逆转录病毒载体介导的核酶基因转移有效恢复肿瘤细胞的化疗敏感性
作者：王福生 金磊 雷周云 H. Kobayashi T. Ohnuma
单位：王福生 金磊 雷周云 H. Kobayashi T. Ohnuma(北京解放军第三○二医院生物工程研究室 北京 100039)
关键词：多重耐药性；核酶；肿瘤细胞；逆转录病毒载体
中国肿瘤生物治疗杂志000205
摘 要 目的： 为了研究抗MDR1核酶逆转肿瘤细胞中P-gp介导的多重耐药性(MDR)的作用。 方法： 首先，我们建立了单纯由P-gp介导的、20倍耐药的人Daudi淋巴瘤细胞的模型-Daudi/MDR20。同时我们将表达不同抗MDR1核酶的逆转录病毒载体(N2A+tRNAimet-196MDR1-Rz，N2A+tRNAimet-196MDR1-sRz 和 N2A+tRNAimet-iMDR1-sRz)转染到GP+envAM12细胞中进行包装，获得了高滴度的病毒[(1.1～2.5)×105 cfu/ml]。后者用于感染Daudi/MDR20。结果： 通过一系列分子生物学检测证实,携带3种核酶的逆转录病毒不但整合到DNA中，而且也高水平表达相应的核酶tRNAimet-iMDR1-sRz，tRNAimet-196MDR1-sRz 和tRNAimet-196MDR1-Rz。结果表明,tRNAimet-iMDR1-sRz和tRNAimet-196MDR1-sRz转导的Daudi/MDR20细胞完全逆转了对长春新碱的敏感性，并伴随着MDR1 mRNA和P-gp表达的阻断。结论： 逆转录病毒载体高效介导的抗MDR1核酶的基因转移能够完全逆转肿瘤细胞中P-gp依赖的MDR。
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《中国图书资料分类法》分类号 Q97
Anti-MDR1 Ribozymes Mediated by Retroviral Vector Efficiently Reverse the Multidrug Resistance (MDR) in Resistant Human Lymphoma Daudi Cells
Wang Fusheng Jin Lei Lei Zhouyun H. Kobayashi T. Ohnuma
(Beijing Institute of Infectious Diseases, No. 26 Feng-Tai Road, Beijing 100039)
Abstract Objective： In order to explore the reversal of the multidrug resistance(MDR) purely related to P-glycoprotein expression by using the anti-MDR1 ribozyme genes. Methods： Daudi human lymphoma cells 20-fold resistant to vincristine (VCR)(Daudi/MDR20) were developed.Three retroviral vectors highly expressing the anti-MDR1 ribozymes: 196MDR1-Rz, 196MDR1-sRz and iMDR1-sRz were also constructed and transfected into GP+envAM12 cells for packaging. The viral supernatants with high titers [(1.1～2.5)×105 cfu/ml] were used to infected Daudi/MDR20 cells. Results： The tRNAimet-iMDR1-sRz and tRNAimet-196MDR1-sRz-transduced Daudi/MDR20 cells effectively restored chemosensitivity to VCR and were accompanied by blocked expression of MDR1 mRNA and P-glycoprotein as well as overexpression of anti-MDR1-Rzs. Conclusion: The high level expressions of anti-MDR1 ribozymes mediated by retroviral vectors appear to have contributed to the efficinet reversal of P-gp-mediated MDR in tumor cells.
