淫羊藿甙逆转转化生长因子β2免疫抑制作用的抗肿瘤研究
作者：李晓燕 张玲 王芸 毛海婷 崔树龄
单位：李晓燕 张玲 王芸 毛海婷 崔树龄(山东省医学科学院基础医学研究所 济南 250062)
关键词：淫羊藿甙；转化生长因子β；免疫抑制
中国肿瘤生物治疗杂志000215
摘 要 目的: 研究淫羊藿甙(ICA)对PG细胞分泌转化生长因子β2(transforming growth factor β2，TGFβ2)的影响、ICA逆转TGFβ2介导的免疫抑制作用及其机制。方法: MTT法检测细胞增殖、杀伤活性，RT-PCR检测TGFβ2、穿孔素，流式细胞术检测TGFβ2、IL-2Rα水平。结果: ICA可抑制PG细胞中TGFβ2的蛋白和mRNA表达,能够逆转受TGFβ2抑制的LAK和CD3AK细胞的杀伤活性，并能部分恢复受TGFβ2抑制的LAK细胞表面IL-2Rα表达和CD3AK细胞内穿孔素mRNA水平,以及CD3AK细胞的增殖活性。结论: 淫羊藿甙通过抑制肿瘤细胞免疫抑制因子TGFβ2的产生,增强免疫效应细胞的杀伤活性等机制而发挥抗肿瘤作用。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R730.5
Reversion of Transforming Growth Factor β2 Mediated Immunosuppression in Lung Cancer by Icarrin
Li xiaoyan Zhang Ling Wang Yun Mao Haiting, Cui Shulin
(Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062)
Abstract Objective: To investigate the influence of Icarrin(ICA) on transforming growth factor β2 (TGFβ2) expression by PG cells and the mechanisms of reversion of TGFβ2 mediated immunosuppression by ICA. Methods: Cell proliferation and cytotoxicity were assayed by MTT assay. mRNA level of TGFβ2 and perforin was detected by RT-PCR assay. Expression of TGFβ2 and IL-2Rα was analysed by folw cytometry assay. Results: ICA could inhibit the protein and mRNA expression of TGFβ2 in PG cells. It could also reverse the supressed cytotoxicity of LAK, CD3AK cells by TGFβ2. The IL-2Rα expression on LAK and perforin gene transcription and proliferation of CD3AK inhibited by TGFβ2 were also partly recovered. Conclusion: The anti-tumor activity of ICA is at least partly due to its capability of inhibiting TGFβ2 expression in tumor cells and restoring the cytotoxicity of immunocompetent cells inhibited by TGFβ2.
, 百拇医药
Key words ICA; transforming growth factor β2; immunosuppression
肿瘤的发生发展是肿瘤细胞与机体免疫系统相互作用中导致免疫监视功能降低的结果。多种肿瘤细胞可分泌免疫抑制因子TGFβ,它能强烈地抑制T细胞的增殖及CTL,NK,Mψ,LAK,CD3AK,TIL细胞的杀伤活性[1],并与过继免疫治疗疗效不佳有直接关系,如果能够抑制TGFβ的分泌并阻断其免疫抑制作用,将有利于控制肿瘤的发展,提高肿瘤的治疗效果。淫羊藿甙(ICA)是一种免疫增强剂和抗肿瘤制剂,具有调节免疫功能,诱导白血病细胞分化、凋亡,逆转实体瘤细胞恶性表型等作用。本文对ICA抑制人肺癌PG细胞分泌TGFβ2，逆转TGFβ2的免疫抑制作用及其机制进行研究,以阐明ICA抗癌作用的新机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料
淫羊藿甙(ICA)从朝鲜淫羊藿中提取,纯度96%以上,性质稳定。全反式维甲酸(ATRA)为本所姜国胜副研究员惠赠；rhTGFβ2购自Sigma公司;rhIL-2购自北京瑞得合通有限公司;CD3单克隆抗体为本所田志刚研究员惠赠；FITC-CD2单抗,FITC-CD16单抗,CD4-FITC,CD8-PE,CD3PE-Cy5单抗均为Immunotech公司产品；小鼠抗人TGFβ2多抗FITC-羊抗小鼠多抗、Random Primer购自华美公司；TRIzol Reagent购自GIBCO-BRL公司;DEPC,dATP,dTTP,dGTP,dCTP,M-MLV Reverse Transcriptase,Taq DNA Polymerase,RNasin均购自Promega公司；人肺巨细胞腺癌PG，人髓样白血病K562细胞为本室保存癌系。
1.2 PCR扩增引物
, 百拇医药
