人肿瘤组织中B7.1和MHC抗原表达及其意义
作者：陈蕴颖 孙毅 司履生 王一理 郭建芬
单位：陈蕴颖 华西医科大学附属第一医院移植免疫室(成都 610041)；孙 毅 四川省肿瘤研究所；司履生 王一理 郭建芬 西安医科大学免疫病理学研究室
关键词：共刺激分子；B7.1抗原；人体恶性肿瘤
肿瘤990414 肿瘤免疫主要由细胞免疫介导，研究证实抗原特异性T细胞的活化需要共刺激信号的参与，缺乏共刺激信号将导致受抗原刺激的T细胞发生免疫无能，耐受甚至凋亡。
B7.1是目前研究最多也是最重要的共刺激分子，已有的动物实验证明肿瘤细胞缺乏B7.1表达是其逃逸免疫监视的一个重要机制[1]。目前关于人体内肿瘤组织B7.1分子表达的研究报道尚少，作者利用核酸杂交及免疫组化技术对一组不同来源的人体肿瘤组织中瘤细胞B7.1的表达做了检测。
, 百拇医药
材料与方法
1.标本 95例肿瘤标本(其组成见表1)，70例为新鲜取材的进展期肿瘤组织，其中54例行免疫组化检测，16例行点膜杂交检测。25例原位杂交标本为归档的福尔马林固定石蜡包埋组织，所有病例手术前均未接受过化放疗及免疫治疗。
2.免疫组化技术(IHC) 采用ABC法，DAB显色，CD80(B7，1)单抗购自美国Becton/Dickson公司，ABC试剂盒购自博士德公司。CD80单抗的稀释度经扁桃体，淋巴结切片染色滴定。
3.探针标记 采用PCR Dig-11-dUTP掺入法[2]，标记药盒购自宝灵曼(B/M)公司，模板为pCDM8 B7.1质粒(美国 Dana-Farber癌症中心Freeman博士惠赠)，B7.1特异性上游引物(5′ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG GG3′)，下游引物(5′TAC AGG GCG TAC ACT TTC CCT TC3′)。探针标记质量及特异性按B/M公司提供的方法检测。
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4.RNA提取 液氮保存瘤组织约2 mg～3 mg仔细粉碎后，异硫氰酸胍/氯仿提取法抽提总RNA。RNA质量经紫外分光及琼脂糖凝胶电泳检测。
5.RT-PCR 总RNA提取后，按分子克隆手册介绍的方法逆转录(RT)及PCR，AMV逆转录试剂盒购自美国Promega公司。
6.点膜杂交(Dot blot) RT-CPR产物2 μl点于尼龙膜，80℃干烤固定，与Dig-B7.1 cDNA探针杂交，严格洗膜，滴加碱性磷酸酶标记的Dig抗体，NBT-BCIP避光显色，设pCDM8 B7.1 cDNA质粒PCR产物阳性对照。
7.原位杂志(ISH) 石蜡切片脱蜡、水化后盐酸，蛋白酶K处理，4%多聚甲醛后固定，与Dig-B7.1 cDNA探针杂交，严格震洗，显色同上。设RNAse消化对照及不加探针空白对照。
结果
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1.免疫组化检测 37/54例不同瘤组织的瘤细胞B7.1抗原染色阳性。阳性产物呈棕黄色，分布于胞奖及胞膜(见插页第4页图6)。间质中浸润的树突状细胞、少数淋巴细胞及小血管内皮细胞亦表达B7.1抗原。1例乳腺实体癌的淋巴结转移癌细胞亦呈B7.1染色阳性。54例标本中有42例同时检查了MHCⅠ和Ⅱ类抗原表达，结果发现40/42例瘤组织HLA-ABC抗原阳性，27/42例可见瘤细胞有HLA-DR抗原表达。
图6 子宫颈鳞状上皮癌：癌细胞B7.1抗原阳性(棕黄色),间质中部分淋巴细胞,巨噬细胞亦呈阳性ABC×400
2.点膜杂交检测 16例瘤组织的RT-PCR产物经点杂交后其中9例与B7.1 cDNA探针杂交阳性。
3.原位杂交检测 13/25例肿瘤组织切片经原位杂交检测可见B7.1 mRNA阳性产物呈兰紫色或兰色，位于瘤细胞胞浆，间质中部分浸润淋巴细胞亦呈杂交阳性。另2例尖锐湿疣组织切片杂交亦见上皮细胞内有B7.1 mRNA高表达。
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讨论
关于人体肿瘤组织中的B7.1抗原的表达至今仍有零星报道。Murry等人报道霍奇金氏淋巴瘤病变中的霍奇金氏细胞和RS细胞表达B7.1抗原；Gruss等报告H-RS细胞表达B7.1、B7.2、ICAM-1等多种共刺激分子和MHC抗原[3]；Benfeld等人发现自发性消退黑素瘤细胞有B7.1分子表达；Bohlen等报道EBV阳性B细胞淋巴瘤B7.1分子等表达[4]；本室孙毅等也曾报道过淋巴瘤组织中有B7.1 mRNA表达[5]。作者此次用免疫组化、核酸杂交的方法同样也证实受检的半数以上瘤组织中的瘤细胞有B7.1抗原/mRNA表达。可见，肿瘤(至少是部分肿瘤)逃逸机制也许较B7家庭最初发现时的认识复杂得多。瘤细胞的B7表达与否并不能认为是肿瘤逃逸的最重要的机制。