, 百拇医药
Key words multidrug resistance (MDR); ribozyme; tumor cells; retroviral vector
化疗是治疗恶性肿瘤的主要方法之一，然而，肿瘤细胞中多重耐药性(multidrug resistance, MDR)的出现严重地阻断了化疗药物的抗肿瘤效应，因此，逆转MDR、提高化疗的成功率是肿瘤治疗中亟待解决的难题。现已证实肿瘤细胞高水平表达MDR1 mRNA和P-gp是MDR中最常见的形式[1,2]，因此抗MDR1的核酶阻断MDR是特异的、有效的策略之一。
近年来，文献报道的抗MDR核酶均没有完全实现对MDR的逆转。其原因可能是靶细胞都是药物诱导的MDR阳性的肿瘤细胞，因而可能存在非P-gp介导的MDR，或向靶细胞中转导的核酶量不足。为解决这两个问题，我们建立了由单纯P-gp介导的MDR阳性的Daudi/MDR20细胞模型[3]。同时构建了高效表达嵌合型核酶逆转录病毒载体[4,5]。结果表明，能有效逆转肿瘤细胞的MDR表型。现将研究结果报道如下。
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1 材料与方法
1.1 细胞系
Daudi细胞系(Daudi/wt)来自美国ATCC，在加入20%FBS的RPMI 1640培养基中培养。GP+env AM12包装的细胞系和NIH/3T3细胞系在含10%热灭活的FBS的DMEM培养基中培养。本实验所用的牛血清和培养基均购自GIBCO公司。
1.2 制备耐药的Daudi/MDR20细胞系
第一步是含表达全长MDR1基因的pHaMDR1/A在GP+envAM12细胞中进行包装，方法同文献[3]。从稳定转导细胞中收集的上清通过0.45 μm滤膜过滤、分装、并保存于-70℃。经检测病毒滴度为(1.5～2.0)×105 cfu/ml[5]。
第二步是将2×106 Daudi/wt细胞悬于10 ml RPMI 1640培养基中，在含有8 μg/ml 聚乙胺(polybrene)情况下，用包装好的pHaMDR1/A感染细胞。3次感染后，耐药的细胞(称作Daudi/MDR20)生长于选择性RPMI 1640培养基中(含20%FBS和1×10-8mol/L VCR)。而原来的Daudi/wt细胞不能在VCR选择培养基中存活[5]。
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1.3 表达嵌合型核酶的逆转录病毒载体的构建
我们在196MDR1-Rz(催化切割MDR1 mRNA第196位GUC编码子)研究基础上[1]，为了增加核酶结构上的稳定性，对核酶Stem-Ⅱ结构中的4个碱基进行了改变，即设计了196MDR1-sRz (U9→G9,U13→A13,G14→A14,A18→C18)[5]。除了196MDR1-sRz外，我们还设计了stem-Ⅱ上经过修饰的、针对MDR1 mRNA转录起始部位的-6～-4 GUC编码子的核酶(iMDR1-sRz)。此外,在实验中还设计了点突变的修饰而丧失生物学活性的mut-iMDR1-sRz(G3→U3,A22→C22)和原有的196MDR1-Rz作为必要的对照。将锤头状核酶cDNA分别被插入N2A+tRNAimet载体的Sac Ⅱ/Mlu Ⅰ位点中，形成了N2A+tRNAimet-196MDR1-Rz，N2A+tRNAimet-196MDR1-sRz，N2A+tRNAimet-iMDR1-sRz 和N2A+ tRNAimet-mut-iMDR1-sRz，在Poly Ⅲ启动子的作用下，可高效表达嵌合型核酶分子[5]。
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1.4 携带核酶基因的逆转录病毒载体的包装及其转导Daudi/MDR20细胞
第一步：携带不同核酶基因的逆转录病毒载体N2A+tRNAimet-196MDR1-Rz，N2A+tRNAimet-196MDR1-sRz，N2A+tRNAimet-iMDR1-sRz和N2A+tRNAimet-mut-iMDR1-sRz 在GP+envAm12细胞中包装方法同前。病毒滴度为(1.1～2.5)×105 cfu/ml。
第二步：在10 ml含有8 μg/ml 聚乙胺的RPMI 1640的培养基中，1×106 Daudi/MDR20细胞经过逆转录病毒的感染的步骤同1.2。根据感染的逆转录病毒载体的不同，G418筛选的Daudi/MDR20细胞被分别命名为Daudi/MDR20-196MDR1-Rz,Daudi/MDR20-196MDR1-sRz,Daudi/MDR20-iMDR1-sRz和Daudi/MDR20-mut-iMDR1-sRz，将它们分别培养于含20%FBS的RPMI-1640培养基中。
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1.5 MTT检测
Daudi/wt，Daudi/MDR20和核酶转导的Daudi/MDR20等细胞对VCR的敏感性通过MTT方法确定[1]。
1.6 Northern杂交和Southern印迹
为确定Daudi细胞中MDR1的表达及P-gp的产生，分别进行Northern杂交和Western Blot的检测[7，8]。Western分析用ECL Western Blotting试剂盒(Amersham公司)和C494鼠抗人P-gp单抗(Signet公司)[1]。Northern Blot 分析所使用的总细胞RNA用TRIzol试剂(Life Technologies公司)提取。RNA电泳、转移至硝酸纤维素膜及杂交以标准方法进行。全长MDR1 cDNA用[γ-32P] dCTP标记并作为杂交探针[7]。
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1.7 PCR和RT-PCR检测
用PCR方法证实逆转录病毒能否整合到靶细胞染色体DNA上。PCR引物1: 5′-AACAGCAGAGTGGCGCA GCGGAA-3′(23 mer),引物2：5′-GACCTTGATCTGAA CTTCTC-3′ (20 mer)。PCR的模板来自于逆转录病毒转导的各亚细胞系的基因组DNA。PCR条件同上[1]。
