脑肿瘤组织中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶表达的研究
作者：官 卫 黄强 龚德生 陈忠平 王爱东 周丽英
单位：苏州医学院附二院，苏州医学院神经科学研究所脑肿瘤研究室(苏州215004)；龚德生 苏州医学院附三院神经外科
关键词：脑肿瘤；O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶；化疗；耐药
肿瘤990406 目的 探讨O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)表达与脑肿瘤对氯乙基亚硝脲(CENUs)耐药的关系。 方法 采用Western blot方法检测59例不同类型脑肿瘤组织MGMT蛋白表达水平，对其中30例胶质瘤同时采用RT-PCR检测其MGMT mRNA表达水平，MGMT mRNA表达水平与MGMT活性进行相关分析。 结果 MGMT mRNA表达水平与MGMT活性正相关(r=0.911，P<0.01)，非胶质瘤及转移癌MGMT蛋白表达阳性率明显较胶质瘤高，分别为90%，78%，7%(P<0.05)；不同个体胶质瘤MGMT mRNA表达有较大异质性，范围为0～1.29，平均为0.5±0.37，Mer-率为37%；高、低级别星形细胞瘤MGMT mRNA表达无差异(0.47±0.36和0.44±0.34)；髓母细胞瘤有较高的MGMT mRNA表达水平(0.80)。 结论 胶质瘤MGMT总体水平较低，为此CENUs作为化疗首选药提供了新的理论依据；但半数以上胶质瘤为Mer+表型，提示对CENUs耐药，因而化疗前检测Mer表型以筛选Mer-个体进行化疗将进一步提高疗效。
, 百拇医药
STUDY ON EXPRESSION OF O6-METHYLGUANINE-DNA METHYLTRANSFERASE (MGMT) IN HUMAN BRAIN TUMORS
Guan Wei, Huang Qiang, Gong De-sheng, et al.
Second Affiliated Hospital, Suzhou Medical College, Suzhou 215004; *Third Affiliated Hospital, Suzhou Medical College, Changzhou 213003
Objective：To explore the relationship of the expression of MGMT with resistanceof brain tumors to CENU.Methods：The levels of MGMT protein expression in 59 brain tumors were determined by Western blot analysis, of which the MGMT mRNA of 30 gliomas was measured by the use of RT-PCR.Results：MGMT mRNA expression was well correlated with MGMT activity (r=0.911，P<0.01).The positive incidences of MGMT protein expression in non-gliomas and brain metastatic carcinomas were significantly higher than gliomas (98%, 78%, 7% respectively, P<0.05). The MGMT mRNA value of gliomas was 0.50±0.37 fmol/mg (mean±s). The incidence of Mer-status in gliomas was 37%. No difference was observed between high-grade astrocytomas and low-grade ones(0.47±0.36 vs 0.44±0.34). Medulloblastomas had a little higher MGMT mRNA level (0.8). Conclusion：Generally low level of MGMT expression in gliomas was a molecular basis for effective chloroethylnitrosourea (CENU) chemotherapy. A large fraction of gliomas were Mer+ indicating resistance to CENU. Screening Mer- tumors for selective chemotherapy with CENU may enhance clinical therapeutic effect.
