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编号:10277681
肝与肝癌基因表达谱差异的研究
http://www.100md.com 《肿瘤》 1999年第4期

     作者:赵新泰 何英华 黄戈 张萍萍 万大方 蒋惠秋 顾健人

    单位:上海市肿瘤研究所(上海 200032)

    关键词:肝肿瘤;Microarray;表达差异克隆;信使RNA杂交

    肿瘤990402 目的 筛选肝癌与正常肝基因表达差异克隆。 方法 应用Microarray膜片分别与肝癌和正常肝组织mRNA进行杂交,比较杂交信号,获得表达差异克隆。 结果 在正常肝中共有990个基因表达,其中255个较高表达。425个cDNA克隆在正常肝中的表达高于肝癌,其中33个有较大差异。190个cDNA克隆在肝癌中的表达高于正常肝,其中60个有较大差异。在这些差异克隆中,鉴定出有些是已被他人证实在其它癌中有差异的已知基因。 结论 应用大规模筛选表达差异的Microarray方法,获得了肝与肝癌表达差异的基因克隆。

    DIFFERENCE OF GENE EXPRESSION PROFILE IN NORMAL LIVER AND HEPATOMA

    Zhao Xintai,He Yinghua,Huang Yi, et al.Shanghai Cancer Institute,Shanghai 200032

    Objective:To screen for the gene clones with differential expression in normal liver and hepatoma.Methods:By means of hybridization of genes on microarray membrane with normal liver mRNA or hepatoma mRNA respectively,and by comparing hybridization signals on membrane genes,the differential expression genes were identified.Results:990 out of 18 376 cDNA clones on membrane expressed in normal liver, and 255 expressed in higher level.425 cDNA clones expressed in higher level in normal liver than in hepatoma,and 33 of them showed obvious difference.The expression of 190 cNDA clones in hepatoma was higher than in normal liver,60 of then showed marked difference. Among these differential expression genes,some of them had been identified by others as known differential genes in other cnacers.Conclusion:The differential expressed clones among normal liver and hepatoma were obtained by microarray method.

    Key words Hepatoma Microarray Differential expressed clone mRNA hybridization

    肝癌是我国高发癌症之一,但目前对其涉及的相关基因和发病机理尚不十分清楚。过去人们也研究了一些基因在肝癌中的变化,但采取的方法基本上是对单纯的或少量的基因进行研究。本实验室采有新近发展的microarray膜片同时对大量的cDNA克隆进行表达谱分析,筛选出在肝癌中表达差异的基因克隆,为进一步研究相关基因功能提供候选者。

    材料与方法

    1.cDNA克隆膜片 购自Genome Systems公司。膜片上点有18 376个不重复的人cDNA克隆。

    2.正常肝及肝癌样本 正常肝取自急性死亡人无病变正常肝组织。肝癌样本取自肝癌病人手术切除的肝癌组织,均立即置于液氮中,-70℃保存。

    3.组织mRNA的制备 采用异硫氰酸胍法[1]提取组织总RNA,oligo(dT)纤维素层析法分离mRNA。

    4.杂交探针的制备

    (1)DNA排列方向标记物探针的制备 取膜片中附带的DNA排列方向标记物25 ng,按随机引物标记kit说明书,用α-32P dCTP进行标记,过Sephadex G50柱除去游离的同位素。

    (2)对照RNA探针的制备 取膜片中附带的对照RNA样品8 μl,进行反转录。按上述标记法进行对照RNA探针的制备。

    (3)肝与肝癌mRNA探针的制备 分别取0.2 μg正常肝和几份肝癌组织混合mRNA,进行反转录,按上述标记法进行探针的制备。

    5.cDNA克隆膜片的杂交 在两个杂交瓶中分别加入10 ml预杂交液,放入膜片,42℃预杂交4 h。更换预杂交液,分别加入一半DNA排列方向标记物探针,一半对照RNA探针。一个瓶中加入肝mRNA探针,另一瓶中加入肝癌mRNA探针,42℃杂交16h,洗膜。用磷屏成像系统(Bio-Rad)获得图像文件,传输给Genome Systems公司,进行分析。同时压片,获得放射自显影片。

    6.杂交结果分析

    传输给Genome Systems公司的图像文件,据称图象在他们的计算机上是反相的,无法分析。在这种情况下,通过人工对放射自显影片进行比较分析。首先根据两张膜片上内部参照RNA杂交信号,分别将两张膜片上的放射自显影斑点分为8个等级(1,2,3,4,5,6,7,8),对应斑点相互比较后,获得有差异的克隆。对有差异的cDNA克隆,通过网点http://www.genomesystems.com下的“鉴定膜片上的克隆”工具获得它的基因号码,从Genbank中获得序列,与Genbank比较,筛选出已知和未知基因。