此外，对其中42例标本MHC Ⅰ和Ⅱ抗原表达的研究结果和作者的以往结果及文献报告相同，40/42例肿瘤表达MHC Ⅰ抗原，27例还获得MHC Ⅱ抗原表达。这些实验结果，结合近年来对人类肿瘤排斥抗原的研究结果似乎说明，就人类肿瘤来说，至少大部分存在有足以诱导肿瘤抗原特异性T细胞活化的基本分子结构，包括肿瘤抗原肽与MHC抗原复合物及共刺激分子。
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最近的许多报告提及肿瘤患者外周血及肿瘤浸润淋巴细胞中确实含有肿瘤抗原特异性CTL，这正是肿瘤组织具有激发宿主抗瘤免疫反应的证据。不过，这种抗瘤免疫反应显然未达到保护宿主的有效程度。这也许和以下机制有关。(1)迄今所发现的肿瘤排斥抗原，除有关病毒抗原外，绝大部分都是肿瘤相关抗原，是宿主免疫活性细胞曾经遇到过的抗原，这些抗原更倾向于诱发免疫耐受。加之，肿瘤发生发展是一个多阶段过程，在这一过程中抗原修饰和抗原选择是不断发生的[6]。(2)肿瘤细胞虽然自身可以提呈肿瘤抗原，但其抗原提呈能力、特性与职业性APC的差异可能是一个值得深入研究的问题，有报告说，角朊细胞能有效刺激T细胞增生，但增生T细胞所产生的细胞因子与受职业性APC所诱导的活化T细胞不同，前者仅产生IL2，IL4，并不产生IFNγ[7]；另外，抗原提呈细胞的机能状态也是值得考虑的，有实验证明，紫外线UV-8照射动物可以使表皮郎罕氏细胞从免疫原性转为免疫耐受性[8]。(3)共刺激分子的机能存在差异。已知共刺激分子有十多种，其机能差异未彻底阐明，仅B7家庭中，就有B7.1，B7.2，B7.3(BB1)三种，其相应配体也有CD28和CTLA4，目前有实验证实B7.1主要诱导Th1细胞活化，而B7.2诱导Th2细胞活化[9]。B7与CD28分子结合后，可以传导提高IL2 mRNA稳定性、增强IL2分泌的信号，而CTLA4却是一个介导T细胞负反馈信号的分子[10]。(4)T细胞受体机能及Th细胞亚群机能。最近有不少关于TIL的TCR存在机能缺陷的报告[11]，同时，已知Th细胞不同亚群机能明显不同。妊娠免疫保护胎儿是早已熟知的事实，近年证实，位于母体胎儿界面上的浸润淋巴细胞主要为Th2细胞，它们产生大量IL-10具有有力的免疫抑制效应[7]。(5)肿瘤局部微环境可能也是肿瘤免疫反应最终结局的决定因素，肿瘤局部存在各种各样不同起源的免疫抑制细胞分子(包括肿瘤细胞产生的分子)早已为人所共知，并且还在不断得到证明。(6)最近，更有人报告黑素瘤细胞表达Fas L，已被考为黑素瘤逃逸免疫监视的机制之一[12]。总之，在长期进化中，肿瘤已发展了相当“完善”的多样化的逃逸免疫监视的机制。当然，只有这些机制被真正阐明之后，肿瘤的免疫治疗才不再是盲目的。
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国家自然科学基金资助项目(基金编号39472093)
第一作者简介 陈蕴颖，女，硕士，实习研究员。
参考文献
1 Townsend SE,Allison JP.Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ T cell by B7-transfected melanoma cells.Science,1993,259:368
2 宋建明，孙 毅，杨居详.PCR法用于探针的非同位素标记.西安医科大学学报，1996，8：107
3 Gruss HJ,Pinto A,Duyster J, et al.Hodgkin′s disease:a tumor with disturbed Immunological pathway.Immunol Today,1997,18(4):157
, 百拇医药
4 Bohlen H,Mazke O,Titzer, et al. Prevention of Epstein-Barr virus-induced human B cell lymphoma in severe combined immunodeficient mice treated with CD3×CD19 biospecific antibodies,CD28 monospecific antibodies,and autologous Tcells.Cancer Res,1997,57:1704
5 孙毅，陈蕴颖，司履生.共刺激分子B7.1在淋巴瘤组织中的表达.中华病理学杂志，1997，26(2)：23