用RT-PCR鉴定靶细胞中核酶基因的表达水平。先提取待检测的细胞总RNA，后者经RNase-free DNase Ⅰ消化除去残留的DNA。用GIBCO公司的逆转录试剂盒和Rz-top引物链(5′-AACAGCAGAGTGGCG CAGCGGAA-3′， 23 mer)合成第一条cDNA链。然后，分别用Rz-top和相应的4条链(196MDR1-Rz-bottom, 5′-TCTT TCAGTTTCGTCCTCACG-3′; 196MDR1-sRz-bottom, 5′-TCT TTCAGTTTCGGCCTTTCG-3′; iMDR1-sRz-bottom, 5′-GCG CGAGGTTTCGGCCTTTCG-3′; mut-iMDR-sRz-bottom, 5′-GCGCGAGGTGTCGGCCTTTCG-3′)进行PCR扩增[1]，反应结束后，分别取10 μl的PCR产物进行琼脂糖电泳分析。
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2 结 果
2.1 耐药的系建立Daudi/MDR20细胞
我们用包装的pHaMDR1/A感染Daudi/wt细胞，获得了对VCR耐药的亚细胞系，它的ID50是2.59×10-8 mol/L(VCR浓度)，而Daudi/wt细胞的ID50为1.3×10-9 mol/L, 两者相差20倍，故将耐药的细胞命名为Daudi/MDR20。通过检测，我们还发现Daudi/MDR20对阿霉素(doxorubicin)有相似的耐药性。
2.2 逆转录病毒介导核酶基因转导的Daudi/MDR20亚细胞系的制备和鉴定
在1.4步骤中，获得了Daudi/MDR20-196MDR1-Rz,Daudi/MDR20-196MDR1-sRz,Daudi/MDR20-iMDR1-sRz和Daudi/MDR20-mut-iMDR-sRz 4株亚细胞系。所有这些细胞倍增时间大约为20 h。May-Giemsa染色显示,它们与Daudi/wt细胞没有形态和生长行为方面的差别。在上述各细胞系中，PCR检测到产物分子量为210 bp，和预计插入的外源核酶基因片段大小完全一致。这证实含抗MDR1核酶基因的逆转录病毒载体已经整合到靶细胞的基因组DNA中。图1显示了核酶转导的各亚细胞系中MDR1 mRNA和 P-gp的表达水平的检测结果。Daudi/wt细胞既不表达MDR1 mRNA又不表达P-gp。但在Daudi/MDR20细胞中，MDR1 mRNA和P-gp都高水平的表达[1]；在Daudi/MDR20-iMDR1-sRz和Daudi/MDR20-196MDR1-sRz中两者几乎被完全抑制，在Daudi/MDR20-196MDR1-Rz中仍然可以检测到很低水平的P-gp表达(约为10%)，而Daudi/MDR20-mut-iMDR-sRz中MDR1 mRNA及P-gp的表达量和Daudi/MDR20细胞的相同。
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图1 肿瘤细胞中表达的MDR1 mRNA和P-gp水平分析
Fig. 1 Analysis of P-glycoprotein production and
MDR1 mRNA levels
Lane 1： Daudi/wt; Lane 2： Daudi/MDR20;
Lane 3： Daudi/MDR20-iMDR1-sRz;
Lane 4: Daudi/MDR20-196MDR1-sRz;
Lane 5： Daudi/MDR20-196MDR1-Rz;
Lane 6： Daudi/MDR20-mut-iMDR1-sRz
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2.3 抗MDR1 mRNA核酶的表达
在对上述各亚细胞系中MDR1 mRNA和 P-gp检测的同时，我们还应用RT-PCR技术，对Daudi/wt，Daudi/MDR20和核酶转导的Daudi/MDR20-iMDR1-sRz，Daudi/MDR20-196MDR1-sRz，Daudi/MDR20-196MDR1-Rz和Daudi/
MDR20-mut-iMDR-sRz 6种细胞系进行了检测，结果表明,在后4种亚细胞系中,所有嵌合型核酶的表达水平基本一致(图2)。
图2 用RT-PCR法测定肿瘤细胞中抗-MDR1核酶的表达水平
Fig. 2 The detection of the anti-MDR1 ribozyme
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expressions in retrovirus-transduced Daudi/MDR20
sublines by using the RT-PCR assay.
Lane 1～6: The order number is the same as shown in Fig. 1.
The expression levels of three active ribozymes and one disabled
ribozyme (lane 3～6) were almost identical.
2.4 检测MDR表型的逆转
图3显示了Daudi/wt细胞和Daudi/MDR20细胞以及抗MDR1核酶转导的细胞系对VCR的敏感性。196MDR1-Rz转导的细胞仍然保持大约2倍的VCR耐药性，而iMDR1-sRz和196MDR1-sRz转导的Daudi/MDR20细胞则完全恢复了VCR的敏感性。mut-iMDR-sRz对VCR的敏感性没有作用。
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图3 逆转录病毒载体介导的3种核酶转移后，Daudi/MDR20细胞耐药性的逆转
Fig. 3 Reversal of MDR in Daudi/MDR20 cells with transfer of
three anti-MDR1 ribozymes mediated by a retroviral vector
Each point represents the mean of 3 independent
riplicate experiments. Transduction of iMDR1-sRz or
196MDR1-sRz resulted in a complete reversal of MDR.