第1种β-actin正引物序列为5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′负引物序列为5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′,扩增片段大小为318 bp,购自北京医科大学病理系。第2种β-actin引物的正引物序列为5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′,负引物序列为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′,扩增片段大小为500 bp,由赛百盛公司合成。穿孔素正引物序列为5′-TGTATGATGGCTGGGG-3′,负引物序列为5′-CCTGTGGTAAGCATGCT-3′,片段大小为523 bp,由赛百盛公司合成。TGFβ2引物由浙江大学董海涛教授惠赠。
1.3 流式细胞术检测ICA对PG细胞TGFβ2蛋白表达的影响
参照文献[2]进行检测。
1.4 RT-PCR法检测ICA对PG细胞TGFβ2 mRNA表达的影响
, 百拇医药
各组PG细胞总RNA提取按TRIzol Reagent说明书操作,逆转录和PCR扩增参照文献[3]进行。
1.5 LAK和CD3AK细胞的诱导培养及ICA，rhTGFβ2的处理
健康人外周抗凝血经淋巴细胞分离液分离PBMC,调整细胞浓度至1×106/ml,加入IL-2 1 000 U/ml诱导LAK细胞;加IL-2 100 U/ml,CD3单抗0.1 μg/ml诱导CD3AK细胞。两诱导系均设①常规诱导对照组②25，50 μg/ml ICA处理组③rhTGFβ2 5，10 ng/ml处理组④逆转组rhTGFβ2 5，10 ng/ml+ICA 50 μg/ml。各诱导处理组细胞置37℃,5%CO2饱和湿度培养,其中rhTGFβ2组和逆转组均在第3天补加相同浓度的rhTGFβ2。
, 百拇医药
1.6 MTT法检测ICA逆转TGFβ2对LAK和CD3AK细胞杀伤活性的抑制作用[4]
收集培养至第3天的各处理组LAK、第4天的CD3AK细胞，以PG和K562为靶细胞,设不同效靶比(6.25∶1, 12.5∶1, 25∶1, 50∶1)实验组,另设靶细胞对照和效应细胞对照,每组3个复孔,置37℃,5%CO2孵箱中培养24 h,测定各组杀伤活性。
1.7 MTT法检测ICA和TGFβ2对CD3AK增殖的影响
将各处理组CD3AK细胞1×106/ml接种于96孔板中,每孔200 μl,培养至3， 4， 6 d,检测增殖活性。
1.8 流式细胞术检测ICA逆转TGFβ2对LAK细胞IL-2Rα表达的抑制作用
, 百拇医药
收集培养至3 d的LAK各处理组细胞,参考文献[2]进行检测。
1.9 RT-PCR法检测ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞穿孔素mRNA水平的抑制作用
参考文献[3]进行。
1.10 RT-PCR产物定量
Gel Dos1000凝胶图像分析仪扫描底片各带,以β-actin为内参照,测定TGFβ2和穿孔素基因mRNA相对表达量。
1.11 统计处理
t检验、x2检验。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 ICA处理后对PG细胞TGFβ2蛋白表达的影响
正常对照组PG细胞TGFβ2表达率为73.26%,阳性对照ATRA 10-5 mol/L处理PG 细胞48 h和72 h后,TGFβ2表达率降至51.94%和59.66%(P<0.01),100 μg/ml, 200 μg/ml ICA 处理PG细胞48 h和72 h后,TGFβ2表达率分别降至47.73%和64.51%, 46.32%和60.20%(P<0.01),呈剂量依赖效应,各药物均以48 h作用最明显。
2.2 ICA对PG细胞TGFβ2 mRNA表达的影响
PG细胞TGFβ2基因mRNA相对表达量为0.9422(图1B),ICA 100 μg/ml, 200 μg/ml处理细胞48 h后,与正常对照相比,TGFβ2基因mRNA扩增条带变浅,相对表达量有不同程度下降,分别为0.6806, 0.2999(图1C，D)。
, 百拇医药
图1 TGFβ2基因RT-PCR扩增片段的电泳分析结果
Fig l DNA electrophoresis of TGFβ2 gene mRNA
expression of control amd treated PG cells by ICA
Lane A: PCR marker; Lane B: Control; Lane C: ICA 200 μg/ml
treatment; Lame D: ICA 100 μg/ml treatment
2.3 ICA逆转TGFβ2对LAK细胞杀伤活性的抑制作用
在诱导起始阶段加入10 ng/ml rhTGFβ2,LAK细胞对PG细胞、K562细胞的NK样杀伤活性显著降低，而ICA 50 μg/ml不仅可显著提高LAK杀伤活性提高,并可阻断rhTGFβ2的抑制作用,将受抑的LAK杀伤活性恢复至正常水平(表1，2)。
, http://www.100md.com
表1 各处理组LAK细胞对PG细胞的杀伤活性
Tab. 1 The killing activity of control and treated
LAK by rhTGFβ2,ICA against PG cells Treatment
E∶T and killing ratio (%)
25∶1
12.5∶1
6.25∶1
Control
70.97±4.9
, 百拇医药
58.06±8.3
0
ICA
90.3±4.9△
74.19±8.1△
16.13±4.9△
rhTGFβ2
45.16±6/5□
16.13±4.6□
0
ICA+rhTGFβ2
, 百拇医药
74.19±4.5▲
51.61±5■
13.97±11.8■
Compared with control △P<0.05; □P<0.01； Compared with rhTGFβ2 treatment ▲P<0.05; ■P<0.01表2 培养至第3天的各处理组LAK细胞对
