患者选择合适的治疗方法[4，5]。
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细胞增殖率一般反映肿瘤的生物学活性，检测细胞增殖广泛用于恶性肿瘤诊断和预后判断。Ki-67核抗原是出现在除G0期和G1早期所有细胞周期中的特异性非组蛋白，与细胞的合成代谢有关，能较正确地反映肿瘤性质。Ki-67单抗的检测只能限于冰冻组织，而MIB-1抗体可识别与Ki-67抗原相同的片段，可用于福尔马林固定组织和档案材料的回顾性分析。据报道[6，7]，MIB-1在乳腺癌中的表达，不仅与核分裂数、组织学分级、DNA异倍体、肿块大小、淋巴结转移和激素受体表达有关，而且低增殖率与5年复发率、死亡率较低，患者缓解期、存活期较长有关。本文以10%为MIB-1阳性标准将34例DCIS分为阴性(低增殖)和阳性(高增殖)，阳性率为41.2%(14/34)，粉刺型中MIB-1表达的阳性率显著高于非粉刺型(P<0.05)，核异型性大组和核分裂相≥3个/10 HPF组MIB-1表达的阳性率分别高于核异型性小组和核分裂相<3个/10 HPF组，且差异均有显著性意义(P<0.05)，提示在乳腺DCIS中，MIB-1检测能发现有较高增殖能力的肿瘤，可能是一有意义的预后指标。
, 百拇医药
细胞周期是癌生长的重要因素，通过细胞周期依赖性激酶(CDKs, cyclin-dependent kinases)调控。p16蛋白是定位于9p21的多肿瘤抑制基因(CDKN2/MTS1)的产物，能与细胞周期蛋白Cyclin D1依赖激酶CDK4结合，抑制CDK4作用，使抗癌基因Rb蛋白回到非磷酸化状态，发挥正常功能，抑制细胞增殖。在正常组织中，不需或只需少量p16表达参加细胞周期的调控，呈低水平状态，而在癌组织中，p16基因缺失、突变或甲基化可导致p16失表达，有时呈反馈性的提高[1，2，8]。因此认为，对p16蛋白的检测有助于了解p16基因的活性状态，判断肿瘤的增殖、侵袭及转移的能力。乳腺癌中p16的阳性率据报道从29.8%～53%不等，DCIS中为31.6%(包括早浸)[9]和75%(导管内癌为主型)[10]；p16与组织学分型、核分级、核分裂数、淋巴结转移及肿块大小无关[1，9]，也有报道淋巴结转移阴性组p16阳性率显著高于阳性组，与肿块大小、临床分期有关[8，10]。本组DCIS标本不用微波进行抗原修复，以核阳性为p16阳性细胞，结果发现p16阳性细胞分布呈不均一性，阳性率为32.4%(11/34)，p16表达与组织学分型无关，与形态学指标坏死、核异型性、核分裂相无关(P>0.05)。
, http://www.100md.com
本组DCIS中ER表达的阳性率为52.9%(18/34)，非粉刺型ER阳性率高于粉刺型(P<0.05)，筛状型高于粉刺型和乳头状型，且筛状型与乳头状型ER表达相差有显著性(P<0.05)；ER表达在无坏死组、核异型性小组和核分裂相少组分别高于有坏死组、核异型性大组和核分裂相多组(P>0.05)。据文献报道[3，11]：DCIS中ER阳性率31.8%～65%，Bur报道ER在非粉刺型中表达高于粉刺型，ER阳性多见于中、小细胞及无坏死的DCIS中；Gini发现17%的粉刺型中ER表达，筛状型为55%；而Malta认为ER表达与分型无关。
乳腺导管原位癌无论病理形态还是生物学行为都是异质性的。增殖性抗原Ki-67(MIB-1)可能是一临床预后判断的重要标志物。
第一作者简介 徐薇苓，女，硕士，副研究员。
参考文献
, 百拇医药
1 Geradts J, Wilson PA. High frequency of aberrant p16(INK4A) expression in human breast cancer. Am J Pathol, 1996,149:15
2 Geradts J, Kratzke RA, Niehans GA, et al. Immunohistochemical detection of the cyclin-dependent kinase inhibitor 2/multiple tumor suppress gene 1 (CDKN2/MTS1) product p16 (INK4A) in archival human solid tumors: Correlation with retinoblastoma protein expression. Cancer Res, 1995, 55(24):6006
3 Leal CB, Schmitt FC, Bento MJ, et al. Ductal carcinoma in situ of the breast:Histologic characterization and its relationship to ploidy and immunohistochemical expression of hormone receptors, p53 and c-erbB-2 protein. Cancer, 1995, 75(8):2123
, 百拇医药
4 Schnitt SJ, Harris JR, Smith BL. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Cancer, 1996, 77(11):2189
5 徐薇苓，涂小予，张廷
，等.乳腺导管原位癌病理形态及c-erbB-2、p53和PCNA表达.临床与实验病理学杂志，1997，13(3)：2416 Keshgegian AA, Cnaan A. Proliferation markers in breast carcinoma. Mitotic figure count, S-phase fraction, proliferating cell nuclear antigen, Ki-67 and MIB-1. Am J Clin Pathol, 1995,104(1):42
, 百拇医药
7 Querzoli P, Albonico G, Ferreti S, et al. MIB-1 proliferative activity in invasive breast cancer measured by image analysis. J Clin Pathol; 1996,49(11):926
8 Ito Y, Kobayashi T, Takeda T, et al. Expression of p16 and cyclin-dependent kinase 4 proteins in primary breast carcinomas. Oncology, 1997, 54(6):508
9 张亚伟，沈坤炜，沈镇宙，等.乳腺癌中p16的表达与细胞增殖的关系.中华外科学杂志；1997，35(10)：638
10 郭山春，廖松林，丁华野，等.p16蛋白在乳腺癌中的表达及其与预后的关系.中华病理学杂志，1997，26(3)：175
11 Poller DN, Snead DRJ, Roberts EC, et al. Oestrogen receptor expression in ductal carcinoma in situ of the breast: relationship to flow cytometric analysis of DNA and expression of the C-erbB-2 oncoprotein. Br J Cancer, 1993, 68:156
(收稿：1998-11-12 修回：1999-04-01), http://www.100md.com