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3 讨 论
研究证明,Anti-MDR1核酶方案用于恢复MDR阳性的肿瘤细胞化疗敏感性是有效的[1,2,9,10]。为了避免非P-gp介导的MDR等因素的干扰，我们在本研究中建立了低耐药细胞株Daudi/MDR20，它对VCR的抗性比Daudi/wt细胞高20倍。重要的是这种低耐药的肿瘤细胞类似于临床上肿瘤病人体内产生的MDR，但由于病人体内的MDR常为多种因素所致，而Daudi/MDR20中MDR完全由单纯表达P-gp介导的，因而，排除了其它MDR因素的干扰。所以，Daudi/MDR20细胞为抗MDR1核酶的研究提供了一个最合适的细胞模型。
我们发现应用空载体逆转录病毒本身转导对Daudi/MDR20细胞形态和生长行为(如群体倍增时间和表型)无明显的影响，所以Daudi细胞的药物敏感性变化不可能源于此。同样，转导mut-iMDR-sRz并不影响细胞的生长，且这些突变失活的核酶转导的细胞和原始的Daudi/MDR20细胞的抗性相同。
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我们以往的研究结果提示，有效地逆转肿瘤细胞的MDR不但依赖于核酶生物学活性、分子的稳定性，而且还依赖于尽可能转导更多的核酶分子进入靶细胞，通过增加核酶和底物RNA的分子比进一步提高抗MDR核酶的切割活性。近来，我们在体外无细胞体系中发现stem Ⅱ修饰的嵌合型核酶tRNAimet-196MDR1-sRz和 tRNAimet-iMDR1-sRz具有最高的生物学活性和稳定性，tRNAimet-196MDR1-Rz次之，非嵌合型核酶196MDR1-sRz较低。在本实验中，我们得到类似的结果，即嵌合型核酶tRNAimet-196MDR1-sRz和 tRNAimet-iMDR1-sRz能完全逆转肿瘤细胞对VCR的敏感性，tRNAimet-196MDR1-Rz能逆转90%以上敏感性；并伴随着MDR1 mRNA和P-gp表达受阻。因为，细胞膜上P-gp属于ABC(ATP-binding cassette)家族成员，可发挥膜泵的作用，将药物泵出细胞膜外,降低细胞内化疗药物的浓度，引起MDR。我们通过对核酶转导的肿瘤细胞膜上P-gp分布进行FACS分析，图形显示与野生型的Daudi细胞一致，进一步确定了核酶阻断了细胞中P-gp的表达。
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上述嵌合型核酶除了能逆转Daudi/MDR20对VCR的敏感性以外，同样也能逆转肿瘤细胞对阿霉素的敏感性，所以，抗MDR1核酶对具有P-gp介导的多重耐药性具有普遍的逆转作用。我们初步推测是由于逆转录病毒具有高效转基因能力，它含有的高表达Polymerase Ⅲ启动子能提高肿瘤细胞内表达的核酶的浓度。这些因素可能共同促使Daudi/MDR20中MDR的完全逆转。
本课题受国家自然科学基金(39970831)资助
王福生,男,38岁,教授
参 考 文 献
1，Kobayashi H, Dorai T, Holland JF, et al. Revesal of drug sensitivity in multidrug-resistant tumor cells by an MDR1 (PGY1)ribozyme. Cancer Res， 1994, 54: 1271
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2 Bellamy WT. P-glycoproteins and multidrug resistance. Ann Rev Pharmacol Toxicol， 1996， 36: 161
3，Aksentijevich I, Cardarelli CO， Pastan I， et al.Retroviral transfer of the human MDR1 gene confers resistance to bisantrene-specific hematotoxicity. Clin Cancer Res， 1996， 2： 973
4，Hantzopoulos PA, Sullenger BA, Ungers G， et al. Improved gene expression upon transfer of the adenosine deaminase minigene outside of the transcriptional unit of a rertroviral vector. Proc Natl Acad Sci USA， 1989， 86: 3519
, 百拇医药
5，王福生， 雷周云， 金 磊, 等. 抗耐药肿瘤细胞MDR1 mRNA的嵌合型核酶(tRNA-Rz)的构建及其生物学特性的研究. 中华肿瘤杂志， 2000, 22(3): 184
6，Cepco C. Preparation of a specific retrovirus producer cell line. In: Ausubel FM, et al. Current Protocols in Molecular Biology, 3rd ed. New York: John Wiley & Sons Publisher, 1995
7，Brown T， Mackey K. Analysis of RNA by northern and slot blot hybridization. In: Ausubel FM, et al. Current Protocols in Molecular Biology， 3rd ed. New York: John Wiley & Sons Publisher, 1995
