p53及B7重组痘苗病毒抗肿瘤的实验研究
作者：张克强 王金惠 李秀森 唐佩弦 毛宁
单位：张克强 王金惠 李秀森 唐佩弦 毛宁(军事医学科学院基础医学研究所 北京 100850)
关键词：p53；B7；重组痘苗病毒；抗肿瘤
中国肿瘤生物治疗杂志000206
摘 要 目的： 探索点突变p53重组痘苗病毒诱导的抗瘤免疫反应及B7对其加强作用，为重组抗原疫苗用于肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法： 选择人135位Cys→Tyr点突变p53作为肿瘤相关抗原模型，观察以表达该点突变p53的重组痘苗病毒rVV-p53FL单独和联合表达B7的重组痘苗病毒rVV-B7所诱导的CTL及对荷瘤小鼠的免疫保护和治疗作用。 结果: 以rVV-p53FL经静脉免疫BALB/c小鼠能够诱导以CD8+ T细胞为主的特异性CTL。rVV-p53FL能够保护部分小鼠免遭肿瘤细胞的攻击。以rVV-p53FL治疗荷瘤小鼠，可显著延长小鼠平均存活期。rVV-B7与 rVV-p53FL以1∶1的比例混合接种可部分加强rVV-p53FL的治疗作用。结论： 肿瘤细胞内过度表达的突变P53蛋白可作为CTL 识别和攻击的靶抗原，以突变P53蛋白作为肿瘤抗原的疫苗可诱导机体产生p53特异性的抗瘤免疫反应。共刺激分子B7可加强肿瘤抗原诱导的抗瘤免疫反应。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R730.51
Antitumor Responses Induced by Recombinant Vaccinia Viruses Expressing p53 and B7
Zhang Keqiang Wang Jinhui Li Xiusen Tang Pei-Hsien Mao Ning
(Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850)
Abstract Objective： This study was aimed to explore antitumor responses induced by recombinant vaccinia viruses expressing a point mutant p53 (rVV-p53FL) and enhancive effects of recombinant vaccinia viruses expressing costimulatory molecule B7 (rVV-B7). Methods: A 135 Cys to Tyr point mutant p53 protein was used as the model of tumor associated antigen. rVV-p53FL and rVV-B7 were used as vaccines to test their induction of CTLs and antitumor immunity. Results: Immunization BABL/c mice with rVV-p53FL could elicited specific CD8+ CTLs that could effecively lyse P815-mp53 cells, a transfectant of the murine P815 mastocytoma containing the mutant p53 gene. Treatment with rVV-p53FL could survive a part of mice challenged with 1×106 P815-mp53. Treatment with rVV-p53FL could significantly prolong survival of tumor-bearing mice. Admixture at 1∶1 ratio of rVV-p53FL and rVV-B7 could enhance therapeutic antitumor effects of rVV-p53FL. Conclusion: Mutant P53 over-expressed in tumor cells can render cells targets for specific CTLs generated by immunization with mutant p53 protein based vaccine. Costimulatory molecule B7 can enhance tumor-associated antigen inducing antitumor responses.
