nm23基因与肺癌转移关系的研究进展
作者：陈军 周清华
单位：陈军 周清华(610041 华西医科大学附属第一医院胸外科)
关键词：
中国肺癌杂志000323 肿瘤转移是其恶性标志和特征之一，也是肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因。肿瘤转移是一个复杂的过程，可能涉及原发部位的肿瘤穿过组织基底膜，避开机体免疫反应，穿过血管和淋巴管进入新组织实质，肿瘤血管形成，而后形成转移灶等一系列表型的改变。
阐明肿瘤转移过程可为肿瘤的防治提供新的策略。1987年SEER(survebuance epidemiology and end results in USA)调查表明：在临床诊断和治疗的乳腺癌患者中，仅7%发现远处转移，38%有局部淋巴结转移，52%未见转移，3%资料不全。这在理论上提示如果能阻止肿瘤转移过程的任何一步，都将有益于52%或38%的患者。但事实上在这52%或38%的患者中，可能早已发生了少数肿瘤细胞或微型灶的远处转移，只是由于病灶太小而不能检测到。在这种情况下，只有针对远处病灶中肿瘤细胞的生长、肿瘤血管的形成和肿瘤细胞的克隆化而形成较大转移灶的治疗方法才是有效的。故Steeg等[1]认为研究肿瘤转移应把主要精力放在肿瘤转移过程的最后阶段。
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肿瘤细胞的转移有一系列改变，如穿过组织基底膜至肿瘤细胞的克隆化而形成远处转移灶等表型，并受转移相关基因的调控。这些表型的改变是在其特有的生化机理下完成的，如肿瘤细胞可产生四种类型的蛋白酶而发生浸润。转移的肿瘤细胞在表型和基因整合水平上都十分不稳定。虽然造成这种不稳定性的原因目前尚不清楚，但正是由于这些不稳定性造成了肿瘤细胞表型的改变，从而发生和实现肿瘤的转移。也正是对肿瘤转移过程的生化和分子机理的不清楚阻碍了抗肿瘤转移治疗的发展。
目前关于肿瘤转移多认为是由于肿瘤细胞的一系列表型改变的结果。Steeg[2]报道在体外研究中，通过转染单个癌基因可诱导正常细胞转化为肿瘤细胞，并发生转移，且出现一系列诸如肿瘤细胞的粘附性、蛋白酶的产量、运动性等多种表型的改变。这表明单个癌基因可驱使其下游基因发生遗传的改变。进一步研究发现，正常胚胎细胞和转移肿瘤细胞表型相似，推测与肿瘤转移有关的基因链可能与胚胎发展和分化期的基因链相同。如果能够明白肿瘤转移过程中调节肿瘤转移的上游基因的改变导致下游基因遗传信息发生变化的机理，并找到这种关键的上游基因，就有可能发现阻止肿瘤转移的有效方法。近年来，已发现某些基因改变与肿瘤转移关系密切，其中尤以nm23基因与肿瘤转移的关系更密切。nm23被认为可能是肿瘤转移过程中起关键作用的上游调节基因。本文拟就近年来nm23基因与肿瘤转移关系的研究进展综述如下。
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1 nm23基因的发现、结构及其在肿瘤转移、分化中的作用
1.1 nm23基因的发现 1988年，美国国立癌症研究所的Steeg等[3]在鼠K-1735黑色素瘤的cDNA文库中通过差相杂交筛选出一个cDNA克隆，用这种cDNA与7株具有不同转移能力的K-1735细胞株的mRNA进行Northern印迹杂交，结果显示此基因在每个细胞株的表达分别与它们的转移能力呈负相关；原位杂交也显示其在低转移细胞株中的转录表达比高转移细胞株增高10倍。遂将此基因命名为nm23基因(non-metastasis编号为23的cDNA基因克隆)，认为是一种肿瘤转移抑制基因，并测得此基因cDNA碱基序列及其编码的氨基酸顺序。之后再用抗nm23多肽11抗体进行Western印迹杂交，亦显示出蛋白水平与肿瘤转移能力呈负相关，与mRNA变化相符。1991年，Stahl等[4]用鼠Pnm23-1重组质粒筛选人类成纤维细胞cDNA文库时发现了第二个nm23基因，命名为nm23-H2，Steeg发现的nm23基因遂为nm23-H1，并认为nm23-H1和nm23-H2是两个独立的基因。1997年，Martinez等[5]用差相杂交法从慢性髓性白血病原始细胞的DNA文库中发现了DR-nm23。同年，Milon等[6]用逆转录PCR法差相检查人胃的cDNA文库时发现了nm23-H4基因。国内江贤鹏等[7]用PCR技术从人肝基因组DNA中扩增nm23序列，经克隆筛选得到5′端375?bp克隆，命名为nm23-H3b。序列分析发现，nm23-H3b在40～70?bp之间与原序列完全不同，其它序列与nm23-H1有86%的同源性，与nm23-H2有90%的同源性。BglⅡ消化人肝基因组DNA，以nm23-H3b?DNA为探针，经Southern Blot后出现10.5、7.9和4.0?kb的3条杂交带，未见与nm23-H1和nm23-H2相同的杂交带。因此认为nm23-H3b是一种与人肿瘤转移抑制基因nm23-H1和nm23-H2高度同源的新基因克隆，但随后再未见相关研究的报道。