, 百拇医药
Key words Brain tumor Chemotherapy MGMT Drug resistance
氯乙基亚硝脲(CENU)是脑肿瘤化疗首选药，然而目前其有效率仅30%～50%，除血脑屏障的影响外，耐药是有效化疗的重要障碍。体外及动物实验表明，O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)与CENUs耐药密切相关，MGMT活性高的肿瘤称Mer+型肿瘤，对CENUs耐药，MGMT活性低的肿瘤称Mer-型肿瘤，对CENUs敏感[1]。本研究从蛋白质活性、mRNA水平检测人脑肿瘤中MGMT的表达，以进一步探讨脑肿瘤中MGMT表达与对CENUs耐药的关系。
材料与方法
1.脑肿瘤59例中胶质瘤30例，脑膜瘤14例，脑转移癌9例，垂体瘤4例，脊索瘤及恶性淋巴瘤各1例。胶质瘤类型：星形细胞瘤27例，髓母细胞瘤2例，少枝胶质细胞瘤1例。星形细胞瘤中低级别瘤(WHOⅠ，Ⅱ)16例，高级别瘤(WHOⅢ，Ⅳ)11例。人脑胶质瘤细胞系：Mer+T98G由加拿大McGill大学医学研究所Panasci教授赠，Mer-SHG-44由本室建立[2]。
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2.分子生物学检测 蛋白免疫印迹按文献[3]、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)按文献[3，4]，MGMT活性测定按文献[5]进行。
结果
一、脑肿瘤中MGMT蛋白表达
胶质瘤中MGMT蛋白表达阳性率明显低于非胶质瘤及脑转移癌(见表1)。
表1 脑肿瘤中MGMT蛋白表达 标本类型
例数
MGMT阳性数
阳性率(%)
胶质瘤
, 百拇医药
30
2
7
非胶质瘤
20
18
90#
脑转移癌
9
7
78#
合计
59
, 百拇医药
27
46
#表示与胶质瘤比较，P<0.05
二、胶质瘤中MGMT mRNA表达
(一)Mer表型的确定
对部分MGMT mRNA表达不同的标本进行活性测定，发现两种方法的结果具有很好的相关性(r=0.911，P<0.01)，MGMT mRNA表达越高，其活性也越高(见附图)。根据活性测定，通常将MGMT活性≤50 fmol/mg蛋白的组织定为Mer-型组织，反之为Mer+型组织[6]。通过直线回归方程，求得50 fmol对应的MGMT mRNA表达值为0.29，因而本文将0.29作为Mer表型的临界值，MGMT mRNA表达值≤0.29者为Mer-组织，>0.29者为Mer+型组织。
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附图 MGMT mRNA表达与MGMT活性相关性
(二)胶质瘤MGMT mRNA定量结果(见表2、图2)
表2 胶质瘤中MGMT mRNA表达情况 标本类型
病例数
MGMT mRNA表达值
Mer-率(%)
1.星形细胞瘤
27
0.45±0.34
41
高级别星形细胞瘤
, 百拇医药
11
0.47±0.36
45
低级别星形细胞瘤
16
0.44±0.34
38
2.髓母细胞瘤
2
0.80
0
3.少枝胶质细胞瘤
1
, 百拇医药
1.29
0
合计
30
0.50±0.37
37
不同胶质瘤MGMT mRNA表达存在异质性(0～1.29)，Mer-者占37%，其中完全缺乏表达(mRNA值=0)为10%；星形细胞瘤中不同级别间MGMT mRNA表达无明显差异(P>0.05)，髓母细胞瘤及少枝胶质细胞瘤MGMT mRNA表达水平较高。
讨论
CENUs能在体内分解产生氯乙基偶氮离子，作用于DNA形成O6-氯乙基鸟嘌呤，进一步与互补DNA形成交联，影响DNA复制，从而杀伤肿瘤细胞。MGMT是DNA损伤后修复系统中的重要成员，能将鸟嘌呤氧六位的烷化基团转移至自身的半胱氨酸残基上，使烷基化DNA修复，同时其自身失活，因而MGMT在肿瘤对CENUs耐药中起重要作用[1]。大量体外及动物实验表明，Mer+肿瘤对CENUs耐药，而Mer-肿瘤则表现为敏感。最近两位学者[7，8]通过临床观察也发现脑肿瘤患者对ACNU、BCNU化疗的反应与其肿瘤Mer状态有关，肿瘤中MGMT表达低的患者比高表达患者化疗更敏感，因而认为检测肿瘤MGMT水平对预测CENUs对脑肿瘤的化疗效果有重要意义。
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作者曾报道，Mer+肿瘤细胞较Mer-细胞对CENUs耐药性明显高，而且通过抑制MGMT活性明显提高了Mer+胶质瘤细胞对BCNU的敏感性，说明肿瘤细胞MGMT表达与其对CENUs耐药密切相关。作者对不同类型肿瘤中MGMT蛋白及基因表达水平进行了研究。