, 百拇医药
Key words
Key words p53； B7； recombinant vaccinia virus； antitumor
癌基因和抑癌基因的改变是肿瘤细胞的一种共同现象，突变的癌基因和抑癌基因的产物可以成为免疫系统识别和攻击的靶分子。研究表明，p53突变与多种肿瘤的发生和发展密切相关，是肿瘤易感基因之一。p53突变是人类肿瘤最常见的基因改变，因而是靶向性肿瘤免疫治疗极具吸引力的靶分子之一。
T细胞激活双信号模式的提出为B7家族作为共刺激分子转导肿瘤细胞增加免疫原性提供了坚实的理论基础。近年来,将B7和肿瘤抗原疫苗联合应用于肿瘤主动免疫治疗的研究表明,B7分子能够辅助或加强多种肿瘤抗原诱导的抗瘤免疫反应[1]。
本研究选取135位Cys→Tyr点突变P53蛋白为肿瘤相关抗原模型，以转染该点突变p53基因的小鼠肥大细胞瘤P815-mp53为肿瘤细胞模型，研究点突变p53重组痘苗病毒诱导的抗瘤免疫反应和共刺激分子B7对之的加强作用。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 主要试剂和动物
X-gal,5-Br尿嘧啶脱氧核苷酸(Budr)为Sigma公司产品；LipofectamineTM 试剂，G418 为Gibcobrl公司产品；鼠抗人p53单克隆抗体DOI Ⅰ 为SantCruz公司产品；FITC标记的鼠抗人B7-1单克隆抗体MAB104为Immunotech公司产品；包含135位Cys→Tyr点突变人p53基因的质粒pRC/CMV-p53由美国Carbone博士惠赠；质粒pJSA1175和人骨肉瘤TK-143细胞及野生型痘苗病毒中国天坛761株由中国预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠；DBA/2小鼠肥大瘤细胞P815(H-2d)为本室传代保存；BABL/c小鼠(H-2d)，6～8周龄，雌性，由本院动物中心提供。
1.2 重组痘苗病毒的构建和鉴定
, http://www.100md.com
1.2.1 重组痘苗病毒的构建
将含人135位点突变的p53基因和B7-1基因插入质粒pJSA1175的7.5 k启动子下构建重组质粒pJSA1175-p53与pJSA1175-B7。 将TK+野生型痘苗病毒(wt-VV)按0.1 PFU(plaque forming unite)/细胞感染TK-143细胞后，采用Lipofectamine共转染法将重组质粒导入TK-143细胞，以同源重组的方式获得TK-重组痘苗病毒。在25 μg/ml Budr和200 μg/ml X-gal筛选下得到蓝色重组痘苗病毒噬斑[2]。挑取单个蓝斑，纯化5代至蓝斑纯度达到100%，分别命名为rVV-p53FL和rVV-B7。
1.2.2 Western blot 检测rVV-p53FL的表达
, http://www.100md.com rVV-p53FL感染TK-143细胞48 h后，提取细胞总蛋白。用ECL Western bolt 分析系统试剂盒进行P53蛋白的检测，以野生型痘苗病毒感染的TK-143细胞作为阴性对照。
1.2.3 流式细胞术检测rVV-B7的表达
rVV-B7按10 PFU/细胞的剂量感染TK-143细胞12 h后以FITC直标的鼠抗人B7单克隆抗体标记后，经流式细胞仪分析，计算阳性率，以野生型痘苗病毒感染的TK-143细胞为阴性对照。
1.3 肿瘤细胞系P815-mp53的建立
将质粒pRC/CMV-p53采用Lipofectamine共转染法导入P815细胞，以含600 μg/ml G418的培养液选择抗性克隆，免疫细胞化学染色检测P53蛋白表达，阳性克隆进一步有限稀释再克隆化培养，Western-blot检测P53蛋白的表达，挑选P53表达高全阳性的克隆作为表达突变P53蛋白的肿瘤细胞系命名为P815-mp53，以含600 μg/ml G418的DMEM培养基培养。
, 百拇医药
1.4 CTL细胞毒活性测定
将9只小鼠随机分为3组，分别以1×107 PFU wt-VV，1×107 PFU rVV-p53FL，1×107 PFU rVV-p53FL+1×107 PFU rVV-B7经静脉免疫4周后，常规制备免疫鼠脾细胞悬液。(5～6)×106/ml脾细胞分别与经80 μg/ml丝裂霉素C处理45 min的(2～3)×106/ml P815-mp53细胞等体积混合，以含25 U/ml rhIL-2,2×10-3mol/L L-谷氨酸，5×10-5mol/L β-巯基乙醇的培养基培养5 d后，收获脾细胞，用Ficoll(ρ=1.0717)离心，除去死细胞，作为效应细胞[3]。靶细胞为P815-mp53，以P815细胞作为阴性对照。将效应细胞稀释成不同浓度按100 μl/孔接种于96孔U形底培养板，与100 μl靶细胞(1×104)混合，形成不同的效靶比(E∶T)，以乳酸脱氢酶法测定CTL细胞毒活性。
