重组人Endostatin/MBP 融合蛋白的体内外抗肿瘤作用研究
作者：樊燕蓉 徐根兴 刘新卷 汪振诚 傅更锋
单位：樊燕蓉 徐根兴 刘新卷 汪振诚 傅更锋(第二军医大学南京军医学院分子医学研究所 南京 210099)
关键词：Endostatin；融合蛋白；抗肿瘤
中国肿瘤生物治疗杂志000223
《中国图书资料分类法》分类号 R730.59
血管生成是实体肿瘤生长和转移的必要条件，新生血管为异常增殖的肿瘤细胞提供充足的营养。为了刺激血管生成，肿瘤分泌一系列促血管生长因子，如成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)等，新近研究发现，许多恶性肿瘤还可产生血管生成抑制因子，如血小板因子4(PF4)、凝血栓蛋白、Angiostatin[1]和Endostatin[2]等。越来越多的实验表明，血管生成是受血管刺激因子和抑制因子的网络来调节的，肿瘤生长是在血管生长因子和抑制因子失衡情况下血管大量再生而引起的。我国徐根兴等也在研究内皮细胞过程中发现了Endostatin，并从人肝脏cDNA文库中筛选克隆得到人Endostatin基因[3]，由于Endostatin难溶，因此,我们采用E.coli表达的重组人 Endoststin/MBP融合蛋白研究其体外抗肿瘤效应, 为其进一步应用于临床治疗打基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
牛肾上腺髓质毛细血管内皮细胞株，来自美国纽约大学医学院。人Lewis肺癌细胞株购自中科院上海药物研究所。 C57B16/J小鼠购自上海医科大学实验动物部。细胞培养基购自GIBCO/BRL公司。
1.2 方法
1.2.1 rhEndostatin/MBP体外抑制血管内皮细胞增殖实验
将内皮细胞以2.5×104/孔密度加到24孔培养板中，37℃，10%CO2孵箱中培养24 h后，用0.25 ml DMEM (含5%BCS+1%GPS)换液，加入待测样品(不同剂量的rhEndostatin/MBP和对照物MBP)孵育20 min后，再补足培养基并加入bFGF，使其终体积达0.5 ml DMEM (含5%BCS+1%GPS+1 ng/ml bFGF)，37℃,10%CO2孵育72 h后，收集细胞计数。
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1.2.2 rhEndostatin体外抑制血管生成的鸡胚绒毛尿膜囊(CAM)实验
将浓度为2.5 mg/ml的rhEndostatin/MBP溶液10 μl滴加在孵育8 d的鸡胚绒毛尿囊膜上的甲基纤维素小碟内，并以同等体积的生理盐水和bFGF(1 μg/ml)为试剂对照和阳性对照，37℃孵育3 d取膜，照相并制作标本，并在解剖显微镜下计数血管条数，用图象分析仪定量分析血管密度。
1.2.3 rhEndostatin/MBP抗Lewis肺癌实验
小鼠背部皮下注射Lewis肺癌细胞(1×106细胞，共0.1 ml)。以两脚规测量肿瘤长、宽，肿瘤体积以V=宽2×长×0.52(mm3)计算，肿瘤细胞种植约10 d后肿瘤体积达200 mm3，小鼠随机分2组，治疗组每天以6.5 mg/kg rhEndostatin/MBP远离肿瘤的背部皮下注射，对照组注射相同体积的生理盐水，共治疗15 d。
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2 结果与讨论
2.1 rhEndostatin/MBP在体外抑制血管内皮细胞增殖
由图1中可看出，MBP 对照组对内皮细胞无抑制作用，说明rhEndostatin/MBP中的生物活性是Endostatin产生的，rhEndostatin/MBP在1 μg/ml时就明显抑制内皮细胞增殖，剂量越大，抑制效应越明显。
表1 不同物质对CAM血管的促进生长作用 样品
n
一级血管数
二级血管数
血管面积(mm2)
血管积分光密度
, http://www.100md.com
bFGF
7
12.57±1.57
31.14±2.04
32.70±8.47
379692.1±94402.8
rhEndostatin/MBP
7
3.86±0.69△
11.00±1.63△
5.81±2.25△
, 百拇医药
70024.5±24899.9△
0.9%NS
7
7.71±0.76
19.29±3.59
18.42±6.29
219756.9±71945.8
注：△ 与生理盐水组比较 P<0.01; 窗口面积65 mm2
图1 rhEndostatin/MBP抑制血管内皮细胞增殖
, http://www.100md.com
图2 rhEndostatin抑制肿瘤生长
2.2 rhEndostatin/MBP体外抑制血管生成的CAM实验