采用Western blot法表明，神经上皮细胞起源的胶质瘤MGMT水平明显较脑膜瘤、垂体瘤、脑转移癌低，提示胶质瘤细胞对CENUs的敏感性较其它几类肿瘤高，该结果符合临床应用CENUs治疗不同脑肿瘤疗效的观察，同时为以CENUs作为胶质瘤一线化疗药提供了新的理论依据；非胶质瘤如脑膜瘤、垂体瘤由于其相对较低的细胞增殖率而不常规使用化疗，而较高的MGMT表达水平也提示这类肿瘤对CENUs不敏感，脑转移癌来源于肺癌、乳腺癌，其MGMT水平反映了原发灶的Mer状态，肺癌、乳腺癌中MGMT含量常较高[9，10]与本文的结果相符。由于脑转移癌中有22%的低表达，因而部分患者可能对CENUs化疗敏感。
, 百拇医药
用Western blot法检测脑肿瘤MGMT蛋白表达目前尚未见报道，由于脑胶质瘤MGMT总体水平低，且所使用单抗的敏感性有待提高，影响了该方法用于脑胶质瘤的检测。作者用此法虽然得出了胶质瘤中MGMT蛋白表达低的结果，进一步RT-PCR法对胶质瘤MGMT mRNA表达水平进行检测。结果见30例胶质瘤中有37%为Mer-，表明有相当一部分胶质瘤患者可能由于MGMT缺乏或低表达，对CENUs有较高的敏感性；另外，2例髓母细胞瘤具有较高的MGMT表达，与其它几位学者研究结果相符[7，10]，提示髓母细胞瘤对CENUs可能不敏感。总之，化疗前检测脑肿瘤MGMT水平，预测化疗敏感性，对指导临床化疗可能具有一定的价值。
第一作者简介 官 卫，男，硕士。
参考文献
1 Pegg AE. Mammalian O6 -alkylguanine-DNA alkyltransferase: regulation and importance in response to alkylating carcinogenic and therapeutic agents. Cancer Res, 1990， 50:6199
, http://www.100md.com
2 杜子威，徐庚达，王尧等.人脑恶性胶质瘤体外细胞系SHG-44的建立及其特.中华肿瘤杂志，1984，6：241
3 Mineura K, Watanabe K, Yanagisawa T, et al. Quantification of O6-methylguanine-DNA methyltransferase mRNA in human brain tumors. Biochim Biophys Acta, 1996，1289:105
4 Chen ZP, Malapetsa A, Mohr G, et al. Quantitation of ERCC-2 gene expression in human tumor cell lines by reverse transcription-polymerase chain reaction in comparison to Northern blot analysis. Anal Biochem, 1997，244:50
, 百拇医药
5 Myrnes B, Norstrand K, Giercksky KE, et al. A simplified assay for O6-methylguanine-DNA methyltransferase activity and its application to human neoplastic and non-neoplastic tissue. Carcinogenesis, 1984，5:1061
6 Mineura K, Izumi I, Watanabe K, et al. Influence of O6-methylguanine-DNA methyltransferase activity on CENU chemotherapy in brain tumors. Int J Cancer, 1993， 55:76
7 Mineura K, Yanagisawa T, Watanabe K, et al. Human brain tumor O6-methylguanine-DNA methyltransferase mRNA and its significance as an indicator of selective chloroethylnitrosourea chemotherapy. Int J Cancer, 1996，69(5):420
, http://www.100md.com
8 Belanich M, Paster M, Randau T, et al. Retrospective study of the correlationbetween the DNA repair protein alkyltransferase and survival of brain tumor patients with carmustine. Cancer Res, 1996，56:783
9 Cehn JM, Zhang YP, Wang C, et al. O6-methylguanine-DNA methyltransferase activity in human tumors. Carcinogenesis, 1992。13:1503