, 百拇医药
1.5 CTL细胞表型分析
以2 μg/ml的兔抗鼠CD4与CD8单克隆抗体封闭CTL杀伤试验，探证抗CD4与CD8单克隆抗体对CTL杀伤活性的影响。
1.6 重组痘苗病毒在体内抗肿瘤的实验研究[4]
1.6.1 保护性实验
将21只小鼠，随机分为3组，分别以1×107 PFU wt-VV,1×107 PFU rVV-p53FL和1×107 PFU rVV-p53FL+1×107 PFU rVV-B7静脉免疫4周后，再经尾静脉接种1×106 P815-mp53细胞，记录各免疫组小鼠的存活期和存活动物数。
1.6.2 治疗性实验
, http://www.100md.com
将21只小鼠，随机分为3组，小鼠先经静脉接种1×106的P815-mp53细胞3 d后，再分别在接种后的第3,6天以1×107 PFU wt-VV,1×107 PFU rVV-p53FL和1×107 PFU rVV-p53FL+1×107 PFU rVV-B7经静脉免疫治疗各实验组小鼠，记录各免疫组小鼠的存活期和存活动物数。
2 结 果
2.1 Western blot检测rVV-p53FL的表达
rVV-p53FL以10 PFU/细胞的剂量感染TK-143细胞48 h后，Western blot检测到P53蛋白的表达(图1)。
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图1 Western blot检测rVV-p53FL的表达
Fig. 1 Expression of rVV-p53FL detected by Western blot
2.2 流式细胞仪检测rVV-B7的表达
rVV-B7以10 PFU/细胞的剂量感染TK-143细胞12 h后，流式细胞术分析表明,90%以上的细胞表面有B7的表达。
2.3 重组痘苗病毒诱导的CTL
以rVV-p53FL免疫小鼠可诱导有显著杀伤活性的CTL特异性地杀伤P815-mp53，而不杀伤P815。rVV-B7未能显著加强rVV-p53FL诱导的CTL杀伤活性(图2)。
, 百拇医药
图2 重组痘苗病毒诱导的CTL对P815和P815-mp53的杀伤
Fig. 2 Lysis of P815 and P815-mp53 by CTL induced with rVVs
2.4 抗CD4/CD8单克隆抗体对CTL杀伤活性的影响
加入抗CD4单克隆抗体对CTL杀伤活性无显著影响(P>0.05)，而经抗CD8单克隆抗体封闭后，CTL杀伤活性显著降低(P<0.05)，表明CTL杀伤活性主要由CD8+ T细胞介导。
2.5 重组痘苗病毒抗肿瘤实验
2.5.1 保护性实验
重组痘苗病毒以1×107 PFU静脉免疫4周，经静脉接种1×106 P815-mp53细胞后，可保护部分小鼠存活，rVV-B7未能明显加强rVV-p53FL的免疫保护作用(图3)。
, http://www.100md.com
图3 rVVs保护性实验小鼠存活曲线
Fig. 3 Survival curves of mice immunized with rVVs
2.5.2 治疗性实验
经静脉接种致死剂量的P815-mp53 3 d后，经静脉接种1×107 PFU的重组痘病毒能够显著延长治疗组小鼠存活时间(0.01
图4 重组痘苗病毒治疗荷瘤小鼠存活曲线
, 百拇医药
Fig. 4 Survival curves of mice treated with rVVs
3 讨 论
痘苗病毒是唯一能够在胞浆内复制的DNA病毒，它不会整合进宿主细胞基因组，无致癌性等问题。作为活疫苗使用，不但能产生体液免疫还能激发细胞免疫，且免疫应答强效持久，一般不需复种。由于痘苗病毒的上述优点，在肿瘤免疫治疗方面一个突出的应用是作为肿瘤特异性抗原的载体用于肿瘤主动免疫治疗。
p53突变不仅导致肿瘤细胞发生恶性表型和功能的变化，而且可以诱导特异性细胞毒T淋巴细胞反应和循环抗体的产生[5，6]，这种过度表达的结构和功能异常的P53蛋白只表达在肿瘤细胞，能够成为机体免疫系统识别和攻击的靶分子。本研究结果表明，突变的P53蛋白能够作为肿瘤免疫系统识别的靶抗原，有可能作为疫苗用于肿瘤免疫治疗。