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8，Gallagher S, Winston SE, Fuller SA， et al. Immunoblotting and immunodetection. In: Ausubel FM, et al. Current Protocols in Molecular Biology， 3rd ed. New York: John Wiley & Sons Publisher, 1995
9，Holm PS, Scanlon KJ， Dietel M. Reversal of MDR in the P-glycoprotein-positive human pancreatic cell line (EPP85-181RDB) by introduction of a hammerhead ribozyme. Br J Cancer， 1994， 70: 239
10，Scanlon KJ, Ishida H， Kashani-Sabet M. Ribozyme-mediated reversal of the multidrug-resistant phenotype. Proc Natl Acad Sci USA， 1994， 91:123
11，Sullivan SM. Development of ribozymes for gene therapy. J Invest Dermatol， 1994， 103: 85S
(1999-07-05收稿； 1999-09-16修回), 百拇医药
单位：王福生 金磊 雷周云 H. Kobayashi T. Ohnuma(北京解放军第三○二医院生物工程研究室 北京 100039)
关键词：多重耐药性；核酶；肿瘤细胞；逆转录病毒载体
中国肿瘤生物治疗杂志000205
摘 要 目的： 为了研究抗MDR1核酶逆转肿瘤细胞中P-gp介导的多重耐药性(MDR)的作用。 方法： 首先，我们建立了单纯由P-gp介导的、20倍耐药的人Daudi淋巴瘤细胞的模型-Daudi/MDR20。同时我们将表达不同抗MDR1核酶的逆转录病毒载体(N2A+tRNAimet-196MDR1-Rz，N2A+tRNAimet-196MDR1-sRz 和 N2A+tRNAimet-iMDR1-sRz)转染到GP+envAM12细胞中进行包装，获得了高滴度的病毒[(1.1～2.5)×105 cfu/ml]。后者用于感染Daudi/MDR20。结果： 通过一系列分子生物学检测证实,携带3种核酶的逆转录病毒不但整合到DNA中，而且也高水平表达相应的核酶tRNAimet-iMDR1-sRz，tRNAimet-196MDR1-sRz 和tRNAimet-196MDR1-Rz。结果表明,tRNAimet-iMDR1-sRz和tRNAimet-196MDR1-sRz转导的Daudi/MDR20细胞完全逆转了对长春新碱的敏感性，并伴随着MDR1 mRNA和P-gp表达的阻断。结论： 逆转录病毒载体高效介导的抗MDR1核酶的基因转移能够完全逆转肿瘤细胞中P-gp依赖的MDR。
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《中国图书资料分类法》分类号 Q97
Anti-MDR1 Ribozymes Mediated by Retroviral Vector Efficiently Reverse the Multidrug Resistance (MDR) in Resistant Human Lymphoma Daudi Cells
Wang Fusheng Jin Lei Lei Zhouyun H. Kobayashi T. Ohnuma
(Beijing Institute of Infectious Diseases, No. 26 Feng-Tai Road, Beijing 100039)
Abstract Objective： In order to explore the reversal of the multidrug resistance(MDR) purely related to P-glycoprotein expression by using the anti-MDR1 ribozyme genes. Methods： Daudi human lymphoma cells 20-fold resistant to vincristine (VCR)(Daudi/MDR20) were developed.Three retroviral vectors highly expressing the anti-MDR1 ribozymes: 196MDR1-Rz, 196MDR1-sRz and iMDR1-sRz were also constructed and transfected into GP+envAM12 cells for packaging. The viral supernatants with high titers [(1.1～2.5)×105 cfu/ml] were used to infected Daudi/MDR20 cells. Results： The tRNAimet-iMDR1-sRz and tRNAimet-196MDR1-sRz-transduced Daudi/MDR20 cells effectively restored chemosensitivity to VCR and were accompanied by blocked expression of MDR1 mRNA and P-glycoprotein as well as overexpression of anti-MDR1-Rzs. Conclusion: The high level expressions of anti-MDR1 ribozymes mediated by retroviral vectors appear to have contributed to the efficinet reversal of P-gp-mediated MDR in tumor cells.
