黑色素瘤B16细胞热休克蛋白-抗原肽复合物的体内外抑瘤效应
作者：杨英 李秀娟 孙祖月 龚守良 李修义
单位：杨英 李秀娟 孙祖月 龚守良 李修义(白求恩医科大学卫生部放射生物重点实验室 长春 130021)
关键词：热休克蛋白-抗原肽复合物(HAC)；细胞毒T淋巴细胞(CTL)；抑瘤作用
中国肿瘤生物治疗杂志000213
摘 要 目的: 黑色素瘤B16细胞胞浆HSP-抗原肽复合物(HAC)的制备、免疫原性的诱导及其抑瘤作用的研究。方法: 采用Tris-HCl提取和Sephacryl S-200凝胶过滤制备B16细胞HAC，通过C57BL/6J小鼠体内诱导特异性CTL，再经体内、体外实验检测其抑瘤作用。结果: 凝胶过滤获得的含60～97 kD蛋白的41,47和53管的HAC可以降低肿瘤发生率、延长肿瘤出现时间及降低小鼠死亡率。结论: B16 细胞胞浆中的60～97 kD的HAC具有免疫原性及抑瘤作用，为制备肿瘤疫苗提供了实验依据。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R730.3
in vivo and in vitro Anti-Tumor Effeciency of B16 Melanoma HSP-Antigen Peptide Complex (HAC)
Yang Ying Li Xiujuan Sun Zuyue Gong Shouliang Li Xiuyi
(MH Radiobiology Research Unit, Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021)
Abstract Objective: To investigate the anti-tumor efficiency of B16 melanoma HACs in vivo and in vitro. Methods: Tris-HCl extract and Sephacryl S-200 gel filtration were applied to prepare B16 HACs, and the cytoloxicity of specific CTL induced by HACs was tested. Results: The 41, 47 and 53 tube HACs obtained by gel filtration could decrease the tumor incidences, delay the time of tumor development and decrease the mortalitites of mice. Conclusion: 60～97 kD HACs from B16 melanoma cytosol have the activites of inhibiting tumor and could be used in effective anti-tumor therapy.
, 百拇医药
Key words HSP-antigen peptide complex (HAC)； cytotoxic T lymphocyte； inhibiting tumor activity
热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是一类在生物进化中高度保守、广泛存在于原核、真核生物中的蛋白质，具有“分子伴侣”(molecular chaperone)作用，参与多种胞内蛋白的折叠、装配和转运[1，2]等功能。机体在受到高温或其他因素强烈刺激时，常可检测到具有保护作用的HSP[3]。近年来发现，HAC与肿瘤免疫密切相关[4]。本研究选取恶性度较高的黑色素瘤B16细胞，提取胞浆蛋白，诱导小鼠的特异性CTL，并观察其抑瘤作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物和细胞株
, 百拇医药
C57BL/6J纯系小鼠, 雌性，体重18±2 g, 健康,购自白求恩医科大学实验动物部。黑色素瘤B16 细胞由日本北里大学惠赠。
1.2 B16细胞悬液制备
于C57BL/6J小鼠后腿部皮下接种5×105个B16 细胞，21 d后处死，剥离瘤组织于RPMI 1640培养液中，剪碎后用毛玻璃片研磨，200目尼龙网过滤，1 000 r/min，离心5 min。用PBS液洗2次。
1.3 B16细胞胞浆蛋白的提取[5]
将离心沉淀所得的细胞用裂解液 [0.05 mol/L Tris -HCl (pH 7.2), 含0.5 mol/L NaCl, 0.1 mmol/L PMSF, 0.1% Aprotinin] 洗涤1次，1 500 r/min，离心5 min, 去上清后，用1倍于细胞体积的上述裂解液匀浆，至胞膜破碎后离心 (3 000 r/min, 10 min)。吸出上清，4℃ 保存备用。以上步骤均在冰浴条件下进行。
, 百拇医药
1.4 Sephacryl S-200 凝胶过滤[6]