, 百拇医药 绝大多数肿瘤细胞是低免疫原性或缺乏共刺激分子的表达，这是肿瘤细胞逃逸免疫识别和杀伤的机制之一。许多实验已证实将B7基因导入高免疫原性的肿瘤细胞，能够增加肿瘤细胞的免疫原性，促进T细胞的增殖并诱导机体产生免疫排斥[7]。鉴于脂质体和逆转录病毒载体介导的转染法低效繁琐，Hodge等[1]以表达B7分子的重组痘苗病毒感染肿瘤细胞后，无需任何药物抗性筛选，能在5～10 h内使 90%以上的受感染细胞表达B7分子。以痘苗病毒为载体将B7转导小鼠结肠癌细胞系MC38后再接种小鼠，肿瘤生长明显减缓。Chamberlain等[8]以Lac-Z基因作为肿瘤相关抗原模型，构建了分别表达Lac-Z和B7以及共表达2种分子的重组痘苗病毒，单独应用1种重组痘苗病毒或混合应用2种重组痘苗病毒都未能够诱导出显著的抗瘤免疫反应，但以共表达Lac-Z和B7的重组痘苗病毒免疫小鼠可显著地减少肿瘤的肺转移，延长小鼠的存活时间，本实验的结果基本与上述实验相同。共刺激分子B7未能较显著地加强肿瘤抗原诱导的抗瘤免疫效应的原因可能与所采用的免疫方式有关。研究表明,尽管,静脉免疫能够有效地诱导抗原特异性T细胞免疫反应，但发挥共刺激作用的前提条件是共刺激分子和肿瘤抗原必须表达在非常邻近的范围内。本实验采用静脉免疫可能局限了2种重组痘苗病毒同时感染1个细胞或邻近细胞的概率，制约了共刺激作用最大限度的发挥，推测共表达B7和肿瘤抗原的重组痘苗病毒可能更为有效。
, 百拇医药
张克强,男,29岁,博士,助研,主权从事肿瘤免疫治疗的研究
参 考 文 献
1，Hodge JW, Abrams S, Schlom J, et al. Induction of antitumor immunity by recombinant vaccinia viruses expressing B7-1 or B7-2 costimulatory molecules. Cancer Res， 1994， 54(21): 5552
2，Mackett M, Smith GL, Moss B. Vaccinia virus: A selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proc Natl Acad Sci USA， 1982， 79(23): 7415
, 百拇医药
3，Restifo NPF, Bacik I, Irvine KR, et al. Antigen processing in vivo and the elicitation of primary CTL responses. J Immunol， 1995， 154: 4414
4，Wang M, Bronte V, Chen PW, et al. Active immunotherapy of cancer with a nonreplicating recombinant fowlpox virus encoding a model tumor-associated antigen. J Immunol, 1995, 154(9): 4685
5，Soussi T. The humoral response to the tumor-suppressor gene-product p53 in human cancer: Implications for diagnosis and therapy. Immunol Today， 1996， 17(8): 354
, http://www.100md.com
6，Tilkin AF, Lubin R, Soussi T, et al. Primary proliferative T cell response to wild-type P53 protein in patients with breast cancer. Eur J Immunol， 1995, 25(6): 1765
7，Fujii H, Inobe M, Kimura F, et al. Vaccination of tumor cells transfected with the B7-1 (CD80) gene induces the anti-metastatic effect and tumor immunity in mice. Int J Cancer, 1996, 66(2): 219
8，Chamberlain RS, Carroll MW, Bronte V, et al. Costimulation enhances the active immunotherapy effect of recombinant anticancer vaccines. Cancer Res， 1996， 56(12): 2832
(1999-09-26收稿； 1999-12-21修回), 百拇医药