表1所示，与生理盐水组比较，rhEndostatin/MBP可显著抑制CAM一级血管，二级血管生成(P<0.01)；与阳性对照(bFGF)相比，rhEndostatin/MBP减少为bFGF组CAM一级血管数约1/3、二级血管数1/3。采用图象分析仪对标本进行定量分析发现rhEndostatin/MBP无论是血管面积，血管积分光密度均与生理盐水组有显著差异(P<0.01)，另外在整个实验过程中未发现rhEndostatin/MBP有毒副反应。
2.3 rhEndostatin/MBP抑制原发肿瘤的生长
当肿瘤体积为200 mm3(约1%体重)时开始治疗，由图2中可见，Lewis肺癌的生长被抑制，到15 d时肿瘤的生长被抑制达48%，存在时一效关系。
, http://www.100md.com
研制和开发抗肿瘤药物一直是国内外的热门话题，传统的化疗、放疗针对的是异常增殖的肿瘤细胞，由于肿瘤细胞的基因具不稳定性、异质性及高突变率等特性，因而常导致产生耐药性，并且此种疗法具有较大的毒副作用。我们的实验结果显示，Endostatin作为胶原蛋白十八C末端片断，rhEndostatin/MBP融合蛋白在体外可抑制内皮细胞增殖，因而可阻断肿瘤组织中新血管的生成，切断肿瘤的营养供给而不产生耐药性，在肿瘤治疗中显示了广泛的前景。Endostatin的研究结果提示我们，对于肿瘤病人的治疗可以从两方面考虑:即内皮细胞和肿瘤细胞，由于一种细胞可能对另一种细胞的生长有刺激作用，每种细胞的生长又可选择性或特异性地被外来物质抑制，所以复合治疗效果可能更好，Endostatin 可被用于辅助常规的抗癌疗法如手术、放疗、化疗或免疫疗法，而且由于它不会诱发获得性耐药性，可作为一种维持疗法而长期使用。
本课题受海后卫字基金(983301)资助
参 考 文 献
, 百拇医药
1，O'Reilly MS, Holmgren L, Shing Y, et al. Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell, 1994, 79： 315
2，O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 1997, 88： 277
3，徐根兴， 任敏东， 许 琳. 一种人实体肿瘤血管内皮细胞增殖抑制因子的血管再生治疗中的应用. 发明专利公告， 1998， 14(12)： 45，CN//77005A
(1999-04-12收稿； 1999-07-19修回), 百拇医药
单位：樊燕蓉 徐根兴 刘新卷 汪振诚 傅更锋(第二军医大学南京军医学院分子医学研究所 南京 210099)
关键词：Endostatin；融合蛋白；抗肿瘤
中国肿瘤生物治疗杂志000223
《中国图书资料分类法》分类号 R730.59
血管生成是实体肿瘤生长和转移的必要条件，新生血管为异常增殖的肿瘤细胞提供充足的营养。为了刺激血管生成，肿瘤分泌一系列促血管生长因子，如成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)等，新近研究发现，许多恶性肿瘤还可产生血管生成抑制因子，如血小板因子4(PF4)、凝血栓蛋白、Angiostatin[1]和Endostatin[2]等。越来越多的实验表明，血管生成是受血管刺激因子和抑制因子的网络来调节的，肿瘤生长是在血管生长因子和抑制因子失衡情况下血管大量再生而引起的。我国徐根兴等也在研究内皮细胞过程中发现了Endostatin，并从人肝脏cDNA文库中筛选克隆得到人Endostatin基因[3]，由于Endostatin难溶，因此,我们采用E.coli表达的重组人 Endoststin/MBP融合蛋白研究其体外抗肿瘤效应, 为其进一步应用于临床治疗打基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
牛肾上腺髓质毛细血管内皮细胞株，来自美国纽约大学医学院。人Lewis肺癌细胞株购自中科院上海药物研究所。 C57B16/J小鼠购自上海医科大学实验动物部。细胞培养基购自GIBCO/BRL公司。
1.2 方法
1.2.1 rhEndostatin/MBP体外抑制血管内皮细胞增殖实验
将内皮细胞以2.5×104/孔密度加到24孔培养板中，37℃，10%CO2孵箱中培养24 h后，用0.25 ml DMEM (含5%BCS+1%GPS)换液，加入待测样品(不同剂量的rhEndostatin/MBP和对照物MBP)孵育20 min后，再补足培养基并加入bFGF，使其终体积达0.5 ml DMEM (含5%BCS+1%GPS+1 ng/ml bFGF)，37℃,10%CO2孵育72 h后，收集细胞计数。
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1.2.2 rhEndostatin体外抑制血管生成的鸡胚绒毛尿膜囊(CAM)实验