将提取的胞浆蛋白通过Sephacryl S-200 凝胶过滤，玻璃柱为2.0 cm×80 cm, 洗脱液为0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.2), 0.15 mol/L NaCl, 流速为0.01 ml/min, 每秋5 ml，洗脱20 h。用紫外分光光度计监测蛋白浓度。
1.5 SDS-PAGE凝胶电泳[7]
选取凝胶过滤所得的不同管蛋白进行电泳，以确定其分子量。分离胶浓度为10%，标准蛋白分子量为97.4， 66.2， 42.7， 31.0和14.4。
1.6 体内杀伤活性实验
根据SDS-PAGE结果选取凝胶过滤30， 36， 41， 47和53管(即分别为1， 2， 3， 4和5 号HAC粗提物，HAC-CE)，检测其抑瘤作用。 将C57BL/6J小鼠随机分为6组，8只/组，分别用上述蛋白背部皮下免疫2次(以血清白蛋白为载体)，1周1次，末次免疫1周后于小鼠后腿部皮下接种2×104个B16细胞。对照组给以等体积的PBS和血清白蛋白。观察其肿瘤出现时间、肿瘤发生率及小鼠死亡率。
, http://www.100md.com
1.7 体外中和实验
根据体内杀伤活性实验结果，选取凝胶过滤41，47和53管(即HAC-CE3，HAC-CE4和HAC-CE5)蛋白以10 μg/ml体外刺激正常C57BL/6J小鼠脾细胞，5%CO2，37℃ 孵育5 d诱导特异性CTL。以50∶1的效靶比与B16细胞混合后接种于C57BL/6J小鼠后腿部皮下。观察指标同上。
2 结 果
2.1 Sephacryl S-200 凝胶过滤图谱
由图1可以看出从B16细胞提取的胞浆蛋白经Sephacryl S-200 凝胶过滤获得了3个蛋白峰，选取第1峰的30和36管蛋白(MW >100 kD)和第2峰的41, 47和53管蛋白(MW 为60～97kD)分别免疫小鼠。
, 百拇医药
图1 B16细胞胞浆蛋白经Sephacryl S-200凝胶过滤图谱
Fig.1 Sephacryl S-200 chromatographic profile of soluble
protein derived from cytosol of B16 melanoma
2.2 体内排斥实验
实验结果证实，60～97 kD蛋白免疫小鼠后有抑瘤作用。从表1中可以看出， HAC-CE3，HAC-CE4和HAC-CE5免疫小鼠后，使肿瘤发生率降低(分别为62.5%， 50%和62.5%)、肿瘤平均出现时间比对照组明显延迟8.5～9.8 d(P<0.05或P<0.01)，小鼠死亡率降低(分别为62.5%， 50%和75%)，而HAC-CE1和HAC-CE2与对照组比较几乎无差异。
, 百拇医药
表1 B16 HAC-CE 免疫小鼠后对移植肿瘤生长的影响
Tab. 1 Effects of B16 HACs crude extracts gained with gel filtration on transplanted B16 melanoma development in mice Groups
Tumor incidences 21 d
after trans-plantation (%)
Time extents of
tumor development (d)
Mean tumor appearing times
, 百拇医药
Mortalities 30 d after
transplantation (%)
Control
100
14～21
15.6±2.5
87.5
HAC-CE1
100
14～20
16.5±2.0
100
, http://www.100md.com
HAC-CE2
100
14～21
17.0±3.2
100
HAC-CE3
62.5
18～34
24.8±7.6▲
62.5
HAC-CE4
50
, http://www.100md.com
14～44
25.4±10.6△
50
HAC-CE5
62.5
16～44
24.1±9.9△
75
±s, n=8, △ P<0.05 and ▲ P<0.01 vs control2.3 体外中和实验
根据体内实验结果，选取HAC-CE3，HAC-CE 4和HAC-CE 5通过体外中和实验进一步验证其抑瘤活性。从表2可以看出，B16 HAC体外诱导脾细胞与B16细胞以50∶1的效靶比混合后接种小鼠，表现为HAC-CE3，HAC-CE4和HAC-CE5免疫组的肿瘤发生率降低(分别为62.5%，75%和75%)，肿瘤平均出现时间延迟1～6.2 d，但无统计学差异。
, 百拇医药
3 讨 论