K562细胞的NK样杀伤活性
Tab. 2 The killing activity of control and treated LAK cells
by ICA, rhTGFβ2 against K562 cells Treatment
, 百拇医药
E∶T and killing ratio (%)
50∶1
25∶1
12.5∶1
Control
66.19±2
26.76±0.5
0
ICA
80.28±0.9△
61.97±1.2△
, http://www.100md.com 14.08±3.1△
rhTGFβ2
53.52±4.7△
18.31±2.3△
5.63±1.7
ICA+rhTGFβ2
80.28±2.5▲
50.70±1.9□
8.45±7.8
Compared with control △P<0.05； Compared with rhTGFβ2 treatment ▲P<0.05； □P<0.012.4 ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞杀伤活性的抑制作用
, 百拇医药
在诱导初始加入rhTGFβ2至终浓度为10 ng/ml,可显著抑制CD3AK活性，50 μg/ml ICA不仅可在一定程度上提高其杀伤活性，并可阻断TGFβ2的抑制作用(表3)。
表3 培养至第4天的各处理组CD3AK细胞
对PG细胞的杀伤活性
Tab. 3 The killing activity of control and treated CD3AK cells
by ICA, TGFβ2 against PG cells Treatment
E∶T and killing ratio (%)
25∶1
, 百拇医药
12.5∶1
6.25∶1
Control
100
81.25±3.2
59.03±3.1
ICA
100
95.83±0.5△
64.58±7
rhTGFβ2
68.75±3□
, http://www.100md.com
58.33±2△
56.25±0.2
ICA+rhTGFβ2
100▲
71.88±6.6▲
58.33±3
Compared with control △P<0.05； □P<0.01; Compared with rhTGFβ2 treatment ▲ P<0.052.5 ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞的增殖抑制作用
ICA协同诱导CD3AK比常规CD3AK在第4、6天增殖率明显提高,诱导起始加入rhTGFβ2 10 ng/ml,可显著抑制CD3AK增殖;ICA在作用的第3,6天可逆转TGFβ2对CD3AK的增殖抑制作用。
, 百拇医药
2.6 ICA逆转TGFβ2对LAK细胞表面IL-2Rα表达的抑制作用
诱导起始加入ICA可显著提高LAK细胞表面IL-2Rα的表达水平,呈剂量依赖效应;诱导初加入rhTGFβ2 5 ng/ml即可显著抑制IL-2Rα表达; ICA可逆转rhTGFβ2对LAK细胞IL-2Rα表达的抑制作用,但尚未完全恢复至正常水平(表4)。
表4 ICA，rhTGFβ2处理3 d的IL-2Rα阳性
LAK细胞数的变化
Tab. 4 Changes of IL-2Rα expression on LAK cells treated
by ICA，rhTGFβ2 for 3 days Dose(μg/ml)
, 百拇医药
CD25 cell number
(/10 000)
CD25 expression
ratio(%)
Control
1 904
19.04
ICA25
2 617△
26.17
ICA50
, http://www.100md.com
3 870△
38.70
TGFβ2 5 ng/ml
895△
8.95
ICA 50+TGFβ2 5 ng/ml
1 650▲
16.50
Compared with control △ P<0.01； Compared with rhTGFβ2 treatment ▲ P<0.01
, 百拇医药
2.7 ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞穿孔素mRNA水平的抑制作用
诱导至第4天的CD3AK细胞,穿孔素基因mRNA相对表达量为0.7513(图2B), rhTGFβ2 10 ng/ml处理后, 其扩增条带较对照变浅,相对表达量值降低为0.005(图2C), ICA 50 μg/ml 处理的扩增片段条带明显加深,相对表达量值由0.7513增高至4.4299(图2D),逆转组相对表达量由0.005提高到0.3(图2E)。
3 讨 论
TGFβ是由多种肿瘤细胞分泌的很强的免疫抑制因子，能够广泛抑制肿瘤患者的免疫系统,使肿瘤细胞逃逸机体免疫监视功能而迅速增殖。我们的体外实验研究发现,ICA可显著抑制人肺巨细胞腺癌PG细胞表达TGFβ2蛋白,RT-PCR结果也显示ICA可明显抑制TGFβ2 mRNA水平,说明ICA可能在TGFβ2基因转录水平起作用,ICA本身具有良好的增强免疫功能的作用,同时又可降低免疫抑制因子TGFβ2的产生,在肿瘤治疗方面显示出良好的应用前景。
, 百拇医药
图2 穿孔素基因RT-PCR扩增片段的电泳分析结果
Fig. 2 DNA electrophoresis analysis of perforin gene mRNA
expression of CD3AK treated by ICA, rhTGFβ2
Lane A: PCR marker; Lane B: Control；Lane C: rhTGFβ2 10 ng/ml
treatment; Lane D: ICA 50 μg/ml treatment; Lane E: ICA 50 μg/ml
and rhTGFβ2 10 ng/ml treatment.