10 Preuss I, Eberhagen I, Haas, et al. O6-methylguanine-DNA methyltransferase activity in breast and brain tumors. Int J Cancer, 1995，61:321
(收稿：1998-12-14), 百拇医药
单位：苏州医学院附二院，苏州医学院神经科学研究所脑肿瘤研究室(苏州215004)；龚德生 苏州医学院附三院神经外科
关键词：脑肿瘤；O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶；化疗；耐药
肿瘤990406 目的 探讨O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)表达与脑肿瘤对氯乙基亚硝脲(CENUs)耐药的关系。 方法 采用Western blot方法检测59例不同类型脑肿瘤组织MGMT蛋白表达水平，对其中30例胶质瘤同时采用RT-PCR检测其MGMT mRNA表达水平，MGMT mRNA表达水平与MGMT活性进行相关分析。 结果 MGMT mRNA表达水平与MGMT活性正相关(r=0.911，P<0.01)，非胶质瘤及转移癌MGMT蛋白表达阳性率明显较胶质瘤高，分别为90%，78%，7%(P<0.05)；不同个体胶质瘤MGMT mRNA表达有较大异质性，范围为0～1.29，平均为0.5±0.37，Mer-率为37%；高、低级别星形细胞瘤MGMT mRNA表达无差异(0.47±0.36和0.44±0.34)；髓母细胞瘤有较高的MGMT mRNA表达水平(0.80)。 结论 胶质瘤MGMT总体水平较低，为此CENUs作为化疗首选药提供了新的理论依据；但半数以上胶质瘤为Mer+表型，提示对CENUs耐药，因而化疗前检测Mer表型以筛选Mer-个体进行化疗将进一步提高疗效。
, 百拇医药
STUDY ON EXPRESSION OF O6-METHYLGUANINE-DNA METHYLTRANSFERASE (MGMT) IN HUMAN BRAIN TUMORS
Guan Wei, Huang Qiang, Gong De-sheng, et al.
Second Affiliated Hospital, Suzhou Medical College, Suzhou 215004; *Third Affiliated Hospital, Suzhou Medical College, Changzhou 213003
Objective：To explore the relationship of the expression of MGMT with resistanceof brain tumors to CENU.Methods：The levels of MGMT protein expression in 59 brain tumors were determined by Western blot analysis, of which the MGMT mRNA of 30 gliomas was measured by the use of RT-PCR.Results：MGMT mRNA expression was well correlated with MGMT activity (r=0.911，P<0.01).The positive incidences of MGMT protein expression in non-gliomas and brain metastatic carcinomas were significantly higher than gliomas (98%, 78%, 7% respectively, P<0.05). The MGMT mRNA value of gliomas was 0.50±0.37 fmol/mg (mean±s). The incidence of Mer-status in gliomas was 37%. No difference was observed between high-grade astrocytomas and low-grade ones(0.47±0.36 vs 0.44±0.34). Medulloblastomas had a little higher MGMT mRNA level (0.8). Conclusion：Generally low level of MGMT expression in gliomas was a molecular basis for effective chloroethylnitrosourea (CENU) chemotherapy. A large fraction of gliomas were Mer+ indicating resistance to CENU. Screening Mer- tumors for selective chemotherapy with CENU may enhance clinical therapeutic effect.