HSP是近年来作为肿瘤疫苗研究的热点内容之一。由于肿瘤细胞表面抗原性较弱，不能被机体的CD8+ T淋巴细胞所识别，因此不能被特异性杀伤。HAC能够提高特异性CTL对肿瘤细胞表面抗原的识别，通过MHC Ⅰ类分子的递呈作用杀伤肿瘤。已有实验证实其抑瘤作用。Srivastava等人[8]发现MCA诱发肿瘤细胞膜上的gp96免疫同系动物，可有效地防止肿瘤细胞的攻击。同时，DuBois等人[5]从Meth A肉瘤和CI-4肉瘤中提取胞浆蛋白，纯化出75 kD的HAC，用10 μg和20 μg免疫小鼠，分别有87%和95%以上的抑瘤作用。本实验从黑色素瘤B16细胞中提取胞浆蛋白，通过Sephacryl S-200获3个蛋白峰，经SDS-PAGE电泳，选取60～97 kD以上的蛋白，分别以20 μg/次免疫小鼠或体外刺激正常小鼠的淋巴细胞，观察到HAC-CE3，HAC-CE4和HAC-CE5免疫组可以抑制肿瘤发生。上述结果提示，从B16细胞胞浆提取的60～97 kD HAC-CE可以激活机体的免疫系统，对后来的移植肿瘤有特异性杀伤作用，与国外学者的研究结果一致。而且，用HAC-CE体外诱导特异性CTL与B16细胞混合后接种小鼠，也可产生对移植肿瘤的特异性杀伤，说明HAC的抑瘤作用是通过特异性CTL的杀伤作用实现的。
, 百拇医药
表2 B16 HAC-CE 体外诱导特异性CTL 与B16 混合后接
种小鼠对小鼠肿瘤生长的影响 (±s, n=8)
Tab. 2 Effects of splenocytes induced by crude extracts
gained with gel filtration in vitro on transplanted B16
melanoma development in mice (±s, n=8) Groups
Tumor
, 百拇医药
incidences
19 d after
transplantation
(%)
Times extents of
tumor development
(d)
Mean tumor
appearing times
(d)
Control
, 百拇医药
100
12～19
14.6±2.3
HAC-CE3
62.5
13～46
20.8±11.4
HAC-CE4
75
13～26
17.0±4.3
HAC-CE5
, http://www.100md.com 75
13～19
15.5±2.0
本实验说明HAC60～97有免疫原性及抑瘤效应，主要是通过诱导特异性CTL实现的。从肿瘤中提取的HAC可能结合了多种肿瘤抗原肽，免疫机体后可以活化多个CTL克隆，实现对同一肿瘤内所有肿瘤细胞的杀伤作用[9]。此外，HSP无同种异型性，解决了MHC Ⅰ类抗原限制的难题。并且，HAC可激发持久的T细胞免疫。因而，从肿瘤中提取HAC为临床制备肿瘤疫苗提供了新思路。今后的工作是进一步纯化出单一分子量的HAC并研究其抑瘤作用，以便及早在临床获得应用。
吉科合字第(963003-1)号基金资助
杨英,女,26岁,硕士,主要从事辐射肿瘤免疫方面的研究
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1，Craig EA, Weissman JS， Horwich AL. Heat shock proteins and molecular chaperones: Mediators of protein conformation and turnover in the cell. Cell, 1994, 78: 365
2 Arnold SD, Hanau D, Spehner D, et al. Cutting edge: Receptor-mediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen-presenting cells. J Immunol, 1999, 162(7): 3757
3，吴厚生， 俞 文. 热休克蛋白在递呈肿瘤抗原多肽中的作用. 中国肿瘤生物治疗杂志, 1996, 3(2): 83
, 百拇医药
4，黄兰青， 张友会. 肿瘤免疫治疗的新策略-肿瘤肽疫苗. 国外医学*肿瘤学分册， 1996， 23(2)： 92
5，Dubois GC, Appella E, Law LW. Immunogenic properties of soluble cytosol fractions of Meth A sarcoma cells. Cancer Res, 1980, 40: 4204
6，龚守良， 段 翔. 凝胶层析. 见: 龚守良主编. 实用基础医学实验技术， 长春: 吉林科学技术出版社, 1991. 216
7，哈密斯BD， 利克伍德D. 蛋白质的凝胶电泳实践方法. 刘毓秀，程桂芳译. 北京： 科学出版社， 1994. 18
8，Srivastava PK, Deleo AB, Old LJ. Tumor rejection antigens of chemically induced sarcomas of inbred mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83: 3407
9，Srivastava PK, Udono H. HSP-peptide complexes cancer immunotherapy. Curr Opin Immunol, 1994, 6: 72
(1999-07-14收稿； 1999-09-16修回), 百拇医药