, http://www.100md.com
LAK和CD3AK细胞过继免疫治疗是国内外临床应用广泛的肿瘤过继免疫疗法,但其在体内杀瘤活性较人们理想相距甚远,其原因除与LAK,CD3AK在体内分布有关外,还与免疫抑制因子有关。本实验发现,TGFβ2能够显著抑制LAK,CD3AK细胞对PG和K562细胞的杀伤活性,而ICA可将受抑制的LAK和CD3AK杀伤活性恢复至正常水平。ICA作为LAK和CD3AK细胞的活性增强剂,既可直接提高其杀伤活性,又可防止其回输体内后,受免疫抑制因子影响而成为没有功能的“沉默”细胞,因而联合使用ICA有助于提高肿瘤过继免疫治疗效果。
IL-2是T细胞,LAK细胞等增殖活化所必须的,当IL-2与IL-2Rα链以低亲和力结合后,诱导受体α，β，γ链形成高亲和力受体,然后通过结合于β亚基的Lck激酶,将信号传递至核内,引起与淋巴细胞增殖活化有关的基因表达[5]。我们研究发现ICA逆转TGFβ2抑制LAK杀伤活性与其对LAK细胞表面IL-2Rα表达的影响有关, 5 ng/ml TGFβ2可明显抑制IL-2活化的LAK细胞表面IL-2Rα表达,ICA能够在一定程度上恢复LAK细胞受TGFβ2抑制的IL-2Rα水平,这可能是ICA逆转TGFβ2抑制LAK细胞杀伤活性的机制。
, 百拇医药
Michael[6]等曾观察到TGFβ2可诱导IL-2依赖T细胞系CTLL2凋亡。我们实验观察到TGFβ2能够抑制CD3AK细胞增殖,但未发现TGFβ2诱导CD3AK细胞凋亡现象。ICA 促进CD3AK细胞增殖的同时,还可逆转TGFβ2对CD3AK的增殖抑制作用,这可能是ICA恢复受TGFβ2抑制的CD3AK杀伤活性的机制之一。
穿孔素在细胞毒性T细胞及NK细胞杀伤靶细胞过程中介导靶细胞溶解，而TGFβ能抑制IL-2和CD3单抗诱导的T细胞中穿孔素mRNA水平,且TGFβ必须在诱导之初加入才有抑制作用,说明穿孔素基因转录是杀伤性T细胞活化早期事件[7]。我们的研究结果与Smyth等[8]报道一致,rhTGFβ2 10 ng/ml可明显抑制CD3AK穿孔素mRNA水平,其相对表达量较正常对照降低100倍;ICA能够提高其穿孔素mRNA水平并在一定程度上恢复受TGFβ2抑制的穿孔素mRNA表达,这可能是ICA逆转TGFβ2抑制CD3AK杀伤活性的又一重要机制。
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本文阐明了ICA抑制肿瘤分泌免疫抑制因子TGFβ及逆转TGFβ免疫抑制作用的抗肿瘤新机制,为ICA临床应用提供了新的理论和实验依据,但ICA影响TGFβ表达及阻断TGFβ作用的分子机制仍需进一步探讨。
山东省科委项目(971226206)资助
李晓燕,女,26岁,硕士生,主要从事免疫调控与抗肿瘤的研究
参 考 文 献
1，Wojtowicz SP. Reversal of tumor-induced immunosuppression: A new approach to cancer therapy. J Immunol, 1997, 20(3): 165
2，左连富. 流式细胞术样品制备技术. 华夏出版社， 1991. 81
, 百拇医药
3，萨姆布鲁克 J， 弗里厅 EF， 曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆实验指南. 金冬雁， 黎孟枫 等译. 第2版. 北京: 科学出版社, 1992. 304
4，朱慧芬, 张 悦, 王晓林， 等. MTT比色法检测IL-2和杀伤细胞活性的研究. 免疫学杂志, 1994， 10： 48
5，王琳芳, 杨克恭. 蛋白质与核酸. 北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1997. 175
6，Michael W, Daniel BC, Ursula M, et al. Transforming growth factor β2 induces apoptosis of murine T cell clones without downregulating bcl-2 mRNA expression. Eur J Immunol, 1994, 24: 1293
, http://www.100md.com
7，Salcedo TW, Azzonil L, Wolf SF, et al. Modulation of perforin and granzyme message-RNA expression in human natural killer cells. J Immunol, 1993, 151: 2511
8，Smyth MJ, Strobl SL, Yong HA， et al. Regulation of lymphokine-activity killer actroing and pore-forming protein gene expression in human peripheral blood CD8+ T lymphocytes. J Immunol, 1991, 146: 3289
(1999-07-09收稿； 1999-10-13修回), 百拇医药
单位：李晓燕 张玲 王芸 毛海婷 崔树龄(山东省医学科学院基础医学研究所 济南 250062)
关键词：淫羊藿甙；转化生长因子β；免疫抑制
中国肿瘤生物治疗杂志000215
摘 要 目的: 研究淫羊藿甙(ICA)对PG细胞分泌转化生长因子β2(transforming growth factor β2，TGFβ2)的影响、ICA逆转TGFβ2介导的免疫抑制作用及其机制。方法: MTT法检测细胞增殖、杀伤活性，RT-PCR检测TGFβ2、穿孔素，流式细胞术检测TGFβ2、IL-2Rα水平。结果: ICA可抑制PG细胞中TGFβ2的蛋白和mRNA表达,能够逆转受TGFβ2抑制的LAK和CD3AK细胞的杀伤活性，并能部分恢复受TGFβ2抑制的LAK细胞表面IL-2Rα表达和CD3AK细胞内穿孔素mRNA水平,以及CD3AK细胞的增殖活性。结论: 淫羊藿甙通过抑制肿瘤细胞免疫抑制因子TGFβ2的产生,增强免疫效应细胞的杀伤活性等机制而发挥抗肿瘤作用。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R730.5