    结果

    1.膜片上cDNA克隆在肝中的表达状况

    膜片上共点有18 376个不重复的人cDNA克隆,膜片经与正常肝cDNA探针杂交后,在可检测的灵敏度范围内,共有990个cDNA在肝中有表达(见插页第3页图1A)。其中21个高表达,234个中度表达,735个低表达。

    图1 Microarray膜片肝和肝癌mRNA杂交、放射自显影图

    A:正常肝mRNA探针杂交结果

    B:肝癌mRNA探针杂交结果

    2.正常肝与肝癌的表达差异

    两张膜片分别与正常肝和肝癌cDNA探针杂交后,放射自显影获得杂交结果(见插页第3页图1),对应的斑点相互比较后,确定表达差异的克隆

    (1)肝癌中高于正常肝中表达的cDNA克隆

    分析后,共有190个cDNA克隆在肝癌中的表达高于正常肝。其中11个有最大差异,49个有较大差异,32个有中度差异,98个有较小差异。将这些差异克隆的序列与Genbank比较,发现在最大和较大差异克隆中,有42个新基因,17个已知基因,附表列出了部分已知基因。

    (2)正常肝中高于肝癌中表达的cDNA克隆

    分析后,共有425个cDNA克隆在正常肝中的表达高于肝癌。其中5个有最大差异,28个有较大差异,102个有中度差异,290个有较小差异。将这些差异克隆的序列与Genbank比较,发现在最大和较大差异克隆中,有23个新基因,10个已知基因,附表列出了部分已知基因。

    附表 肝与肝癌表达差异中的已知基因克隆

    肝癌中高于正常肝中表达的已知基因克隆:

    1.人蛋白酶激活的受体3基因

    2.肝癌衍生的生长因子(人转化相关蛋白)基因

    3.人错配修复基因同源物(hPMS2)基因

    4.人胰岛素生长因子Ⅱ基因

    5.人钙调素基因

    6.人金属蛋白酶3组织抑制物基因

    7.人胞外蛋白酶抑制同源物HE4基因

    8.人hnRNP-E2基因

    9.谷胱甘肽过氧化物酶基因

    10.人PTMS和LAG-3基因

    11.人Wilm氏癌相关蛋白基因

    12.人Gα-q(Gag)基因

    13.AP-2转录因子基因

    正常肝中高于肝癌中表达的已知基因克隆:

    1.人H326基因

    2.人p53结合蛋白mdm2基因

    3.人谷氨酸/丝氨酸蛋白激酶基因

    4.人Semaphorin基因

    5.人XRP2基因

    讨论

    本试验应用Microarray 膜片对18 376个不重复的cDNA克隆在肝及肝癌中的表达状况进行了研究。结果获得了这些基因在肝中的表达谱,以及在肝和肝癌中表达差异的基因克隆。有些已知的基因克隆,如肝癌衍生生长因子、人胰岛素样生长因子,在本次实验中发现在肝癌中的表达明显高于正常肝。这与Nakamura等[2]和周筱梅等[3]的结果是一致的。同时,也发现人错配修复同源基因(hPMS2)在肝癌中的表达明显高于正常肝。这可能是由于在肝癌中错配高频率地发生诱导了hPMS2的高表达。有些已知基因,如人Semaphorin基因在正常肝中的表达高于肝癌。这个基因已发现在肺癌中低表达,它位于染色体3P21.3,这个区域在肺癌中有高频率的纯合子缺失[4],也发现一个人与酵母蛋白激酶Yak1同源的色氨酸/丝氨酸蛋白激酶[5]在正常肝中的表达高于肝癌。这些结果都表明了本实验中大规模筛选方法的可信度较高。

    第一作者简介 赵新泰,男,博士,副研究员。

    *上海生命科学研究中心联系实验室

    参考文献

    1 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T,Molecular Cloning-A laboratory Manual.2th ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA,1989;7.23

    2 Nakamura H.Izumoto Y.Kambe H, et al. Molecular cloning of complemetary DNA for a novel human hepatoma-derived growth factor:Its homology with high mobility group 1 protein.J Biol Chem,1994,269(40):25143

    3 周筱梅,陈渊卿,钱莲芳,等.人胰岛素样生长因子受体及其生长因子在原发性肝癌中同时过量表达.肿瘤,1991,11(6):241

    4 Roche J,Boldog F,Robinson M,et al. Distinct 3p21.3 deletions in lung cancer and identification of a new human semaphorin.Oncogene,1996,12(6):1289

    5 Begley DA.Berkenpus MB.Sanpson KE, et al. Identification and sequence of human PKY,a putative kinase with increased expression in multidrug-resistant cells,with homology to yeast protein kinase Yak1.Gene,1997,200(1-2):35

    (收稿:1999-03-24), http://www.100md.com
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