单位：杨英 李秀娟 孙祖月 龚守良 李修义(白求恩医科大学卫生部放射生物重点实验室 长春 130021)
关键词：热休克蛋白-抗原肽复合物(HAC)；细胞毒T淋巴细胞(CTL)；抑瘤作用
中国肿瘤生物治疗杂志000213
摘 要 目的: 黑色素瘤B16细胞胞浆HSP-抗原肽复合物(HAC)的制备、免疫原性的诱导及其抑瘤作用的研究。方法: 采用Tris-HCl提取和Sephacryl S-200凝胶过滤制备B16细胞HAC，通过C57BL/6J小鼠体内诱导特异性CTL，再经体内、体外实验检测其抑瘤作用。结果: 凝胶过滤获得的含60～97 kD蛋白的41,47和53管的HAC可以降低肿瘤发生率、延长肿瘤出现时间及降低小鼠死亡率。结论: B16 细胞胞浆中的60～97 kD的HAC具有免疫原性及抑瘤作用，为制备肿瘤疫苗提供了实验依据。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R730.3
in vivo and in vitro Anti-Tumor Effeciency of B16 Melanoma HSP-Antigen Peptide Complex (HAC)
Yang Ying Li Xiujuan Sun Zuyue Gong Shouliang Li Xiuyi
(MH Radiobiology Research Unit, Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021)
Abstract Objective: To investigate the anti-tumor efficiency of B16 melanoma HACs in vivo and in vitro. Methods: Tris-HCl extract and Sephacryl S-200 gel filtration were applied to prepare B16 HACs, and the cytoloxicity of specific CTL induced by HACs was tested. Results: The 41, 47 and 53 tube HACs obtained by gel filtration could decrease the tumor incidences, delay the time of tumor development and decrease the mortalitites of mice. Conclusion: 60～97 kD HACs from B16 melanoma cytosol have the activites of inhibiting tumor and could be used in effective anti-tumor therapy.
, 百拇医药
Key words HSP-antigen peptide complex (HAC)； cytotoxic T lymphocyte； inhibiting tumor activity
热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是一类在生物进化中高度保守、广泛存在于原核、真核生物中的蛋白质，具有“分子伴侣”(molecular chaperone)作用，参与多种胞内蛋白的折叠、装配和转运[1，2]等功能。机体在受到高温或其他因素强烈刺激时，常可检测到具有保护作用的HSP[3]。近年来发现，HAC与肿瘤免疫密切相关[4]。本研究选取恶性度较高的黑色素瘤B16细胞，提取胞浆蛋白，诱导小鼠的特异性CTL，并观察其抑瘤作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物和细胞株
, 百拇医药
C57BL/6J纯系小鼠, 雌性，体重18±2 g, 健康,购自白求恩医科大学实验动物部。黑色素瘤B16 细胞由日本北里大学惠赠。
1.2 B16细胞悬液制备
于C57BL/6J小鼠后腿部皮下接种5×105个B16 细胞，21 d后处死，剥离瘤组织于RPMI 1640培养液中，剪碎后用毛玻璃片研磨，200目尼龙网过滤，1 000 r/min，离心5 min。用PBS液洗2次。
1.3 B16细胞胞浆蛋白的提取[5]
将离心沉淀所得的细胞用裂解液 [0.05 mol/L Tris -HCl (pH 7.2), 含0.5 mol/L NaCl, 0.1 mmol/L PMSF, 0.1% Aprotinin] 洗涤1次，1 500 r/min，离心5 min, 去上清后，用1倍于细胞体积的上述裂解液匀浆，至胞膜破碎后离心 (3 000 r/min, 10 min)。吸出上清，4℃ 保存备用。以上步骤均在冰浴条件下进行。
, 百拇医药
1.4 Sephacryl S-200 凝胶过滤[6]
将提取的胞浆蛋白通过Sephacryl S-200 凝胶过滤，玻璃柱为2.0 cm×80 cm, 洗脱液为0.01 mol/L Tris-HCl (pH 7.2), 0.15 mol/L NaCl, 流速为0.01 ml/min, 每秋5 ml，洗脱20 h。用紫外分光光度计监测蛋白浓度。