单位：张克强 王金惠 李秀森 唐佩弦 毛宁(军事医学科学院基础医学研究所 北京 100850)
关键词：p53；B7；重组痘苗病毒；抗肿瘤
中国肿瘤生物治疗杂志000206
摘 要 目的： 探索点突变p53重组痘苗病毒诱导的抗瘤免疫反应及B7对其加强作用，为重组抗原疫苗用于肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法： 选择人135位Cys→Tyr点突变p53作为肿瘤相关抗原模型，观察以表达该点突变p53的重组痘苗病毒rVV-p53FL单独和联合表达B7的重组痘苗病毒rVV-B7所诱导的CTL及对荷瘤小鼠的免疫保护和治疗作用。 结果: 以rVV-p53FL经静脉免疫BALB/c小鼠能够诱导以CD8+ T细胞为主的特异性CTL。rVV-p53FL能够保护部分小鼠免遭肿瘤细胞的攻击。以rVV-p53FL治疗荷瘤小鼠，可显著延长小鼠平均存活期。rVV-B7与 rVV-p53FL以1∶1的比例混合接种可部分加强rVV-p53FL的治疗作用。结论： 肿瘤细胞内过度表达的突变P53蛋白可作为CTL 识别和攻击的靶抗原，以突变P53蛋白作为肿瘤抗原的疫苗可诱导机体产生p53特异性的抗瘤免疫反应。共刺激分子B7可加强肿瘤抗原诱导的抗瘤免疫反应。
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《中国图书资料分类法》分类号 R730.51
Antitumor Responses Induced by Recombinant Vaccinia Viruses Expressing p53 and B7
Zhang Keqiang Wang Jinhui Li Xiusen Tang Pei-Hsien Mao Ning
(Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850)
Abstract Objective： This study was aimed to explore antitumor responses induced by recombinant vaccinia viruses expressing a point mutant p53 (rVV-p53FL) and enhancive effects of recombinant vaccinia viruses expressing costimulatory molecule B7 (rVV-B7). Methods: A 135 Cys to Tyr point mutant p53 protein was used as the model of tumor associated antigen. rVV-p53FL and rVV-B7 were used as vaccines to test their induction of CTLs and antitumor immunity. Results: Immunization BABL/c mice with rVV-p53FL could elicited specific CD8+ CTLs that could effecively lyse P815-mp53 cells, a transfectant of the murine P815 mastocytoma containing the mutant p53 gene. Treatment with rVV-p53FL could survive a part of mice challenged with 1×106 P815-mp53. Treatment with rVV-p53FL could significantly prolong survival of tumor-bearing mice. Admixture at 1∶1 ratio of rVV-p53FL and rVV-B7 could enhance therapeutic antitumor effects of rVV-p53FL. Conclusion: Mutant P53 over-expressed in tumor cells can render cells targets for specific CTLs generated by immunization with mutant p53 protein based vaccine. Costimulatory molecule B7 can enhance tumor-associated antigen inducing antitumor responses.