, 百拇医药
Key words Brain tumor Chemotherapy MGMT Drug resistance
氯乙基亚硝脲(CENU)是脑肿瘤化疗首选药，然而目前其有效率仅30%～50%，除血脑屏障的影响外，耐药是有效化疗的重要障碍。体外及动物实验表明，O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)与CENUs耐药密切相关，MGMT活性高的肿瘤称Mer+型肿瘤，对CENUs耐药，MGMT活性低的肿瘤称Mer-型肿瘤，对CENUs敏感[1]。本研究从蛋白质活性、mRNA水平检测人脑肿瘤中MGMT的表达，以进一步探讨脑肿瘤中MGMT表达与对CENUs耐药的关系。
材料与方法
1.脑肿瘤59例中胶质瘤30例，脑膜瘤14例，脑转移癌9例，垂体瘤4例，脊索瘤及恶性淋巴瘤各1例。胶质瘤类型：星形细胞瘤27例，髓母细胞瘤2例，少枝胶质细胞瘤1例。星形细胞瘤中低级别瘤(WHOⅠ，Ⅱ)16例，高级别瘤(WHOⅢ，Ⅳ)11例。人脑胶质瘤细胞系：Mer+T98G由加拿大McGill大学医学研究所Panasci教授赠，Mer-SHG-44由本室建立[2]。
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2.分子生物学检测 蛋白免疫印迹按文献[3]、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)按文献[3，4]，MGMT活性测定按文献[5]进行。
结果
一、脑肿瘤中MGMT蛋白表达
胶质瘤中MGMT蛋白表达阳性率明显低于非胶质瘤及脑转移癌(见表1)。
表1 脑肿瘤中MGMT蛋白表达 标本类型
例数
MGMT阳性数
阳性率(%)
胶质瘤
, 百拇医药
30
2
7
非胶质瘤
20
18
90#
脑转移癌
9
7
78#
合计
59
, 百拇医药
27
46
#表示与胶质瘤比较，P<0.05
二、胶质瘤中MGMT mRNA表达
(一)Mer表型的确定
对部分MGMT mRNA表达不同的标本进行活性测定，发现两种方法的结果具有很好的相关性(r=0.911，P<0.01)，MGMT mRNA表达越高，其活性也越高(见附图)。根据活性测定，通常将MGMT活性≤50 fmol/mg蛋白的组织定为Mer-型组织，反之为Mer+型组织[6]。通过直线回归方程，求得50 fmol对应的MGMT mRNA表达值为0.29，因而本文将0.29作为Mer表型的临界值，MGMT mRNA表达值≤0.29者为Mer-组织，>0.29者为Mer+型组织。
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附图 MGMT mRNA表达与MGMT活性相关性
(二)胶质瘤MGMT mRNA定量结果(见表2、图2)
表2 胶质瘤中MGMT mRNA表达情况 标本类型
病例数
MGMT mRNA表达值
Mer-率(%)
1.星形细胞瘤
27
0.45±0.34
41
高级别星形细胞瘤
, 百拇医药
11
0.47±0.36
45
低级别星形细胞瘤
16
0.44±0.34
38
2.髓母细胞瘤
2
0.80
0
3.少枝胶质细胞瘤
1
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1.29
0
合计
30
0.50±0.37
37
不同胶质瘤MGMT mRNA表达存在异质性(0～1.29)，Mer-者占37%，其中完全缺乏表达(mRNA值=0)为10%；星形细胞瘤中不同级别间MGMT mRNA表达无明显差异(P>0.05)，髓母细胞瘤及少枝胶质细胞瘤MGMT mRNA表达水平较高。
讨论
CENUs能在体内分解产生氯乙基偶氮离子，作用于DNA形成O6-氯乙基鸟嘌呤，进一步与互补DNA形成交联，影响DNA复制，从而杀伤肿瘤细胞。MGMT是DNA损伤后修复系统中的重要成员，能将鸟嘌呤氧六位的烷化基团转移至自身的半胱氨酸残基上，使烷基化DNA修复，同时其自身失活，因而MGMT在肿瘤对CENUs耐药中起重要作用[1]。大量体外及动物实验表明，Mer+肿瘤对CENUs耐药，而Mer-肿瘤则表现为敏感。最近两位学者[7，8]通过临床观察也发现脑肿瘤患者对ACNU、BCNU化疗的反应与其肿瘤Mer状态有关，肿瘤中MGMT表达低的患者比高表达患者化疗更敏感，因而认为检测肿瘤MGMT水平对预测CENUs对脑肿瘤的化疗效果有重要意义。
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作者曾报道，Mer+肿瘤细胞较Mer-细胞对CENUs耐药性明显高，而且通过抑制MGMT活性明显提高了Mer+胶质瘤细胞对BCNU的敏感性，说明肿瘤细胞MGMT表达与其对CENUs耐药密切相关。作者对不同类型肿瘤中MGMT蛋白及基因表达水平进行了研究。
采用Western blot法表明，神经上皮细胞起源的胶质瘤MGMT水平明显较脑膜瘤、垂体瘤、脑转移癌低，提示胶质瘤细胞对CENUs的敏感性较其它几类肿瘤高，该结果符合临床应用CENUs治疗不同脑肿瘤疗效的观察，同时为以CENUs作为胶质瘤一线化疗药提供了新的理论依据；非胶质瘤如脑膜瘤、垂体瘤由于其相对较低的细胞增殖率而不常规使用化疗，而较高的MGMT表达水平也提示这类肿瘤对CENUs不敏感，脑转移癌来源于肺癌、乳腺癌，其MGMT水平反映了原发灶的Mer状态，肺癌、乳腺癌中MGMT含量常较高[9，10]与本文的结果相符。由于脑转移癌中有22%的低表达，因而部分患者可能对CENUs化疗敏感。