Reversion of Transforming Growth Factor β2 Mediated Immunosuppression in Lung Cancer by Icarrin
Li xiaoyan Zhang Ling Wang Yun Mao Haiting, Cui Shulin
(Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062)
Abstract Objective: To investigate the influence of Icarrin(ICA) on transforming growth factor β2 (TGFβ2) expression by PG cells and the mechanisms of reversion of TGFβ2 mediated immunosuppression by ICA. Methods: Cell proliferation and cytotoxicity were assayed by MTT assay. mRNA level of TGFβ2 and perforin was detected by RT-PCR assay. Expression of TGFβ2 and IL-2Rα was analysed by folw cytometry assay. Results: ICA could inhibit the protein and mRNA expression of TGFβ2 in PG cells. It could also reverse the supressed cytotoxicity of LAK, CD3AK cells by TGFβ2. The IL-2Rα expression on LAK and perforin gene transcription and proliferation of CD3AK inhibited by TGFβ2 were also partly recovered. Conclusion: The anti-tumor activity of ICA is at least partly due to its capability of inhibiting TGFβ2 expression in tumor cells and restoring the cytotoxicity of immunocompetent cells inhibited by TGFβ2.
, 百拇医药
Key words ICA; transforming growth factor β2; immunosuppression
肿瘤的发生发展是肿瘤细胞与机体免疫系统相互作用中导致免疫监视功能降低的结果。多种肿瘤细胞可分泌免疫抑制因子TGFβ,它能强烈地抑制T细胞的增殖及CTL,NK,Mψ,LAK,CD3AK,TIL细胞的杀伤活性[1],并与过继免疫治疗疗效不佳有直接关系,如果能够抑制TGFβ的分泌并阻断其免疫抑制作用,将有利于控制肿瘤的发展,提高肿瘤的治疗效果。淫羊藿甙(ICA)是一种免疫增强剂和抗肿瘤制剂,具有调节免疫功能,诱导白血病细胞分化、凋亡,逆转实体瘤细胞恶性表型等作用。本文对ICA抑制人肺癌PG细胞分泌TGFβ2，逆转TGFβ2的免疫抑制作用及其机制进行研究,以阐明ICA抗癌作用的新机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料
淫羊藿甙(ICA)从朝鲜淫羊藿中提取,纯度96%以上,性质稳定。全反式维甲酸(ATRA)为本所姜国胜副研究员惠赠；rhTGFβ2购自Sigma公司;rhIL-2购自北京瑞得合通有限公司;CD3单克隆抗体为本所田志刚研究员惠赠；FITC-CD2单抗,FITC-CD16单抗,CD4-FITC,CD8-PE,CD3PE-Cy5单抗均为Immunotech公司产品；小鼠抗人TGFβ2多抗FITC-羊抗小鼠多抗、Random Primer购自华美公司；TRIzol Reagent购自GIBCO-BRL公司;DEPC,dATP,dTTP,dGTP,dCTP,M-MLV Reverse Transcriptase,Taq DNA Polymerase,RNasin均购自Promega公司；人肺巨细胞腺癌PG，人髓样白血病K562细胞为本室保存癌系。
1.2 PCR扩增引物
, 百拇医药
第1种β-actin正引物序列为5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′负引物序列为5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′,扩增片段大小为318 bp,购自北京医科大学病理系。第2种β-actin引物的正引物序列为5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′,负引物序列为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′,扩增片段大小为500 bp,由赛百盛公司合成。穿孔素正引物序列为5′-TGTATGATGGCTGGGG-3′,负引物序列为5′-CCTGTGGTAAGCATGCT-3′,片段大小为523 bp,由赛百盛公司合成。TGFβ2引物由浙江大学董海涛教授惠赠。
1.3 流式细胞术检测ICA对PG细胞TGFβ2蛋白表达的影响
参照文献[2]进行检测。