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Key words
Key words p53； B7； recombinant vaccinia virus； antitumor
癌基因和抑癌基因的改变是肿瘤细胞的一种共同现象，突变的癌基因和抑癌基因的产物可以成为免疫系统识别和攻击的靶分子。研究表明，p53突变与多种肿瘤的发生和发展密切相关，是肿瘤易感基因之一。p53突变是人类肿瘤最常见的基因改变，因而是靶向性肿瘤免疫治疗极具吸引力的靶分子之一。
T细胞激活双信号模式的提出为B7家族作为共刺激分子转导肿瘤细胞增加免疫原性提供了坚实的理论基础。近年来,将B7和肿瘤抗原疫苗联合应用于肿瘤主动免疫治疗的研究表明,B7分子能够辅助或加强多种肿瘤抗原诱导的抗瘤免疫反应[1]。
本研究选取135位Cys→Tyr点突变P53蛋白为肿瘤相关抗原模型，以转染该点突变p53基因的小鼠肥大细胞瘤P815-mp53为肿瘤细胞模型，研究点突变p53重组痘苗病毒诱导的抗瘤免疫反应和共刺激分子B7对之的加强作用。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂和动物
X-gal,5-Br尿嘧啶脱氧核苷酸(Budr)为Sigma公司产品；LipofectamineTM 试剂，G418 为Gibcobrl公司产品；鼠抗人p53单克隆抗体DOI Ⅰ 为SantCruz公司产品；FITC标记的鼠抗人B7-1单克隆抗体MAB104为Immunotech公司产品；包含135位Cys→Tyr点突变人p53基因的质粒pRC/CMV-p53由美国Carbone博士惠赠；质粒pJSA1175和人骨肉瘤TK-143细胞及野生型痘苗病毒中国天坛761株由中国预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠；DBA/2小鼠肥大瘤细胞P815(H-2d)为本室传代保存；BABL/c小鼠(H-2d)，6～8周龄，雌性，由本院动物中心提供。
1.2 重组痘苗病毒的构建和鉴定
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1.2.1 重组痘苗病毒的构建
将含人135位点突变的p53基因和B7-1基因插入质粒pJSA1175的7.5 k启动子下构建重组质粒pJSA1175-p53与pJSA1175-B7。 将TK+野生型痘苗病毒(wt-VV)按0.1 PFU(plaque forming unite)/细胞感染TK-143细胞后，采用Lipofectamine共转染法将重组质粒导入TK-143细胞，以同源重组的方式获得TK-重组痘苗病毒。在25 μg/ml Budr和200 μg/ml X-gal筛选下得到蓝色重组痘苗病毒噬斑[2]。挑取单个蓝斑，纯化5代至蓝斑纯度达到100%，分别命名为rVV-p53FL和rVV-B7。
1.2.2 Western blot 检测rVV-p53FL的表达
, http://www.100md.com rVV-p53FL感染TK-143细胞48 h后，提取细胞总蛋白。用ECL Western bolt 分析系统试剂盒进行P53蛋白的检测，以野生型痘苗病毒感染的TK-143细胞作为阴性对照。
1.2.3 流式细胞术检测rVV-B7的表达
rVV-B7按10 PFU/细胞的剂量感染TK-143细胞12 h后以FITC直标的鼠抗人B7单克隆抗体标记后，经流式细胞仪分析，计算阳性率，以野生型痘苗病毒感染的TK-143细胞为阴性对照。
1.3 肿瘤细胞系P815-mp53的建立
将质粒pRC/CMV-p53采用Lipofectamine共转染法导入P815细胞，以含600 μg/ml G418的培养液选择抗性克隆，免疫细胞化学染色检测P53蛋白表达，阳性克隆进一步有限稀释再克隆化培养，Western-blot检测P53蛋白的表达，挑选P53表达高全阳性的克隆作为表达突变P53蛋白的肿瘤细胞系命名为P815-mp53，以含600 μg/ml G418的DMEM培养基培养。
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1.4 CTL细胞毒活性测定
将9只小鼠随机分为3组，分别以1×107 PFU wt-VV，1×107 PFU rVV-p53FL，1×107 PFU rVV-p53FL+1×107 PFU rVV-B7经静脉免疫4周后，常规制备免疫鼠脾细胞悬液。(5～6)×106/ml脾细胞分别与经80 μg/ml丝裂霉素C处理45 min的(2～3)×106/ml P815-mp53细胞等体积混合，以含25 U/ml rhIL-2,2×10-3mol/L L-谷氨酸，5×10-5mol/L β-巯基乙醇的培养基培养5 d后，收获脾细胞，用Ficoll(ρ=1.0717)离心，除去死细胞，作为效应细胞[3]。靶细胞为P815-mp53，以P815细胞作为阴性对照。将效应细胞稀释成不同浓度按100 μl/孔接种于96孔U形底培养板，与100 μl靶细胞(1×104)混合，形成不同的效靶比(E∶T)，以乳酸脱氢酶法测定CTL细胞毒活性。
