痰标本中肺癌相关基因检测用于肺癌早期诊断的研究进展
作者：姚连昌 李龙芸
单位：姚连昌(100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院呼吸内科)；李龙芸(现在264000 烟台，青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院肿瘤内科)
关键词：
中国肺癌杂志000325 近半个世纪以来，人们在肺癌防治方面做了大量工作，但肺癌在全世界范围内的发病率和死亡率仍居各种恶性肿瘤之首，并无明显下降趋势。这主要是因为肺癌的病因和发病机制还未彻底弄清，缺乏有效的预防措施。要真正早期诊断肺癌，首先应对癌变的整个过程深入了解，进而进行相关检测，才有可能发现肺癌早期改变。本综述从分子生物学水平对肿瘤发生学的进展进行总结，以期探讨肺癌早期诊断的可能性和手段。
1 肺癌发生的肿瘤分子生物学改变
细胞及分子生物学研究已表明，肿瘤的发生是一个多阶段的过程，即肿瘤发生的多阶段学说(multi-step carcinogenesis)[1]，可概括为始动、促进和发展三阶段。始动阶段即是外部环境因素如辐射和化学致癌剂等引起宿主细胞基因突变的过程，是肺癌发生的最早事件。主要包括DNA突变、原癌基因激活和抑癌基因失活等。始动过程是一个多因素改变的事件，涉及的往往不止一个基因位点。如中等剂量的照射(1?Gy)即可使大部分细胞始动，但下一步这些细胞既可发展至始动阶段，也可能被淘汰或逆转成正常细胞，即分别通过机体免疫系统的识别、消除和DNA修复等机制实现正常化。不能被逆转或淘汰的少数细胞才进一步形成恶性转化，进入促进期。
, 百拇医药
促进期是癌症是否出现和何时出现的关键阶段。其中有促进因子的作用，它能促进细胞的分裂增殖。促进阶段是可逆的，即促进期细胞的恶性转化可因施加某些因子而受到抑制。如已有实验表明，维生素A类似物、硒和3-氨基苯酰胺等即可减少照射并用TPA时引起的细胞转化[2]。这就是用维生素A类似物和硒制剂等治疗癌前病变的基础。
如果促进阶段未能被阻止，这些细胞继续发展下去即成为癌细胞，即进入第三个阶段——发展期。该期也是已形成的肿瘤细胞恶性程度进一步增加的时期，其中包括由良性病变转变成恶性病变的过程，如结肠良性息肉的恶变即如此。这种转变可以持续缓慢进行，也可在发展因子作用下突变性进展，是肿瘤的实质性发展阶段。
致癌多阶段学说在临床上的表现是癌症尚未发现之前往往有一个相当长的癌前期过程。病理学上的反映则是癌前期组织中出现不典型增生细胞(atypical hyperplastic cell)。轻度不典型增生尚具有可恢复性，但重度不典型增生者多数会发展成癌。最初为原位癌，以后则向周围扩展成为浸润癌，进而通过血管和淋巴管向远隔部位扩散转移，最后导致机体死亡。
, 百拇医药
综上所述，癌变发生过程是癌基因激活和抑癌基因失活的多步骤过程。致癌过程的关键性始动阶段是两种不同的生长调节因子——致癌基因和抑癌基因的调节失衡，其间伴随着许多分子和细胞遗传学的改变，如原癌基因的激活和抑癌基因的失活等，说明基因改变可能涉及癌变的更初期阶段。肺癌发生初始阶段涉及的基因改变颇多，它们在肺癌发生过程中的出现顺序和几率尚未完全清楚，对其深入研究无疑将对高危人群的进一步筛选以及对亚临床患者的早期诊断有很大的指导意义。
2 痰标本中肺癌相关基因检测有利于肺癌的早期诊断
多年来应用的痰脱落细胞的细胞病理学检查虽然诊断特异性高，但易受多种因素影响，由此使人想到能否避开具体的细胞形态而以肿瘤细胞的某一特异标记来识别之。随着分子生物学的进展，PCR技术的应用，人们已能用越来越少的组织甚或脱落细胞进行有关的分子生物学研究，因此使检测痰标本中肺癌相关基因等标记物具备了可能性。支气管肺癌的始发部位为支气管粘膜上皮，而癌变后脱落的上皮可随呼吸道的粘液分泌物在纤毛运动作用下排出体外。因此，加强对痰液中脱落上皮细胞的相关分子生物学检查，应该是肺癌最有希望的早期诊断措施，通过其它途径获得的肺组织标本都不大可能用来诊断最早期的肺癌。
, http://www.100md.com