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用Western blot法检测脑肿瘤MGMT蛋白表达目前尚未见报道，由于脑胶质瘤MGMT总体水平低，且所使用单抗的敏感性有待提高，影响了该方法用于脑胶质瘤的检测。作者用此法虽然得出了胶质瘤中MGMT蛋白表达低的结果，进一步RT-PCR法对胶质瘤MGMT mRNA表达水平进行检测。结果见30例胶质瘤中有37%为Mer-，表明有相当一部分胶质瘤患者可能由于MGMT缺乏或低表达，对CENUs有较高的敏感性；另外，2例髓母细胞瘤具有较高的MGMT表达，与其它几位学者研究结果相符[7，10]，提示髓母细胞瘤对CENUs可能不敏感。总之，化疗前检测脑肿瘤MGMT水平，预测化疗敏感性，对指导临床化疗可能具有一定的价值。
第一作者简介 官 卫，男，硕士。
参考文献
1 Pegg AE. Mammalian O6 -alkylguanine-DNA alkyltransferase: regulation and importance in response to alkylating carcinogenic and therapeutic agents. Cancer Res, 1990， 50:6199
, http://www.100md.com
2 杜子威，徐庚达，王尧等.人脑恶性胶质瘤体外细胞系SHG-44的建立及其特.中华肿瘤杂志，1984，6：241
3 Mineura K, Watanabe K, Yanagisawa T, et al. Quantification of O6-methylguanine-DNA methyltransferase mRNA in human brain tumors. Biochim Biophys Acta, 1996，1289:105
4 Chen ZP, Malapetsa A, Mohr G, et al. Quantitation of ERCC-2 gene expression in human tumor cell lines by reverse transcription-polymerase chain reaction in comparison to Northern blot analysis. Anal Biochem, 1997，244:50
, 百拇医药
5 Myrnes B, Norstrand K, Giercksky KE, et al. A simplified assay for O6-methylguanine-DNA methyltransferase activity and its application to human neoplastic and non-neoplastic tissue. Carcinogenesis, 1984，5:1061
6 Mineura K, Izumi I, Watanabe K, et al. Influence of O6-methylguanine-DNA methyltransferase activity on CENU chemotherapy in brain tumors. Int J Cancer, 1993， 55:76
7 Mineura K, Yanagisawa T, Watanabe K, et al. Human brain tumor O6-methylguanine-DNA methyltransferase mRNA and its significance as an indicator of selective chloroethylnitrosourea chemotherapy. Int J Cancer, 1996，69(5):420
, http://www.100md.com
8 Belanich M, Paster M, Randau T, et al. Retrospective study of the correlationbetween the DNA repair protein alkyltransferase and survival of brain tumor patients with carmustine. Cancer Res, 1996，56:783
9 Cehn JM, Zhang YP, Wang C, et al. O6-methylguanine-DNA methyltransferase activity in human tumors. Carcinogenesis, 1992。13:1503
10 Preuss I, Eberhagen I, Haas, et al. O6-methylguanine-DNA methyltransferase activity in breast and brain tumors. Int J Cancer, 1995，61:321
(收稿：1998-12-14), 百拇医药