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1.2 nm23结构及其在肿瘤转移中的作用 人类发现的nm23基因有nm23-H1、nm23-H2、DR-nm23和nm23-H4四种。nm23-H1和nm23-H2都定位于染色体17q21.3，长约10?kb，呈串联排列，中间隔有4?kb，每个基因都含有5个外显子。它们的cDNA碱基序列及其编码的氨基酸顺序已被测得，其蛋白产物含有152个氨基酸，分子量为17?ku，两基因蛋白88%具相同的氨基酸顺序。DR-nm23定位于染色体16q13，含有5个内含子和6个外显子，其蛋白产物与nm23-H1和nm23-H2两基因的蛋白产物具有70%左右的相同氨基酸序列[5]。nm23-H4定位于染色体16p13.3，其蛋白产物具有187个氨基酸顺序[6]。
为了明确nm23在肿瘤转移过程中的作用，Steeg等[8]进一步检测了亚硝基甲基胺诱发的鼠乳腺癌以及用ras和ras+Ela基因转染的小鼠胚胎成纤维细胞系，发现各细胞系nm23基因RNA表达水平均与它们的转移能力呈负相关。在ras+Ela基因转染组中nm23 RNA水平明显高于ras基因转染组，从而认为Ela基因可能是通过提高nm23基因表达来抑制肿瘤的转移。Leone等[9]直接用鼠nm23-1 cDNA转染小鼠K-1735黑色素瘤TK细胞系发现，nm23-1转染的细胞系肿瘤转移能力较对照组低57%～96%，但nm23-1的表达与肿瘤转移未见相关性。同时，在体外研究中发现nm23-1转染的K-1735TK黑色素瘤细胞对TGFβ(transforming growth factor β)的刺激应答明显降低，而Schwartz、Kerbel等的研究发现转移的肿瘤细胞常接受TGFβ的刺激，而非转移的肿瘤细胞对TGFβ的刺激却无应答或受到其抑制。相似的结论也在Leone等[10]和Price等[11]的研究中获得证实，他们分别用人的nm23-H1转染人的MDA-MB-435乳腺癌细胞株，在体外培养和把转染的肿瘤细胞接种到裸鼠上时发现，有nm23-H1表达组的肿瘤转移潜能降低了50%～90%，且在体外研究中表达的nm23-H1细胞株表型出现了：①生长率降低，传代能力下降；②集落形成(克隆化)能力降低；③对细胞素TGFβ的应答降低。这就提示了nm23可能控制肿瘤细胞对TGFβ和其它细胞素的应答。这点对肿瘤细胞在远处转移部位的集落形成十分重要。因转移部位的肿瘤细胞已脱离了原发部位的局部生长因子或肿瘤细胞—体细胞的相互作用，这时如肿瘤细胞不能对外在的诸如细胞素等因素的刺激发生应答，可能就使肿瘤细胞克隆化降低而无法生长。同时，还进行了nm23-H2的转染，发现nm23-H2的表达与肿瘤转移无明显相关性，从而间接提示了nm23-H1和nm23-H2的功能有所不同。
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Lakso等[12]研究了nm23的表达与鼠哺乳系统的发展和分化后发现，在胚胎发育前10?d，nm23表达呈低水平，在器官和多态上皮组织发育分化时nm23呈高水平，而在功能上皮细胞分化后，nm23又呈现低水平；在乳腺中发现，nm23基因表达在新生期呈低水平，未经产期和怀孕期呈高水平，哺乳期又呈现为低水平，从而认为nm23基因的表达与上皮的分化过程有关，但也不是普遍需求于分化的的各个阶段。
2 临床肿瘤中nm23基因表达的研究
目前已有较多的关于nm23基因在各种不同人恶性肿瘤中的表达与肿瘤临床病理生理指标关系的报道。现简单归纳如下。
在乳腺癌的研究中，1989年Bevilacqua等[13]第一次报道在27例原发性浸润性导管癌中，低水平nm23-H1 mRNA表达与高转移潜能的组织病理学指标相关，包括淋巴结转移、激素受体状态及分化程度。也有nm23-H1高表达与无瘤生存期及总生存率延长相关的报道。Stahl等[4]和Tokunaga等[14]用特异性检测方法检测了乳腺癌中nm23-H1和nm23-H2的表达，结果显示nm23-H1较nm23-H2与乳腺癌转移抑制的关系更为密切，从而也提示了nm23基因表达可能有组织差异性。Royds等[15]在研究原位导管乳腺癌时发现nm23表达降低发生在乳腺癌恶性过程的早期，且与肿瘤转移和复发有关。但也有NDPK/nm23表达与乳腺癌淋巴结转移无相关性的报道。