在痰标本检测用于肺癌早期诊断方面，国内外学者已做了不少工作。Tockman等[3]自1973年开始，对5226例肺癌高危人群每年至少进行一次痰标本收集、储存、细胞病理学检查，并对69例支气管上皮中度或中度以上不典型增生者分别用抗SCLC糖脂抗原和抗NSCLC蛋白抗原的纯化单克隆抗体进行免疫染色分析，结果在最后癌变且痰标本满意的22例中有14例免疫染色阳性，敏感性64%；而40例未癌变而痰标本可用者35例反应阴性，特异性为88%。Qiao等[4]对云南个旧锡矿57例肺癌和76例非肺癌矿工的研究表明，用制备的能识别异源性细胞核型核糖核蛋白(hnRNP)的单克隆抗体检测痰标本中脱落呼吸道上皮细胞的肿瘤相关抗原，诊断肺癌的敏感性较痰液细胞学检查和胸部X线检查均高(分别为74% vs 21%和74% vs 42%)，但特异性稍差(70% vs 100%和70% vs 90%)。又有文献报道，对原先痰细胞学阴性而后发展成为肺癌者的储存痰标本回顾性检测p53突变基因，可比临床诊断提前1～13个月[5]。以上实验结果表明用痰标本代替组织标本进行p53基因检测用于肺癌诊断是可行的。
, 百拇医药
如果能够保证所储存痰标本中的肺癌细胞形态完整和多种细胞成分不遭破坏，理论上目前发现的与肺癌相关的主要癌基因和抑癌基因均应在痰标本中检测到，包括p53、ras、myc、bcl-2、neu、c-fos和c-jun、HPV和p16基因等多达十几种。它们在许多患者的肺癌组织中可检测到。对疑为肺癌患者的痰标本进行以上有关基因的检测将有利于肺癌尤其是早期肺癌的诊断，而且在指导选择肺癌治疗方案和判断预后等方面也很有意义。
3 痰标本检查的方法学
痰标本在用于肺癌相关基因检测前必须进行前期处理，这对于保留痰液中极少量的肿瘤细胞及其相关基因的完整性非常重要。这些前期工作主要包括痰标本的收集、储存、解粘处理和检测方法的选择等几个方面。
3.1 痰标本的收集 为了保证痰标本的质量和数量，让患者晨起漱口后留痰，最少咯深部痰7～8口于专用痰收集管中，混匀后置阴凉处(最好为4℃冰箱)保存。
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3.2 痰标本的储存 关键是痰储存固定液的选择，因为收集的痰标本需要保存很长时间。目前国内外学者所用的固定剂一般多为50%乙醇和2%多聚乙醇的混合液或其类似物质，如Tockman等[3]在大宗高危人群肺癌筛选时所用固定剂为2%聚乙烯(polyethylene)和50%乙醇的混合液，Mao等[5]则用2%聚氧乙烯二醇(carbowax)和50%乙醇的混合液，均显示对痰液中的细胞形态和DNA成分保存良好。
3.3 解粘处理 这一步也非常重要，否则将无法富集到单纯的脱落细胞进行有关癌基因的分析。解粘处理不应该对细胞尤其是DNA成分有任何的损害。用美国PROMEGA公司生产的DTT(DL-Dithiothreitol)进行痰标本的解粘处理效果较好，其主要作用机理是DTT可打断粘蛋白之间的二硫键连接，工作浓度(5%)的DTT作用效果理想又基本不会损伤其中的细胞。
3.4 痰检肺癌相关基因的分子生物学方法 在对肺癌组织标本或培养细胞的癌基因研究中，由于受检标本的细胞数较多，标本量较大，所用方法包括免疫组织化学法、直接测序法、PCR—寡核苷酸探针杂交法(PCR-ASO)、流式细胞术和聚合酶链反应—单链构象多态性分析(PCR-SSCP)等多种。这些方法各有优缺点，而用于痰标本肺癌相关基因检测时未必都适合。如免疫组化法特异性高，敏感性强，但要求的标本量相对较多，且无法进行进一步分析，故不适于痰标本检测。直接测序法用于检测基因突变最可靠，但极费时，且在分析大编码顺序时易出错。PCR—寡核苷酸探针杂交及Southern印迹杂交法既繁琐周期又长。相比之下，PCR-SSCP法能测出单个碱基突变，为快速、简易且经济的手段，可作多数肺癌相关基因的分析，尤其适合于检测痰标本中的少量癌基因，也适合于肺癌高危人群的筛查。
, http://www.100md.com
总之，肺癌的发生和发展是多因素综合作用的结果，其癌变过程也是多步骤、逐渐发生的，而其最初阶段是可逆转的。支气管肺癌发生和发展特点及支气管-肺结构的解剖特点，决定了痰细胞学等检查在肺癌早期诊断中的重要性。及时对可疑肺癌患者进行痰标本相关基因检测，则可能克服痰细胞学检查之不足，明显提高肺癌的早期诊断率(包括亚临床期)。而对那些癌前病变者积极指导其脱离致癌原和/或进行化学预防等，则完全有可能逆转这种癌前病变过程[6]。这应该是肺癌治疗的根本方向。随着分子生物学的进展，新技术不断出现，相信在这方面会不断有新的进展。
参考文献
1，Farber E. The multistep nature of cancer development. Cancer Res,1984,44(10)∶4217-4223.