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Key words multidrug resistance (MDR); ribozyme; tumor cells; retroviral vector
化疗是治疗恶性肿瘤的主要方法之一，然而，肿瘤细胞中多重耐药性(multidrug resistance, MDR)的出现严重地阻断了化疗药物的抗肿瘤效应，因此，逆转MDR、提高化疗的成功率是肿瘤治疗中亟待解决的难题。现已证实肿瘤细胞高水平表达MDR1 mRNA和P-gp是MDR中最常见的形式[1,2]，因此抗MDR1的核酶阻断MDR是特异的、有效的策略之一。
近年来，文献报道的抗MDR核酶均没有完全实现对MDR的逆转。其原因可能是靶细胞都是药物诱导的MDR阳性的肿瘤细胞，因而可能存在非P-gp介导的MDR，或向靶细胞中转导的核酶量不足。为解决这两个问题，我们建立了由单纯P-gp介导的MDR阳性的Daudi/MDR20细胞模型[3]。同时构建了高效表达嵌合型核酶逆转录病毒载体[4,5]。结果表明，能有效逆转肿瘤细胞的MDR表型。现将研究结果报道如下。
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1 材料与方法
1.1 细胞系
Daudi细胞系(Daudi/wt)来自美国ATCC，在加入20%FBS的RPMI 1640培养基中培养。GP+env AM12包装的细胞系和NIH/3T3细胞系在含10%热灭活的FBS的DMEM培养基中培养。本实验所用的牛血清和培养基均购自GIBCO公司。
1.2 制备耐药的Daudi/MDR20细胞系
第一步是含表达全长MDR1基因的pHaMDR1/A在GP+envAM12细胞中进行包装，方法同文献[3]。从稳定转导细胞中收集的上清通过0.45 μm滤膜过滤、分装、并保存于-70℃。经检测病毒滴度为(1.5～2.0)×105 cfu/ml[5]。
第二步是将2×106 Daudi/wt细胞悬于10 ml RPMI 1640培养基中，在含有8 μg/ml 聚乙胺(polybrene)情况下，用包装好的pHaMDR1/A感染细胞。3次感染后，耐药的细胞(称作Daudi/MDR20)生长于选择性RPMI 1640培养基中(含20%FBS和1×10-8mol/L VCR)。而原来的Daudi/wt细胞不能在VCR选择培养基中存活[5]。
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1.3 表达嵌合型核酶的逆转录病毒载体的构建
我们在196MDR1-Rz(催化切割MDR1 mRNA第196位GUC编码子)研究基础上[1]，为了增加核酶结构上的稳定性，对核酶Stem-Ⅱ结构中的4个碱基进行了改变，即设计了196MDR1-sRz (U9→G9,U13→A13,G14→A14,A18→C18)[5]。除了196MDR1-sRz外，我们还设计了stem-Ⅱ上经过修饰的、针对MDR1 mRNA转录起始部位的-6～-4 GUC编码子的核酶(iMDR1-sRz)。此外,在实验中还设计了点突变的修饰而丧失生物学活性的mut-iMDR1-sRz(G3→U3,A22→C22)和原有的196MDR1-Rz作为必要的对照。将锤头状核酶cDNA分别被插入N2A+tRNAimet载体的Sac Ⅱ/Mlu Ⅰ位点中，形成了N2A+tRNAimet-196MDR1-Rz，N2A+tRNAimet-196MDR1-sRz，N2A+tRNAimet-iMDR1-sRz 和N2A+ tRNAimet-mut-iMDR1-sRz，在Poly Ⅲ启动子的作用下，可高效表达嵌合型核酶分子[5]。
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1.4 携带核酶基因的逆转录病毒载体的包装及其转导Daudi/MDR20细胞
第一步：携带不同核酶基因的逆转录病毒载体N2A+tRNAimet-196MDR1-Rz，N2A+tRNAimet-196MDR1-sRz，N2A+tRNAimet-iMDR1-sRz和N2A+tRNAimet-mut-iMDR1-sRz 在GP+envAm12细胞中包装方法同前。病毒滴度为(1.1～2.5)×105 cfu/ml。
第二步：在10 ml含有8 μg/ml 聚乙胺的RPMI 1640的培养基中，1×106 Daudi/MDR20细胞经过逆转录病毒的感染的步骤同1.2。根据感染的逆转录病毒载体的不同，G418筛选的Daudi/MDR20细胞被分别命名为Daudi/MDR20-196MDR1-Rz,Daudi/MDR20-196MDR1-sRz,Daudi/MDR20-iMDR1-sRz和Daudi/MDR20-mut-iMDR1-sRz，将它们分别培养于含20%FBS的RPMI-1640培养基中。
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1.5 MTT检测
Daudi/wt，Daudi/MDR20和核酶转导的Daudi/MDR20等细胞对VCR的敏感性通过MTT方法确定[1]。
1.6 Northern杂交和Southern印迹
为确定Daudi细胞中MDR1的表达及P-gp的产生，分别进行Northern杂交和Western Blot的检测[7，8]。Western分析用ECL Western Blotting试剂盒(Amersham公司)和C494鼠抗人P-gp单抗(Signet公司)[1]。Northern Blot 分析所使用的总细胞RNA用TRIzol试剂(Life Technologies公司)提取。RNA电泳、转移至硝酸纤维素膜及杂交以标准方法进行。全长MDR1 cDNA用[γ-32P] dCTP标记并作为杂交探针[7]。