1.4 RT-PCR法检测ICA对PG细胞TGFβ2 mRNA表达的影响
, 百拇医药
各组PG细胞总RNA提取按TRIzol Reagent说明书操作,逆转录和PCR扩增参照文献[3]进行。
1.5 LAK和CD3AK细胞的诱导培养及ICA，rhTGFβ2的处理
健康人外周抗凝血经淋巴细胞分离液分离PBMC,调整细胞浓度至1×106/ml,加入IL-2 1 000 U/ml诱导LAK细胞;加IL-2 100 U/ml,CD3单抗0.1 μg/ml诱导CD3AK细胞。两诱导系均设①常规诱导对照组②25，50 μg/ml ICA处理组③rhTGFβ2 5，10 ng/ml处理组④逆转组rhTGFβ2 5，10 ng/ml+ICA 50 μg/ml。各诱导处理组细胞置37℃,5%CO2饱和湿度培养,其中rhTGFβ2组和逆转组均在第3天补加相同浓度的rhTGFβ2。
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1.6 MTT法检测ICA逆转TGFβ2对LAK和CD3AK细胞杀伤活性的抑制作用[4]
收集培养至第3天的各处理组LAK、第4天的CD3AK细胞，以PG和K562为靶细胞,设不同效靶比(6.25∶1, 12.5∶1, 25∶1, 50∶1)实验组,另设靶细胞对照和效应细胞对照,每组3个复孔,置37℃,5%CO2孵箱中培养24 h,测定各组杀伤活性。
1.7 MTT法检测ICA和TGFβ2对CD3AK增殖的影响
将各处理组CD3AK细胞1×106/ml接种于96孔板中,每孔200 μl,培养至3， 4， 6 d,检测增殖活性。
1.8 流式细胞术检测ICA逆转TGFβ2对LAK细胞IL-2Rα表达的抑制作用
, 百拇医药
收集培养至3 d的LAK各处理组细胞,参考文献[2]进行检测。
1.9 RT-PCR法检测ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞穿孔素mRNA水平的抑制作用
参考文献[3]进行。
1.10 RT-PCR产物定量
Gel Dos1000凝胶图像分析仪扫描底片各带,以β-actin为内参照,测定TGFβ2和穿孔素基因mRNA相对表达量。
1.11 统计处理
t检验、x2检验。
2 结 果
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2.1 ICA处理后对PG细胞TGFβ2蛋白表达的影响
正常对照组PG细胞TGFβ2表达率为73.26%,阳性对照ATRA 10-5 mol/L处理PG 细胞48 h和72 h后,TGFβ2表达率降至51.94%和59.66%(P<0.01),100 μg/ml, 200 μg/ml ICA 处理PG细胞48 h和72 h后,TGFβ2表达率分别降至47.73%和64.51%, 46.32%和60.20%(P<0.01),呈剂量依赖效应,各药物均以48 h作用最明显。
2.2 ICA对PG细胞TGFβ2 mRNA表达的影响
PG细胞TGFβ2基因mRNA相对表达量为0.9422(图1B),ICA 100 μg/ml, 200 μg/ml处理细胞48 h后,与正常对照相比,TGFβ2基因mRNA扩增条带变浅,相对表达量有不同程度下降,分别为0.6806, 0.2999(图1C，D)。
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图1 TGFβ2基因RT-PCR扩增片段的电泳分析结果
Fig l DNA electrophoresis of TGFβ2 gene mRNA
expression of control amd treated PG cells by ICA
Lane A: PCR marker; Lane B: Control; Lane C: ICA 200 μg/ml
treatment; Lame D: ICA 100 μg/ml treatment
2.3 ICA逆转TGFβ2对LAK细胞杀伤活性的抑制作用
在诱导起始阶段加入10 ng/ml rhTGFβ2,LAK细胞对PG细胞、K562细胞的NK样杀伤活性显著降低，而ICA 50 μg/ml不仅可显著提高LAK杀伤活性提高,并可阻断rhTGFβ2的抑制作用,将受抑的LAK杀伤活性恢复至正常水平(表1，2)。
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表1 各处理组LAK细胞对PG细胞的杀伤活性
Tab. 1 The killing activity of control and treated
LAK by rhTGFβ2,ICA against PG cells Treatment
E∶T and killing ratio (%)
25∶1
12.5∶1
6.25∶1
Control
70.97±4.9
, 百拇医药
58.06±8.3
0
ICA
90.3±4.9△
74.19±8.1△
16.13±4.9△
rhTGFβ2
45.16±6/5□
16.13±4.6□
0
ICA+rhTGFβ2
, 百拇医药
74.19±4.5▲
51.61±5■
13.97±11.8■
Compared with control △P<0.05; □P<0.01； Compared with rhTGFβ2 treatment ▲P<0.05; ■P<0.01表2 培养至第3天的各处理组LAK细胞对
K562细胞的NK样杀伤活性
Tab. 2 The killing activity of control and treated LAK cells
by ICA, rhTGFβ2 against K562 cells Treatment
, 百拇医药
E∶T and killing ratio (%)
50∶1
25∶1
12.5∶1
Control
66.19±2
26.76±0.5
0
ICA
80.28±0.9△