6 Jager E,Ringhoffer M,Altanansberger M,et al. Immunoselection in vivo:Independent loss of MHC Ⅰ and melanocyte differentiation antigen expression inmetastatic melanoma.Int J Cancer,1997,71(2):142
, 百拇医药
7 Romagnani S.The Th1/Th2 paradigm.Immunol Today,1997,18(6):263
8 Nickoloff BJ,Turka LA.Immunological functions of non-professional antigen-presenting cells:new insight from studies of T-cell interactions with keratinocytes.Immunol Taday,1994,15:464
9 Krummel MF,Allison JP. CD28 and CTLA-4 have opposing effects on theresponse of T cells to stimulation.J Exp Med,1995,182(2):459
10 Walunas TL,Lenschow DJ,Bakker CY, et al. CTLA-4 can functions as a negativeregluator of T cell activation.Immunity,1994,1(5):405
, 百拇医药
11 Ludwig E,Van Den Hove,Van Gool SW, et al. Identification of an enriched CD+4 Cda++ CD8β T-cell subset among tumor infiltrating lymphocytes in human renal cell carcinoma.Int J Cancer,1997,71(2):178
12 Hahne M,Rimold D,Schroter M, et al. Melanoma cell expression of Fas(Apo-1/CD95)ligand implications for tumor immune escape.Science,1996,274(5291);1363
(收稿：1999-01-15), http://www.100md.com
单位：陈蕴颖 华西医科大学附属第一医院移植免疫室(成都 610041)；孙 毅 四川省肿瘤研究所；司履生 王一理 郭建芬 西安医科大学免疫病理学研究室
关键词：共刺激分子；B7.1抗原；人体恶性肿瘤
肿瘤990414 肿瘤免疫主要由细胞免疫介导，研究证实抗原特异性T细胞的活化需要共刺激信号的参与，缺乏共刺激信号将导致受抗原刺激的T细胞发生免疫无能，耐受甚至凋亡。
B7.1是目前研究最多也是最重要的共刺激分子，已有的动物实验证明肿瘤细胞缺乏B7.1表达是其逃逸免疫监视的一个重要机制[1]。目前关于人体内肿瘤组织B7.1分子表达的研究报道尚少，作者利用核酸杂交及免疫组化技术对一组不同来源的人体肿瘤组织中瘤细胞B7.1的表达做了检测。
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材料与方法
1.标本 95例肿瘤标本(其组成见表1)，70例为新鲜取材的进展期肿瘤组织，其中54例行免疫组化检测，16例行点膜杂交检测。25例原位杂交标本为归档的福尔马林固定石蜡包埋组织，所有病例手术前均未接受过化放疗及免疫治疗。
2.免疫组化技术(IHC) 采用ABC法，DAB显色，CD80(B7，1)单抗购自美国Becton/Dickson公司，ABC试剂盒购自博士德公司。CD80单抗的稀释度经扁桃体，淋巴结切片染色滴定。
3.探针标记 采用PCR Dig-11-dUTP掺入法[2]，标记药盒购自宝灵曼(B/M)公司，模板为pCDM8 B7.1质粒(美国 Dana-Farber癌症中心Freeman博士惠赠)，B7.1特异性上游引物(5′ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG GG3′)，下游引物(5′TAC AGG GCG TAC ACT TTC CCT TC3′)。探针标记质量及特异性按B/M公司提供的方法检测。
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4.RNA提取 液氮保存瘤组织约2 mg～3 mg仔细粉碎后，异硫氰酸胍/氯仿提取法抽提总RNA。RNA质量经紫外分光及琼脂糖凝胶电泳检测。
5.RT-PCR 总RNA提取后，按分子克隆手册介绍的方法逆转录(RT)及PCR，AMV逆转录试剂盒购自美国Promega公司。