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1.7 PCR和RT-PCR检测
用PCR方法证实逆转录病毒能否整合到靶细胞染色体DNA上。PCR引物1: 5′-AACAGCAGAGTGGCGCA GCGGAA-3′(23 mer),引物2：5′-GACCTTGATCTGAA CTTCTC-3′ (20 mer)。PCR的模板来自于逆转录病毒转导的各亚细胞系的基因组DNA。PCR条件同上[1]。
用RT-PCR鉴定靶细胞中核酶基因的表达水平。先提取待检测的细胞总RNA，后者经RNase-free DNase Ⅰ消化除去残留的DNA。用GIBCO公司的逆转录试剂盒和Rz-top引物链(5′-AACAGCAGAGTGGCG CAGCGGAA-3′， 23 mer)合成第一条cDNA链。然后，分别用Rz-top和相应的4条链(196MDR1-Rz-bottom, 5′-TCTT TCAGTTTCGTCCTCACG-3′; 196MDR1-sRz-bottom, 5′-TCT TTCAGTTTCGGCCTTTCG-3′; iMDR1-sRz-bottom, 5′-GCG CGAGGTTTCGGCCTTTCG-3′; mut-iMDR-sRz-bottom, 5′-GCGCGAGGTGTCGGCCTTTCG-3′)进行PCR扩增[1]，反应结束后，分别取10 μl的PCR产物进行琼脂糖电泳分析。
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2 结 果
2.1 耐药的系建立Daudi/MDR20细胞
我们用包装的pHaMDR1/A感染Daudi/wt细胞，获得了对VCR耐药的亚细胞系，它的ID50是2.59×10-8 mol/L(VCR浓度)，而Daudi/wt细胞的ID50为1.3×10-9 mol/L, 两者相差20倍，故将耐药的细胞命名为Daudi/MDR20。通过检测，我们还发现Daudi/MDR20对阿霉素(doxorubicin)有相似的耐药性。
2.2 逆转录病毒介导核酶基因转导的Daudi/MDR20亚细胞系的制备和鉴定
在1.4步骤中，获得了Daudi/MDR20-196MDR1-Rz,Daudi/MDR20-196MDR1-sRz,Daudi/MDR20-iMDR1-sRz和Daudi/MDR20-mut-iMDR-sRz 4株亚细胞系。所有这些细胞倍增时间大约为20 h。May-Giemsa染色显示,它们与Daudi/wt细胞没有形态和生长行为方面的差别。在上述各细胞系中，PCR检测到产物分子量为210 bp，和预计插入的外源核酶基因片段大小完全一致。这证实含抗MDR1核酶基因的逆转录病毒载体已经整合到靶细胞的基因组DNA中。图1显示了核酶转导的各亚细胞系中MDR1 mRNA和 P-gp的表达水平的检测结果。Daudi/wt细胞既不表达MDR1 mRNA又不表达P-gp。但在Daudi/MDR20细胞中，MDR1 mRNA和P-gp都高水平的表达[1]；在Daudi/MDR20-iMDR1-sRz和Daudi/MDR20-196MDR1-sRz中两者几乎被完全抑制，在Daudi/MDR20-196MDR1-Rz中仍然可以检测到很低水平的P-gp表达(约为10%)，而Daudi/MDR20-mut-iMDR-sRz中MDR1 mRNA及P-gp的表达量和Daudi/MDR20细胞的相同。
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图1 肿瘤细胞中表达的MDR1 mRNA和P-gp水平分析
Fig. 1 Analysis of P-glycoprotein production and
MDR1 mRNA levels
Lane 1： Daudi/wt; Lane 2： Daudi/MDR20;
Lane 3： Daudi/MDR20-iMDR1-sRz;
Lane 4: Daudi/MDR20-196MDR1-sRz;
Lane 5： Daudi/MDR20-196MDR1-Rz;
Lane 6： Daudi/MDR20-mut-iMDR1-sRz
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2.3 抗MDR1 mRNA核酶的表达
在对上述各亚细胞系中MDR1 mRNA和 P-gp检测的同时，我们还应用RT-PCR技术，对Daudi/wt，Daudi/MDR20和核酶转导的Daudi/MDR20-iMDR1-sRz，Daudi/MDR20-196MDR1-sRz，Daudi/MDR20-196MDR1-Rz和Daudi/
MDR20-mut-iMDR-sRz 6种细胞系进行了检测，结果表明,在后4种亚细胞系中,所有嵌合型核酶的表达水平基本一致(图2)。
图2 用RT-PCR法测定肿瘤细胞中抗-MDR1核酶的表达水平
Fig. 2 The detection of the anti-MDR1 ribozyme
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expressions in retrovirus-transduced Daudi/MDR20
sublines by using the RT-PCR assay.