2，Lotan R. Retinoids and their receptors in modulation of differentiation, development and prevention of head and neck cancer. Anticancer Res,1996,16(4c)∶2415-2419.
, http://www.100md.com
3，Tockman MS, Gupta PK, Myers JD, et al. Sensitive and specific monoclonal antibody recognition of human lung cancer antigen on preserved sputum cells: a new approach to early lung cancer detection. J Clin Onocl,1988,6(11)∶1685-1693.
4，Qiao YL(乔友林), Tockman MS, Li L, et al. A case-cohort study or an early biomarker of lung cancer tin a screening cohort of Yunnan tin miners in China. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,1997,6(11)∶893-900.
, http://www.100md.com
5，Mao L, Hruban RH, Boyle JO, et al. Detection of oncogene mutation in sputum precedes diagnosis of lung cancer. Cancer Res,1994,54(7)∶1634-1637.
6，Balansky RM, De flora S. Chemoprevention by N-acetylcysteine of urethane induced olastogenicety and lung tumors in mice. Int J Cancer,1998,77(2)∶302-305.
(收稿：1999-10-21，修回：2000-03-21), 百拇医药
单位：姚连昌(100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院呼吸内科)；李龙芸(现在264000 烟台，青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院肿瘤内科)
关键词：
中国肺癌杂志000325 近半个世纪以来，人们在肺癌防治方面做了大量工作，但肺癌在全世界范围内的发病率和死亡率仍居各种恶性肿瘤之首，并无明显下降趋势。这主要是因为肺癌的病因和发病机制还未彻底弄清，缺乏有效的预防措施。要真正早期诊断肺癌，首先应对癌变的整个过程深入了解，进而进行相关检测，才有可能发现肺癌早期改变。本综述从分子生物学水平对肿瘤发生学的进展进行总结，以期探讨肺癌早期诊断的可能性和手段。
1 肺癌发生的肿瘤分子生物学改变
细胞及分子生物学研究已表明，肿瘤的发生是一个多阶段的过程，即肿瘤发生的多阶段学说(multi-step carcinogenesis)[1]，可概括为始动、促进和发展三阶段。始动阶段即是外部环境因素如辐射和化学致癌剂等引起宿主细胞基因突变的过程，是肺癌发生的最早事件。主要包括DNA突变、原癌基因激活和抑癌基因失活等。始动过程是一个多因素改变的事件，涉及的往往不止一个基因位点。如中等剂量的照射(1?Gy)即可使大部分细胞始动，但下一步这些细胞既可发展至始动阶段，也可能被淘汰或逆转成正常细胞，即分别通过机体免疫系统的识别、消除和DNA修复等机制实现正常化。不能被逆转或淘汰的少数细胞才进一步形成恶性转化，进入促进期。
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促进期是癌症是否出现和何时出现的关键阶段。其中有促进因子的作用，它能促进细胞的分裂增殖。促进阶段是可逆的，即促进期细胞的恶性转化可因施加某些因子而受到抑制。如已有实验表明，维生素A类似物、硒和3-氨基苯酰胺等即可减少照射并用TPA时引起的细胞转化[2]。这就是用维生素A类似物和硒制剂等治疗癌前病变的基础。
如果促进阶段未能被阻止，这些细胞继续发展下去即成为癌细胞，即进入第三个阶段——发展期。该期也是已形成的肿瘤细胞恶性程度进一步增加的时期，其中包括由良性病变转变成恶性病变的过程，如结肠良性息肉的恶变即如此。这种转变可以持续缓慢进行，也可在发展因子作用下突变性进展，是肿瘤的实质性发展阶段。