61.97±1.2△
, http://www.100md.com 14.08±3.1△
rhTGFβ2
53.52±4.7△
18.31±2.3△
5.63±1.7
ICA+rhTGFβ2
80.28±2.5▲
50.70±1.9□
8.45±7.8
Compared with control △P<0.05； Compared with rhTGFβ2 treatment ▲P<0.05； □P<0.012.4 ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞杀伤活性的抑制作用
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在诱导初始加入rhTGFβ2至终浓度为10 ng/ml,可显著抑制CD3AK活性，50 μg/ml ICA不仅可在一定程度上提高其杀伤活性，并可阻断TGFβ2的抑制作用(表3)。
表3 培养至第4天的各处理组CD3AK细胞
对PG细胞的杀伤活性
Tab. 3 The killing activity of control and treated CD3AK cells
by ICA, TGFβ2 against PG cells Treatment
E∶T and killing ratio (%)
25∶1
, 百拇医药
12.5∶1
6.25∶1
Control
100
81.25±3.2
59.03±3.1
ICA
100
95.83±0.5△
64.58±7
rhTGFβ2
68.75±3□
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58.33±2△
56.25±0.2
ICA+rhTGFβ2
100▲
71.88±6.6▲
58.33±3
Compared with control △P<0.05； □P<0.01; Compared with rhTGFβ2 treatment ▲ P<0.052.5 ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞的增殖抑制作用
ICA协同诱导CD3AK比常规CD3AK在第4、6天增殖率明显提高,诱导起始加入rhTGFβ2 10 ng/ml,可显著抑制CD3AK增殖;ICA在作用的第3,6天可逆转TGFβ2对CD3AK的增殖抑制作用。
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2.6 ICA逆转TGFβ2对LAK细胞表面IL-2Rα表达的抑制作用
诱导起始加入ICA可显著提高LAK细胞表面IL-2Rα的表达水平,呈剂量依赖效应;诱导初加入rhTGFβ2 5 ng/ml即可显著抑制IL-2Rα表达; ICA可逆转rhTGFβ2对LAK细胞IL-2Rα表达的抑制作用,但尚未完全恢复至正常水平(表4)。
表4 ICA，rhTGFβ2处理3 d的IL-2Rα阳性
LAK细胞数的变化
Tab. 4 Changes of IL-2Rα expression on LAK cells treated
by ICA，rhTGFβ2 for 3 days Dose(μg/ml)
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CD25 cell number
(/10 000)
CD25 expression
ratio(%)
Control
1 904
19.04
ICA25
2 617△
26.17
ICA50
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3 870△
38.70
TGFβ2 5 ng/ml
895△
8.95
ICA 50+TGFβ2 5 ng/ml
1 650▲
16.50
Compared with control △ P<0.01； Compared with rhTGFβ2 treatment ▲ P<0.01
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2.7 ICA逆转TGFβ2对CD3AK细胞穿孔素mRNA水平的抑制作用
诱导至第4天的CD3AK细胞,穿孔素基因mRNA相对表达量为0.7513(图2B), rhTGFβ2 10 ng/ml处理后, 其扩增条带较对照变浅,相对表达量值降低为0.005(图2C), ICA 50 μg/ml 处理的扩增片段条带明显加深,相对表达量值由0.7513增高至4.4299(图2D),逆转组相对表达量由0.005提高到0.3(图2E)。
3 讨 论
TGFβ是由多种肿瘤细胞分泌的很强的免疫抑制因子，能够广泛抑制肿瘤患者的免疫系统,使肿瘤细胞逃逸机体免疫监视功能而迅速增殖。我们的体外实验研究发现,ICA可显著抑制人肺巨细胞腺癌PG细胞表达TGFβ2蛋白,RT-PCR结果也显示ICA可明显抑制TGFβ2 mRNA水平,说明ICA可能在TGFβ2基因转录水平起作用,ICA本身具有良好的增强免疫功能的作用,同时又可降低免疫抑制因子TGFβ2的产生,在肿瘤治疗方面显示出良好的应用前景。
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图2 穿孔素基因RT-PCR扩增片段的电泳分析结果
Fig. 2 DNA electrophoresis analysis of perforin gene mRNA
expression of CD3AK treated by ICA, rhTGFβ2
Lane A: PCR marker; Lane B: Control；Lane C: rhTGFβ2 10 ng/ml
treatment; Lane D: ICA 50 μg/ml treatment; Lane E: ICA 50 μg/ml
and rhTGFβ2 10 ng/ml treatment.