Lane 1～6: The order number is the same as shown in Fig. 1.
The expression levels of three active ribozymes and one disabled
ribozyme (lane 3～6) were almost identical.
2.4 检测MDR表型的逆转
图3显示了Daudi/wt细胞和Daudi/MDR20细胞以及抗MDR1核酶转导的细胞系对VCR的敏感性。196MDR1-Rz转导的细胞仍然保持大约2倍的VCR耐药性，而iMDR1-sRz和196MDR1-sRz转导的Daudi/MDR20细胞则完全恢复了VCR的敏感性。mut-iMDR-sRz对VCR的敏感性没有作用。
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图3 逆转录病毒载体介导的3种核酶转移后，Daudi/MDR20细胞耐药性的逆转
Fig. 3 Reversal of MDR in Daudi/MDR20 cells with transfer of
three anti-MDR1 ribozymes mediated by a retroviral vector
Each point represents the mean of 3 independent
riplicate experiments. Transduction of iMDR1-sRz or
196MDR1-sRz resulted in a complete reversal of MDR.
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3 讨 论
研究证明,Anti-MDR1核酶方案用于恢复MDR阳性的肿瘤细胞化疗敏感性是有效的[1,2,9,10]。为了避免非P-gp介导的MDR等因素的干扰，我们在本研究中建立了低耐药细胞株Daudi/MDR20，它对VCR的抗性比Daudi/wt细胞高20倍。重要的是这种低耐药的肿瘤细胞类似于临床上肿瘤病人体内产生的MDR，但由于病人体内的MDR常为多种因素所致，而Daudi/MDR20中MDR完全由单纯表达P-gp介导的，因而，排除了其它MDR因素的干扰。所以，Daudi/MDR20细胞为抗MDR1核酶的研究提供了一个最合适的细胞模型。
我们发现应用空载体逆转录病毒本身转导对Daudi/MDR20细胞形态和生长行为(如群体倍增时间和表型)无明显的影响，所以Daudi细胞的药物敏感性变化不可能源于此。同样，转导mut-iMDR-sRz并不影响细胞的生长，且这些突变失活的核酶转导的细胞和原始的Daudi/MDR20细胞的抗性相同。
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我们以往的研究结果提示，有效地逆转肿瘤细胞的MDR不但依赖于核酶生物学活性、分子的稳定性，而且还依赖于尽可能转导更多的核酶分子进入靶细胞，通过增加核酶和底物RNA的分子比进一步提高抗MDR核酶的切割活性。近来，我们在体外无细胞体系中发现stem Ⅱ修饰的嵌合型核酶tRNAimet-196MDR1-sRz和 tRNAimet-iMDR1-sRz具有最高的生物学活性和稳定性，tRNAimet-196MDR1-Rz次之，非嵌合型核酶196MDR1-sRz较低。在本实验中，我们得到类似的结果，即嵌合型核酶tRNAimet-196MDR1-sRz和 tRNAimet-iMDR1-sRz能完全逆转肿瘤细胞对VCR的敏感性，tRNAimet-196MDR1-Rz能逆转90%以上敏感性；并伴随着MDR1 mRNA和P-gp表达受阻。因为，细胞膜上P-gp属于ABC(ATP-binding cassette)家族成员，可发挥膜泵的作用，将药物泵出细胞膜外,降低细胞内化疗药物的浓度，引起MDR。我们通过对核酶转导的肿瘤细胞膜上P-gp分布进行FACS分析，图形显示与野生型的Daudi细胞一致，进一步确定了核酶阻断了细胞中P-gp的表达。
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上述嵌合型核酶除了能逆转Daudi/MDR20对VCR的敏感性以外，同样也能逆转肿瘤细胞对阿霉素的敏感性，所以，抗MDR1核酶对具有P-gp介导的多重耐药性具有普遍的逆转作用。我们初步推测是由于逆转录病毒具有高效转基因能力，它含有的高表达Polymerase Ⅲ启动子能提高肿瘤细胞内表达的核酶的浓度。这些因素可能共同促使Daudi/MDR20中MDR的完全逆转。
本课题受国家自然科学基金(39970831)资助
王福生,男,38岁,教授
参 考 文 献
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3，Aksentijevich I, Cardarelli CO， Pastan I， et al.Retroviral transfer of the human MDR1 gene confers resistance to bisantrene-specific hematotoxicity. Clin Cancer Res， 1996， 2： 973
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11，Sullivan SM. Development of ribozymes for gene therapy. J Invest Dermatol， 1994， 103: 85S
(1999-07-05收稿； 1999-09-16修回), 百拇医药