致癌多阶段学说在临床上的表现是癌症尚未发现之前往往有一个相当长的癌前期过程。病理学上的反映则是癌前期组织中出现不典型增生细胞(atypical hyperplastic cell)。轻度不典型增生尚具有可恢复性，但重度不典型增生者多数会发展成癌。最初为原位癌，以后则向周围扩展成为浸润癌，进而通过血管和淋巴管向远隔部位扩散转移，最后导致机体死亡。
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综上所述，癌变发生过程是癌基因激活和抑癌基因失活的多步骤过程。致癌过程的关键性始动阶段是两种不同的生长调节因子——致癌基因和抑癌基因的调节失衡，其间伴随着许多分子和细胞遗传学的改变，如原癌基因的激活和抑癌基因的失活等，说明基因改变可能涉及癌变的更初期阶段。肺癌发生初始阶段涉及的基因改变颇多，它们在肺癌发生过程中的出现顺序和几率尚未完全清楚，对其深入研究无疑将对高危人群的进一步筛选以及对亚临床患者的早期诊断有很大的指导意义。
2 痰标本中肺癌相关基因检测有利于肺癌的早期诊断
多年来应用的痰脱落细胞的细胞病理学检查虽然诊断特异性高，但易受多种因素影响，由此使人想到能否避开具体的细胞形态而以肿瘤细胞的某一特异标记来识别之。随着分子生物学的进展，PCR技术的应用，人们已能用越来越少的组织甚或脱落细胞进行有关的分子生物学研究，因此使检测痰标本中肺癌相关基因等标记物具备了可能性。支气管肺癌的始发部位为支气管粘膜上皮，而癌变后脱落的上皮可随呼吸道的粘液分泌物在纤毛运动作用下排出体外。因此，加强对痰液中脱落上皮细胞的相关分子生物学检查，应该是肺癌最有希望的早期诊断措施，通过其它途径获得的肺组织标本都不大可能用来诊断最早期的肺癌。
, http://www.100md.com
在痰标本检测用于肺癌早期诊断方面，国内外学者已做了不少工作。Tockman等[3]自1973年开始，对5226例肺癌高危人群每年至少进行一次痰标本收集、储存、细胞病理学检查，并对69例支气管上皮中度或中度以上不典型增生者分别用抗SCLC糖脂抗原和抗NSCLC蛋白抗原的纯化单克隆抗体进行免疫染色分析，结果在最后癌变且痰标本满意的22例中有14例免疫染色阳性，敏感性64%；而40例未癌变而痰标本可用者35例反应阴性，特异性为88%。Qiao等[4]对云南个旧锡矿57例肺癌和76例非肺癌矿工的研究表明，用制备的能识别异源性细胞核型核糖核蛋白(hnRNP)的单克隆抗体检测痰标本中脱落呼吸道上皮细胞的肿瘤相关抗原，诊断肺癌的敏感性较痰液细胞学检查和胸部X线检查均高(分别为74% vs 21%和74% vs 42%)，但特异性稍差(70% vs 100%和70% vs 90%)。又有文献报道，对原先痰细胞学阴性而后发展成为肺癌者的储存痰标本回顾性检测p53突变基因，可比临床诊断提前1～13个月[5]。以上实验结果表明用痰标本代替组织标本进行p53基因检测用于肺癌诊断是可行的。
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如果能够保证所储存痰标本中的肺癌细胞形态完整和多种细胞成分不遭破坏，理论上目前发现的与肺癌相关的主要癌基因和抑癌基因均应在痰标本中检测到，包括p53、ras、myc、bcl-2、neu、c-fos和c-jun、HPV和p16基因等多达十几种。它们在许多患者的肺癌组织中可检测到。对疑为肺癌患者的痰标本进行以上有关基因的检测将有利于肺癌尤其是早期肺癌的诊断，而且在指导选择肺癌治疗方案和判断预后等方面也很有意义。
3 痰标本检查的方法学
痰标本在用于肺癌相关基因检测前必须进行前期处理，这对于保留痰液中极少量的肿瘤细胞及其相关基因的完整性非常重要。这些前期工作主要包括痰标本的收集、储存、解粘处理和检测方法的选择等几个方面。
3.1 痰标本的收集 为了保证痰标本的质量和数量，让患者晨起漱口后留痰，最少咯深部痰7～8口于专用痰收集管中，混匀后置阴凉处(最好为4℃冰箱)保存。
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3.2 痰标本的储存 关键是痰储存固定液的选择，因为收集的痰标本需要保存很长时间。目前国内外学者所用的固定剂一般多为50%乙醇和2%多聚乙醇的混合液或其类似物质，如Tockman等[3]在大宗高危人群肺癌筛选时所用固定剂为2%聚乙烯(polyethylene)和50%乙醇的混合液，Mao等[5]则用2%聚氧乙烯二醇(carbowax)和50%乙醇的混合液，均显示对痰液中的细胞形态和DNA成分保存良好。