1.5 SDS-PAGE凝胶电泳[7]
选取凝胶过滤所得的不同管蛋白进行电泳，以确定其分子量。分离胶浓度为10%，标准蛋白分子量为97.4， 66.2， 42.7， 31.0和14.4。
1.6 体内杀伤活性实验
根据SDS-PAGE结果选取凝胶过滤30， 36， 41， 47和53管(即分别为1， 2， 3， 4和5 号HAC粗提物，HAC-CE)，检测其抑瘤作用。 将C57BL/6J小鼠随机分为6组，8只/组，分别用上述蛋白背部皮下免疫2次(以血清白蛋白为载体)，1周1次，末次免疫1周后于小鼠后腿部皮下接种2×104个B16细胞。对照组给以等体积的PBS和血清白蛋白。观察其肿瘤出现时间、肿瘤发生率及小鼠死亡率。
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1.7 体外中和实验
根据体内杀伤活性实验结果，选取凝胶过滤41，47和53管(即HAC-CE3，HAC-CE4和HAC-CE5)蛋白以10 μg/ml体外刺激正常C57BL/6J小鼠脾细胞，5%CO2，37℃ 孵育5 d诱导特异性CTL。以50∶1的效靶比与B16细胞混合后接种于C57BL/6J小鼠后腿部皮下。观察指标同上。
2 结 果
2.1 Sephacryl S-200 凝胶过滤图谱
由图1可以看出从B16细胞提取的胞浆蛋白经Sephacryl S-200 凝胶过滤获得了3个蛋白峰，选取第1峰的30和36管蛋白(MW >100 kD)和第2峰的41, 47和53管蛋白(MW 为60～97kD)分别免疫小鼠。
, 百拇医药
图1 B16细胞胞浆蛋白经Sephacryl S-200凝胶过滤图谱
Fig.1 Sephacryl S-200 chromatographic profile of soluble
protein derived from cytosol of B16 melanoma
2.2 体内排斥实验
实验结果证实，60～97 kD蛋白免疫小鼠后有抑瘤作用。从表1中可以看出， HAC-CE3，HAC-CE4和HAC-CE5免疫小鼠后，使肿瘤发生率降低(分别为62.5%， 50%和62.5%)、肿瘤平均出现时间比对照组明显延迟8.5～9.8 d(P<0.05或P<0.01)，小鼠死亡率降低(分别为62.5%， 50%和75%)，而HAC-CE1和HAC-CE2与对照组比较几乎无差异。
, 百拇医药
表1 B16 HAC-CE 免疫小鼠后对移植肿瘤生长的影响
Tab. 1 Effects of B16 HACs crude extracts gained with gel filtration on transplanted B16 melanoma development in mice Groups
Tumor incidences 21 d
after trans-plantation (%)
Time extents of
tumor development (d)
Mean tumor appearing times
, 百拇医药
Mortalities 30 d after
transplantation (%)
Control
100
14～21
15.6±2.5
87.5
HAC-CE1
100
14～20
16.5±2.0
100
, http://www.100md.com
HAC-CE2
100
14～21
17.0±3.2
100
HAC-CE3
62.5
18～34
24.8±7.6▲
62.5
HAC-CE4
50
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14～44
25.4±10.6△
50
HAC-CE5
62.5
16～44
24.1±9.9△
75
±s, n=8, △ P<0.05 and ▲ P<0.01 vs control2.3 体外中和实验根据体内实验结果，选取HAC-CE3，HAC-CE 4和HAC-CE 5通过体外中和实验进一步验证其抑瘤活性。从表2可以看出，B16 HAC体外诱导脾细胞与B16细胞以50∶1的效靶比混合后接种小鼠，表现为HAC-CE3，HAC-CE4和HAC-CE5免疫组的肿瘤发生率降低(分别为62.5%，75%和75%)，肿瘤平均出现时间延迟1～6.2 d，但无统计学差异。
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3 讨 论