将浓度为2.5 mg/ml的rhEndostatin/MBP溶液10 μl滴加在孵育8 d的鸡胚绒毛尿囊膜上的甲基纤维素小碟内，并以同等体积的生理盐水和bFGF(1 μg/ml)为试剂对照和阳性对照，37℃孵育3 d取膜，照相并制作标本，并在解剖显微镜下计数血管条数，用图象分析仪定量分析血管密度。
1.2.3 rhEndostatin/MBP抗Lewis肺癌实验
小鼠背部皮下注射Lewis肺癌细胞(1×106细胞，共0.1 ml)。以两脚规测量肿瘤长、宽，肿瘤体积以V=宽2×长×0.52(mm3)计算，肿瘤细胞种植约10 d后肿瘤体积达200 mm3，小鼠随机分2组，治疗组每天以6.5 mg/kg rhEndostatin/MBP远离肿瘤的背部皮下注射，对照组注射相同体积的生理盐水，共治疗15 d。
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2 结果与讨论
2.1 rhEndostatin/MBP在体外抑制血管内皮细胞增殖
由图1中可看出，MBP 对照组对内皮细胞无抑制作用，说明rhEndostatin/MBP中的生物活性是Endostatin产生的，rhEndostatin/MBP在1 μg/ml时就明显抑制内皮细胞增殖，剂量越大，抑制效应越明显。
表1 不同物质对CAM血管的促进生长作用 样品
n
一级血管数
二级血管数
血管面积(mm2)
血管积分光密度
, http://www.100md.com
bFGF
7
12.57±1.57
31.14±2.04
32.70±8.47
379692.1±94402.8
rhEndostatin/MBP
7
3.86±0.69△
11.00±1.63△
5.81±2.25△
, 百拇医药
70024.5±24899.9△
0.9%NS
7
7.71±0.76
19.29±3.59
18.42±6.29
219756.9±71945.8
注：△ 与生理盐水组比较 P<0.01; 窗口面积65 mm2
图1 rhEndostatin/MBP抑制血管内皮细胞增殖
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图2 rhEndostatin抑制肿瘤生长
2.2 rhEndostatin/MBP体外抑制血管生成的CAM实验
表1所示，与生理盐水组比较，rhEndostatin/MBP可显著抑制CAM一级血管，二级血管生成(P<0.01)；与阳性对照(bFGF)相比，rhEndostatin/MBP减少为bFGF组CAM一级血管数约1/3、二级血管数1/3。采用图象分析仪对标本进行定量分析发现rhEndostatin/MBP无论是血管面积，血管积分光密度均与生理盐水组有显著差异(P<0.01)，另外在整个实验过程中未发现rhEndostatin/MBP有毒副反应。
2.3 rhEndostatin/MBP抑制原发肿瘤的生长
当肿瘤体积为200 mm3(约1%体重)时开始治疗，由图2中可见，Lewis肺癌的生长被抑制，到15 d时肿瘤的生长被抑制达48%，存在时一效关系。
, http://www.100md.com
研制和开发抗肿瘤药物一直是国内外的热门话题，传统的化疗、放疗针对的是异常增殖的肿瘤细胞，由于肿瘤细胞的基因具不稳定性、异质性及高突变率等特性，因而常导致产生耐药性，并且此种疗法具有较大的毒副作用。我们的实验结果显示，Endostatin作为胶原蛋白十八C末端片断，rhEndostatin/MBP融合蛋白在体外可抑制内皮细胞增殖，因而可阻断肿瘤组织中新血管的生成，切断肿瘤的营养供给而不产生耐药性，在肿瘤治疗中显示了广泛的前景。Endostatin的研究结果提示我们，对于肿瘤病人的治疗可以从两方面考虑:即内皮细胞和肿瘤细胞，由于一种细胞可能对另一种细胞的生长有刺激作用，每种细胞的生长又可选择性或特异性地被外来物质抑制，所以复合治疗效果可能更好，Endostatin 可被用于辅助常规的抗癌疗法如手术、放疗、化疗或免疫疗法，而且由于它不会诱发获得性耐药性，可作为一种维持疗法而长期使用。
本课题受海后卫字基金(983301)资助
参 考 文 献
, 百拇医药
1，O'Reilly MS, Holmgren L, Shing Y, et al. Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell, 1994, 79： 315
2，O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 1997, 88： 277
3，徐根兴， 任敏东， 许 琳. 一种人实体肿瘤血管内皮细胞增殖抑制因子的血管再生治疗中的应用. 发明专利公告， 1998， 14(12)： 45，CN//77005A
(1999-04-12收稿； 1999-07-19修回), 百拇医药