6.点膜杂交(Dot blot) RT-CPR产物2 μl点于尼龙膜，80℃干烤固定，与Dig-B7.1 cDNA探针杂交，严格洗膜，滴加碱性磷酸酶标记的Dig抗体，NBT-BCIP避光显色，设pCDM8 B7.1 cDNA质粒PCR产物阳性对照。
7.原位杂志(ISH) 石蜡切片脱蜡、水化后盐酸，蛋白酶K处理，4%多聚甲醛后固定，与Dig-B7.1 cDNA探针杂交，严格震洗，显色同上。设RNAse消化对照及不加探针空白对照。
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1.免疫组化检测 37/54例不同瘤组织的瘤细胞B7.1抗原染色阳性。阳性产物呈棕黄色，分布于胞奖及胞膜(见插页第4页图6)。间质中浸润的树突状细胞、少数淋巴细胞及小血管内皮细胞亦表达B7.1抗原。1例乳腺实体癌的淋巴结转移癌细胞亦呈B7.1染色阳性。54例标本中有42例同时检查了MHCⅠ和Ⅱ类抗原表达，结果发现40/42例瘤组织HLA-ABC抗原阳性，27/42例可见瘤细胞有HLA-DR抗原表达。
图6 子宫颈鳞状上皮癌：癌细胞B7.1抗原阳性(棕黄色),间质中部分淋巴细胞,巨噬细胞亦呈阳性ABC×400
2.点膜杂交检测 16例瘤组织的RT-PCR产物经点杂交后其中9例与B7.1 cDNA探针杂交阳性。
3.原位杂交检测 13/25例肿瘤组织切片经原位杂交检测可见B7.1 mRNA阳性产物呈兰紫色或兰色，位于瘤细胞胞浆，间质中部分浸润淋巴细胞亦呈杂交阳性。另2例尖锐湿疣组织切片杂交亦见上皮细胞内有B7.1 mRNA高表达。
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讨论
关于人体肿瘤组织中的B7.1抗原的表达至今仍有零星报道。Murry等人报道霍奇金氏淋巴瘤病变中的霍奇金氏细胞和RS细胞表达B7.1抗原；Gruss等报告H-RS细胞表达B7.1、B7.2、ICAM-1等多种共刺激分子和MHC抗原[3]；Benfeld等人发现自发性消退黑素瘤细胞有B7.1分子表达；Bohlen等报道EBV阳性B细胞淋巴瘤B7.1分子等表达[4]；本室孙毅等也曾报道过淋巴瘤组织中有B7.1 mRNA表达[5]。作者此次用免疫组化、核酸杂交的方法同样也证实受检的半数以上瘤组织中的瘤细胞有B7.1抗原/mRNA表达。可见，肿瘤(至少是部分肿瘤)逃逸机制也许较B7家庭最初发现时的认识复杂得多。瘤细胞的B7表达与否并不能认为是肿瘤逃逸的最重要的机制。
此外，对其中42例标本MHC Ⅰ和Ⅱ抗原表达的研究结果和作者的以往结果及文献报告相同，40/42例肿瘤表达MHC Ⅰ抗原，27例还获得MHC Ⅱ抗原表达。这些实验结果，结合近年来对人类肿瘤排斥抗原的研究结果似乎说明，就人类肿瘤来说，至少大部分存在有足以诱导肿瘤抗原特异性T细胞活化的基本分子结构，包括肿瘤抗原肽与MHC抗原复合物及共刺激分子。
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最近的许多报告提及肿瘤患者外周血及肿瘤浸润淋巴细胞中确实含有肿瘤抗原特异性CTL，这正是肿瘤组织具有激发宿主抗瘤免疫反应的证据。不过，这种抗瘤免疫反应显然未达到保护宿主的有效程度。这也许和以下机制有关。(1)迄今所发现的肿瘤排斥抗原，除有关病毒抗原外，绝大部分都是肿瘤相关抗原，是宿主免疫活性细胞曾经遇到过的抗原，这些抗原更倾向于诱发免疫耐受。加之，肿瘤发生发展是一个多阶段过程，在这一过程中抗原修饰和抗原选择是不断发生的[6]。(2)肿瘤细胞虽然自身可以提呈肿瘤抗原，但其抗原提呈能力、特性与职业性APC的差异可能是一个值得深入研究的问题，有报告说，角朊细胞能有效刺激T细胞增生，但增生T细胞所产生的细胞因子与受职业性APC所诱导的活化T细胞不同，前者仅产生IL2，IL4，并不产生IFNγ[7]；另外，抗原提呈细胞的机能状态也是值得考虑的，有实验证明，紫外线UV-8照射动物可以使表皮郎罕氏细胞从免疫原性转为免疫耐受性[8]。(3)共刺激分子的机能存在差异。已知共刺激分子有十多种，其机能差异未彻底阐明，仅B7家庭中，就有B7.1，B7.2，B7.3(BB1)三种，其相应配体也有CD28和CTLA4，目前有实验证实B7.1主要诱导Th1细胞活化，而B7.2诱导Th2细胞活化[9]。B7与CD28分子结合后，可以传导提高IL2 mRNA稳定性、增强IL2分泌的信号，而CTLA4却是一个介导T细胞负反馈信号的分子[10]。(4)T细胞受体机能及Th细胞亚群机能。最近有不少关于TIL的TCR存在机能缺陷的报告[11]，同时，已知Th细胞不同亚群机能明显不同。妊娠免疫保护胎儿是早已熟知的事实，近年证实，位于母体胎儿界面上的浸润淋巴细胞主要为Th2细胞，它们产生大量IL-10具有有力的免疫抑制效应[7]。(5)肿瘤局部微环境可能也是肿瘤免疫反应最终结局的决定因素，肿瘤局部存在各种各样不同起源的免疫抑制细胞分子(包括肿瘤细胞产生的分子)早已为人所共知，并且还在不断得到证明。(6)最近，更有人报告黑素瘤细胞表达Fas L，已被考为黑素瘤逃逸免疫监视的机制之一[12]。总之，在长期进化中，肿瘤已发展了相当“完善”的多样化的逃逸免疫监视的机制。当然，只有这些机制被真正阐明之后，肿瘤的免疫治疗才不再是盲目的。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目(基金编号39472093)