HSP是近年来作为肿瘤疫苗研究的热点内容之一。由于肿瘤细胞表面抗原性较弱，不能被机体的CD8+ T淋巴细胞所识别，因此不能被特异性杀伤。HAC能够提高特异性CTL对肿瘤细胞表面抗原的识别，通过MHC Ⅰ类分子的递呈作用杀伤肿瘤。已有实验证实其抑瘤作用。Srivastava等人[8]发现MCA诱发肿瘤细胞膜上的gp96免疫同系动物，可有效地防止肿瘤细胞的攻击。同时，DuBois等人[5]从Meth A肉瘤和CI-4肉瘤中提取胞浆蛋白，纯化出75 kD的HAC，用10 μg和20 μg免疫小鼠，分别有87%和95%以上的抑瘤作用。本实验从黑色素瘤B16细胞中提取胞浆蛋白，通过Sephacryl S-200获3个蛋白峰，经SDS-PAGE电泳，选取60～97 kD以上的蛋白，分别以20 μg/次免疫小鼠或体外刺激正常小鼠的淋巴细胞，观察到HAC-CE3，HAC-CE4和HAC-CE5免疫组可以抑制肿瘤发生。上述结果提示，从B16细胞胞浆提取的60～97 kD HAC-CE可以激活机体的免疫系统，对后来的移植肿瘤有特异性杀伤作用，与国外学者的研究结果一致。而且，用HAC-CE体外诱导特异性CTL与B16细胞混合后接种小鼠，也可产生对移植肿瘤的特异性杀伤，说明HAC的抑瘤作用是通过特异性CTL的杀伤作用实现的。
, 百拇医药
表2 B16 HAC-CE 体外诱导特异性CTL 与B16 混合后接
种小鼠对小鼠肿瘤生长的影响 (
±s, n=8)Tab. 2 Effects of splenocytes induced by crude extracts
gained with gel filtration in vitro on transplanted B16
melanoma development in mice (
±s, n=8) GroupsTumor
, 百拇医药
incidences
19 d after
transplantation
(%)
Times extents of
tumor development
(d)
Mean tumor
appearing times
(d)
Control
, 百拇医药
100
12～19
14.6±2.3
HAC-CE3
62.5
13～46
20.8±11.4
HAC-CE4
75
13～26
17.0±4.3
HAC-CE5
, http://www.100md.com 75
13～19
15.5±2.0
本实验说明HAC60～97有免疫原性及抑瘤效应，主要是通过诱导特异性CTL实现的。从肿瘤中提取的HAC可能结合了多种肿瘤抗原肽，免疫机体后可以活化多个CTL克隆，实现对同一肿瘤内所有肿瘤细胞的杀伤作用[9]。此外，HSP无同种异型性，解决了MHC Ⅰ类抗原限制的难题。并且，HAC可激发持久的T细胞免疫。因而，从肿瘤中提取HAC为临床制备肿瘤疫苗提供了新思路。今后的工作是进一步纯化出单一分子量的HAC并研究其抑瘤作用，以便及早在临床获得应用。
吉科合字第(963003-1)号基金资助
杨英,女,26岁,硕士,主要从事辐射肿瘤免疫方面的研究
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1，Craig EA, Weissman JS， Horwich AL. Heat shock proteins and molecular chaperones: Mediators of protein conformation and turnover in the cell. Cell, 1994, 78: 365
2 Arnold SD, Hanau D, Spehner D, et al. Cutting edge: Receptor-mediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen-presenting cells. J Immunol, 1999, 162(7): 3757
3，吴厚生， 俞 文. 热休克蛋白在递呈肿瘤抗原多肽中的作用. 中国肿瘤生物治疗杂志, 1996, 3(2): 83
, 百拇医药
4，黄兰青， 张友会. 肿瘤免疫治疗的新策略-肿瘤肽疫苗. 国外医学*肿瘤学分册， 1996， 23(2)： 92
5，Dubois GC, Appella E, Law LW. Immunogenic properties of soluble cytosol fractions of Meth A sarcoma cells. Cancer Res, 1980, 40: 4204
6，龚守良， 段 翔. 凝胶层析. 见: 龚守良主编. 实用基础医学实验技术， 长春: 吉林科学技术出版社, 1991. 216
7，哈密斯BD， 利克伍德D. 蛋白质的凝胶电泳实践方法. 刘毓秀，程桂芳译. 北京： 科学出版社， 1994. 18
8，Srivastava PK, Deleo AB, Old LJ. Tumor rejection antigens of chemically induced sarcomas of inbred mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83: 3407
9，Srivastava PK, Udono H. HSP-peptide complexes cancer immunotherapy. Curr Opin Immunol, 1994, 6: 72
(1999-07-14收稿； 1999-09-16修回), 百拇医药