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1.5 CTL细胞表型分析
以2 μg/ml的兔抗鼠CD4与CD8单克隆抗体封闭CTL杀伤试验，探证抗CD4与CD8单克隆抗体对CTL杀伤活性的影响。
1.6 重组痘苗病毒在体内抗肿瘤的实验研究[4]
1.6.1 保护性实验
将21只小鼠，随机分为3组，分别以1×107 PFU wt-VV,1×107 PFU rVV-p53FL和1×107 PFU rVV-p53FL+1×107 PFU rVV-B7静脉免疫4周后，再经尾静脉接种1×106 P815-mp53细胞，记录各免疫组小鼠的存活期和存活动物数。
1.6.2 治疗性实验
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将21只小鼠，随机分为3组，小鼠先经静脉接种1×106的P815-mp53细胞3 d后，再分别在接种后的第3,6天以1×107 PFU wt-VV,1×107 PFU rVV-p53FL和1×107 PFU rVV-p53FL+1×107 PFU rVV-B7经静脉免疫治疗各实验组小鼠，记录各免疫组小鼠的存活期和存活动物数。
2 结 果
2.1 Western blot检测rVV-p53FL的表达
rVV-p53FL以10 PFU/细胞的剂量感染TK-143细胞48 h后，Western blot检测到P53蛋白的表达(图1)。
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图1 Western blot检测rVV-p53FL的表达
Fig. 1 Expression of rVV-p53FL detected by Western blot
2.2 流式细胞仪检测rVV-B7的表达
rVV-B7以10 PFU/细胞的剂量感染TK-143细胞12 h后，流式细胞术分析表明,90%以上的细胞表面有B7的表达。
2.3 重组痘苗病毒诱导的CTL
以rVV-p53FL免疫小鼠可诱导有显著杀伤活性的CTL特异性地杀伤P815-mp53，而不杀伤P815。rVV-B7未能显著加强rVV-p53FL诱导的CTL杀伤活性(图2)。
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图2 重组痘苗病毒诱导的CTL对P815和P815-mp53的杀伤
Fig. 2 Lysis of P815 and P815-mp53 by CTL induced with rVVs
2.4 抗CD4/CD8单克隆抗体对CTL杀伤活性的影响
加入抗CD4单克隆抗体对CTL杀伤活性无显著影响(P>0.05)，而经抗CD8单克隆抗体封闭后，CTL杀伤活性显著降低(P<0.05)，表明CTL杀伤活性主要由CD8+ T细胞介导。
2.5 重组痘苗病毒抗肿瘤实验
2.5.1 保护性实验
重组痘苗病毒以1×107 PFU静脉免疫4周，经静脉接种1×106 P815-mp53细胞后，可保护部分小鼠存活，rVV-B7未能明显加强rVV-p53FL的免疫保护作用(图3)。
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图3 rVVs保护性实验小鼠存活曲线
Fig. 3 Survival curves of mice immunized with rVVs
2.5.2 治疗性实验
经静脉接种致死剂量的P815-mp53 3 d后，经静脉接种1×107 PFU的重组痘病毒能够显著延长治疗组小鼠存活时间(0.01
图4 重组痘苗病毒治疗荷瘤小鼠存活曲线
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Fig. 4 Survival curves of mice treated with rVVs
3 讨 论
痘苗病毒是唯一能够在胞浆内复制的DNA病毒，它不会整合进宿主细胞基因组，无致癌性等问题。作为活疫苗使用，不但能产生体液免疫还能激发细胞免疫，且免疫应答强效持久，一般不需复种。由于痘苗病毒的上述优点，在肿瘤免疫治疗方面一个突出的应用是作为肿瘤特异性抗原的载体用于肿瘤主动免疫治疗。
p53突变不仅导致肿瘤细胞发生恶性表型和功能的变化，而且可以诱导特异性细胞毒T淋巴细胞反应和循环抗体的产生[5，6]，这种过度表达的结构和功能异常的P53蛋白只表达在肿瘤细胞，能够成为机体免疫系统识别和攻击的靶分子。本研究结果表明，突变的P53蛋白能够作为肿瘤免疫系统识别的靶抗原，有可能作为疫苗用于肿瘤免疫治疗。