第一作者简介 陈蕴颖，女，硕士，实习研究员。
参考文献
1 Townsend SE,Allison JP.Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ T cell by B7-transfected melanoma cells.Science,1993,259:368
2 宋建明，孙 毅，杨居详.PCR法用于探针的非同位素标记.西安医科大学学报，1996，8：107
3 Gruss HJ,Pinto A,Duyster J, et al.Hodgkin′s disease:a tumor with disturbed Immunological pathway.Immunol Today,1997,18(4):157
, 百拇医药
4 Bohlen H,Mazke O,Titzer, et al. Prevention of Epstein-Barr virus-induced human B cell lymphoma in severe combined immunodeficient mice treated with CD3×CD19 biospecific antibodies,CD28 monospecific antibodies,and autologous Tcells.Cancer Res,1997,57:1704
5 孙毅，陈蕴颖，司履生.共刺激分子B7.1在淋巴瘤组织中的表达.中华病理学杂志，1997，26(2)：23
6 Jager E,Ringhoffer M,Altanansberger M,et al. Immunoselection in vivo:Independent loss of MHC Ⅰ and melanocyte differentiation antigen expression inmetastatic melanoma.Int J Cancer,1997,71(2):142
, 百拇医药
7 Romagnani S.The Th1/Th2 paradigm.Immunol Today,1997,18(6):263
8 Nickoloff BJ,Turka LA.Immunological functions of non-professional antigen-presenting cells:new insight from studies of T-cell interactions with keratinocytes.Immunol Taday,1994,15:464
9 Krummel MF,Allison JP. CD28 and CTLA-4 have opposing effects on theresponse of T cells to stimulation.J Exp Med,1995,182(2):459
10 Walunas TL,Lenschow DJ,Bakker CY, et al. CTLA-4 can functions as a negativeregluator of T cell activation.Immunity,1994,1(5):405
, 百拇医药
11 Ludwig E,Van Den Hove,Van Gool SW, et al. Identification of an enriched CD+4 Cda++ CD8β T-cell subset among tumor infiltrating lymphocytes in human renal cell carcinoma.Int J Cancer,1997,71(2):178
12 Hahne M,Rimold D,Schroter M, et al. Melanoma cell expression of Fas(Apo-1/CD95)ligand implications for tumor immune escape.Science,1996,274(5291);1363
(收稿：1999-01-15), http://www.100md.com