3.3 解粘处理 这一步也非常重要，否则将无法富集到单纯的脱落细胞进行有关癌基因的分析。解粘处理不应该对细胞尤其是DNA成分有任何的损害。用美国PROMEGA公司生产的DTT(DL-Dithiothreitol)进行痰标本的解粘处理效果较好，其主要作用机理是DTT可打断粘蛋白之间的二硫键连接，工作浓度(5%)的DTT作用效果理想又基本不会损伤其中的细胞。
3.4 痰检肺癌相关基因的分子生物学方法 在对肺癌组织标本或培养细胞的癌基因研究中，由于受检标本的细胞数较多，标本量较大，所用方法包括免疫组织化学法、直接测序法、PCR—寡核苷酸探针杂交法(PCR-ASO)、流式细胞术和聚合酶链反应—单链构象多态性分析(PCR-SSCP)等多种。这些方法各有优缺点，而用于痰标本肺癌相关基因检测时未必都适合。如免疫组化法特异性高，敏感性强，但要求的标本量相对较多，且无法进行进一步分析，故不适于痰标本检测。直接测序法用于检测基因突变最可靠，但极费时，且在分析大编码顺序时易出错。PCR—寡核苷酸探针杂交及Southern印迹杂交法既繁琐周期又长。相比之下，PCR-SSCP法能测出单个碱基突变，为快速、简易且经济的手段，可作多数肺癌相关基因的分析，尤其适合于检测痰标本中的少量癌基因，也适合于肺癌高危人群的筛查。
, http://www.100md.com
总之，肺癌的发生和发展是多因素综合作用的结果，其癌变过程也是多步骤、逐渐发生的，而其最初阶段是可逆转的。支气管肺癌发生和发展特点及支气管-肺结构的解剖特点，决定了痰细胞学等检查在肺癌早期诊断中的重要性。及时对可疑肺癌患者进行痰标本相关基因检测，则可能克服痰细胞学检查之不足，明显提高肺癌的早期诊断率(包括亚临床期)。而对那些癌前病变者积极指导其脱离致癌原和/或进行化学预防等，则完全有可能逆转这种癌前病变过程[6]。这应该是肺癌治疗的根本方向。随着分子生物学的进展，新技术不断出现，相信在这方面会不断有新的进展。
参考文献
1，Farber E. The multistep nature of cancer development. Cancer Res,1984,44(10)∶4217-4223.
2，Lotan R. Retinoids and their receptors in modulation of differentiation, development and prevention of head and neck cancer. Anticancer Res,1996,16(4c)∶2415-2419.
, http://www.100md.com
3，Tockman MS, Gupta PK, Myers JD, et al. Sensitive and specific monoclonal antibody recognition of human lung cancer antigen on preserved sputum cells: a new approach to early lung cancer detection. J Clin Onocl,1988,6(11)∶1685-1693.
4，Qiao YL(乔友林), Tockman MS, Li L, et al. A case-cohort study or an early biomarker of lung cancer tin a screening cohort of Yunnan tin miners in China. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,1997,6(11)∶893-900.
, http://www.100md.com
5，Mao L, Hruban RH, Boyle JO, et al. Detection of oncogene mutation in sputum precedes diagnosis of lung cancer. Cancer Res,1994,54(7)∶1634-1637.
6，Balansky RM, De flora S. Chemoprevention by N-acetylcysteine of urethane induced olastogenicety and lung tumors in mice. Int J Cancer,1998,77(2)∶302-305.
(收稿：1999-10-21，修回：2000-03-21), 百拇医药