, 百拇医药 绝大多数肿瘤细胞是低免疫原性或缺乏共刺激分子的表达，这是肿瘤细胞逃逸免疫识别和杀伤的机制之一。许多实验已证实将B7基因导入高免疫原性的肿瘤细胞，能够增加肿瘤细胞的免疫原性，促进T细胞的增殖并诱导机体产生免疫排斥[7]。鉴于脂质体和逆转录病毒载体介导的转染法低效繁琐，Hodge等[1]以表达B7分子的重组痘苗病毒感染肿瘤细胞后，无需任何药物抗性筛选，能在5～10 h内使 90%以上的受感染细胞表达B7分子。以痘苗病毒为载体将B7转导小鼠结肠癌细胞系MC38后再接种小鼠，肿瘤生长明显减缓。Chamberlain等[8]以Lac-Z基因作为肿瘤相关抗原模型，构建了分别表达Lac-Z和B7以及共表达2种分子的重组痘苗病毒，单独应用1种重组痘苗病毒或混合应用2种重组痘苗病毒都未能够诱导出显著的抗瘤免疫反应，但以共表达Lac-Z和B7的重组痘苗病毒免疫小鼠可显著地减少肿瘤的肺转移，延长小鼠的存活时间，本实验的结果基本与上述实验相同。共刺激分子B7未能较显著地加强肿瘤抗原诱导的抗瘤免疫效应的原因可能与所采用的免疫方式有关。研究表明,尽管,静脉免疫能够有效地诱导抗原特异性T细胞免疫反应，但发挥共刺激作用的前提条件是共刺激分子和肿瘤抗原必须表达在非常邻近的范围内。本实验采用静脉免疫可能局限了2种重组痘苗病毒同时感染1个细胞或邻近细胞的概率，制约了共刺激作用最大限度的发挥，推测共表达B7和肿瘤抗原的重组痘苗病毒可能更为有效。
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张克强,男,29岁,博士,助研,主权从事肿瘤免疫治疗的研究
参 考 文 献
1，Hodge JW, Abrams S, Schlom J, et al. Induction of antitumor immunity by recombinant vaccinia viruses expressing B7-1 or B7-2 costimulatory molecules. Cancer Res， 1994， 54(21): 5552
2，Mackett M, Smith GL, Moss B. Vaccinia virus: A selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proc Natl Acad Sci USA， 1982， 79(23): 7415
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3，Restifo NPF, Bacik I, Irvine KR, et al. Antigen processing in vivo and the elicitation of primary CTL responses. J Immunol， 1995， 154: 4414
4，Wang M, Bronte V, Chen PW, et al. Active immunotherapy of cancer with a nonreplicating recombinant fowlpox virus encoding a model tumor-associated antigen. J Immunol, 1995, 154(9): 4685
5，Soussi T. The humoral response to the tumor-suppressor gene-product p53 in human cancer: Implications for diagnosis and therapy. Immunol Today， 1996， 17(8): 354
, http://www.100md.com
6，Tilkin AF, Lubin R, Soussi T, et al. Primary proliferative T cell response to wild-type P53 protein in patients with breast cancer. Eur J Immunol， 1995, 25(6): 1765
7，Fujii H, Inobe M, Kimura F, et al. Vaccination of tumor cells transfected with the B7-1 (CD80) gene induces the anti-metastatic effect and tumor immunity in mice. Int J Cancer, 1996, 66(2): 219
8，Chamberlain RS, Carroll MW, Bronte V, et al. Costimulation enhances the active immunotherapy effect of recombinant anticancer vaccines. Cancer Res， 1996， 56(12): 2832
(1999-09-26收稿； 1999-12-21修回), 百拇医药