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LAK和CD3AK细胞过继免疫治疗是国内外临床应用广泛的肿瘤过继免疫疗法,但其在体内杀瘤活性较人们理想相距甚远,其原因除与LAK,CD3AK在体内分布有关外,还与免疫抑制因子有关。本实验发现,TGFβ2能够显著抑制LAK,CD3AK细胞对PG和K562细胞的杀伤活性,而ICA可将受抑制的LAK和CD3AK杀伤活性恢复至正常水平。ICA作为LAK和CD3AK细胞的活性增强剂,既可直接提高其杀伤活性,又可防止其回输体内后,受免疫抑制因子影响而成为没有功能的“沉默”细胞,因而联合使用ICA有助于提高肿瘤过继免疫治疗效果。
IL-2是T细胞,LAK细胞等增殖活化所必须的,当IL-2与IL-2Rα链以低亲和力结合后,诱导受体α，β，γ链形成高亲和力受体,然后通过结合于β亚基的Lck激酶,将信号传递至核内,引起与淋巴细胞增殖活化有关的基因表达[5]。我们研究发现ICA逆转TGFβ2抑制LAK杀伤活性与其对LAK细胞表面IL-2Rα表达的影响有关, 5 ng/ml TGFβ2可明显抑制IL-2活化的LAK细胞表面IL-2Rα表达,ICA能够在一定程度上恢复LAK细胞受TGFβ2抑制的IL-2Rα水平,这可能是ICA逆转TGFβ2抑制LAK细胞杀伤活性的机制。
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Michael[6]等曾观察到TGFβ2可诱导IL-2依赖T细胞系CTLL2凋亡。我们实验观察到TGFβ2能够抑制CD3AK细胞增殖,但未发现TGFβ2诱导CD3AK细胞凋亡现象。ICA 促进CD3AK细胞增殖的同时,还可逆转TGFβ2对CD3AK的增殖抑制作用,这可能是ICA恢复受TGFβ2抑制的CD3AK杀伤活性的机制之一。
穿孔素在细胞毒性T细胞及NK细胞杀伤靶细胞过程中介导靶细胞溶解，而TGFβ能抑制IL-2和CD3单抗诱导的T细胞中穿孔素mRNA水平,且TGFβ必须在诱导之初加入才有抑制作用,说明穿孔素基因转录是杀伤性T细胞活化早期事件[7]。我们的研究结果与Smyth等[8]报道一致,rhTGFβ2 10 ng/ml可明显抑制CD3AK穿孔素mRNA水平,其相对表达量较正常对照降低100倍;ICA能够提高其穿孔素mRNA水平并在一定程度上恢复受TGFβ2抑制的穿孔素mRNA表达,这可能是ICA逆转TGFβ2抑制CD3AK杀伤活性的又一重要机制。
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本文阐明了ICA抑制肿瘤分泌免疫抑制因子TGFβ及逆转TGFβ免疫抑制作用的抗肿瘤新机制,为ICA临床应用提供了新的理论和实验依据,但ICA影响TGFβ表达及阻断TGFβ作用的分子机制仍需进一步探讨。
山东省科委项目(971226206)资助
李晓燕,女,26岁,硕士生,主要从事免疫调控与抗肿瘤的研究
参 考 文 献
1，Wojtowicz SP. Reversal of tumor-induced immunosuppression: A new approach to cancer therapy. J Immunol, 1997, 20(3): 165
2，左连富. 流式细胞术样品制备技术. 华夏出版社， 1991. 81
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3，萨姆布鲁克 J， 弗里厅 EF， 曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆实验指南. 金冬雁， 黎孟枫 等译. 第2版. 北京: 科学出版社, 1992. 304
4，朱慧芬, 张 悦, 王晓林， 等. MTT比色法检测IL-2和杀伤细胞活性的研究. 免疫学杂志, 1994， 10： 48
5，王琳芳, 杨克恭. 蛋白质与核酸. 北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1997. 175
6，Michael W, Daniel BC, Ursula M, et al. Transforming growth factor β2 induces apoptosis of murine T cell clones without downregulating bcl-2 mRNA expression. Eur J Immunol, 1994, 24: 1293
, http://www.100md.com
7，Salcedo TW, Azzonil L, Wolf SF, et al. Modulation of perforin and granzyme message-RNA expression in human natural killer cells. J Immunol, 1993, 151: 2511
8，Smyth MJ, Strobl SL, Yong HA， et al. Regulation of lymphokine-activity killer actroing and pore-forming protein gene expression in human peripheral blood CD8+ T lymphocytes. J Immunol, 1991, 146: 3289
(1999-07-09收稿； 1999-10-13修回), 百拇医药