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nm23基因表达降低与肿瘤转移的相关性在肝癌、黑色素瘤、胃癌和卵巢癌中均有报道。在肝癌中，Nakayama等[16]报道nm23表达降低与肝癌远处转移密切相关。Boix等[17]发现nm23-H1高表达的孤立性小肝癌手术切除后，复发率较nm23-H1低表达者显著降低。也有nm23-H1表达与肝内转移呈负相关和与肝癌TNM分期相关的报道。在黑色素瘤中，Florenes等[18]报道nm23 RNA水平与肿瘤转移呈负相关，且与生存率有关，nm23表达高者生存期较长。在胃癌中，Nakayama等[19]报道nm23表达下降与胃癌的浸润、转移密切相关，而且是患者预后不良的标志。在卵巢癌中，Mandai等[20]报道nm23基因表达降低与淋巴转移及远处转移相关。
在结肠癌中，Haut等[21]报道nm23蛋白表达水平与肿瘤转移无明显关系，认为nm23在调控肿瘤转移中具有组织特异性。Hailat等[22]、Keim等[23]在神经母细胞瘤中发现nm23蛋白表达与肿瘤病期呈负相关，即Ⅲ、Ⅳ期肿瘤nm23表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期肿瘤，同时发现nm23高表达者，亦有M-myc基因表达产物的过度表达。相似的报道亦出现在前列腺癌和甲状腺癌的研究中，发现晚期肿瘤较早期肿瘤，恶性肿瘤较良性肿瘤有更高的nm23表达，显示nm23基因表达增高与恶性肿瘤浸润特性相关。
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在肺癌的研究中，Higashiyama等[24]报道88例腺癌，其nm23基因产物NDPK表达与肿瘤临床病理生理指标无相关性。Gazzeri等[25]报道104例肺癌的研究结果，显示肺腺癌中，nm23-H1蛋白表达与临床指标无关，而鳞癌中nm23-H1蛋白高表达与肿瘤病程进展有关。Lai等[26]报道在非Ⅰ期非小细胞肺癌中nm23表达水平降低者较nm23表达正常者术后更易发生远处转移。国内，陈晓峰等[27，28]报道在小细胞肺癌中nm23-H1表达与肿瘤转移呈负相关，且与预后有关，nm23-H1表达降低者预后不良。刘伦旭等[29～31]报道在肺癌中nm23-H2的mRNA表达与淋巴结转移呈负相关，且在鳞癌中与病理分期有关，低分化鳞癌的nm23-H2基因的mRNA表达明显低于中高分化鳞癌，而nm23-H1未见明显相关性。
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综上所述，nm23基因在乳腺癌、肝癌、胃癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌等恶性肿瘤中，其表达与抑制肿瘤转移、良好预后有关。而在神经母细胞瘤、甲状腺癌、前列腺癌等肿瘤中，nm23基因表达可能更与肿瘤增殖及浸润有关。分析其原因可能是：①nm23蛋白表达有一定的组织特异性；②nm23-H1和nm23-H2的两个亚基在调节上也不相同；③在肿瘤中测定nm23的NDPK活性时可能存在肿瘤细胞与其它正常细胞混在一起的情况，故NDPK的定量有差异，且酶的活性往往与各种因子的调节有关，而不仅仅在于它的浓度。故在结果中NDPK/nm23活性与肿瘤转移常可能是无关的；④目前在测定nm23蛋白表达水平时用的抗体，用Western blot发现在肿瘤组织中呈现为高分子量的蛋白条带，但在对照组中亦可见，只是程度较低而已，而现今用的+～号评价染色的系统尚无完整的体系，故也有可能出现一些矛盾性[1]；⑤肿瘤的发生、发展、转移过程是一个多基因参与和调控的过程，在这复杂的过程中，对各个肿瘤都用某一基因的变化来解释显然是不可能，也是不合理的。
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3 nm23基因缺失和突变与肿瘤转移
自Leone等[32]首先在109例不同肿瘤组织中发现乳腺癌、非小细胞肺癌、肾癌、结肠癌的nm23-H1等位基因缺失率分别为64%、43%、20%、22%以来，有关nm23基因结构改变与结肠癌的关系研究报告最多。Cohn等[33]前瞻性地研究发现在结肠癌中有nm23-H1等位基因缺失者，远处转移发生率显著增高。同时在检测结肠癌中17号染色体和18号染色体上nm23-H1(17q21)、p53(17p13)和18q21的等位基因缺失情况时发现，在有转移的肿瘤患者中nm23-H1等位基因的缺失是无转移患者的3倍。而17p13和18q21的等位基因缺失却与结肠癌的临床指标无关。Campo等[34]的研究也发现nm23-H1等位基因的缺失与结肠癌的浸润性增加有关，且nm23等位基因的缺失常伴有p53(17p13)的缺失，但p53等位基因的缺失并不一定有nm23基因的缺失；17号染色体(17p13或17q21)等位基因缺失与肿瘤细胞的DNA非整倍性相关。Wang在结肠癌的研究中发现nm23-H1等位基因的突变与肿瘤转移有关，而nm23的表达水平却与肿瘤转移无关，提示nm23-H1基因突变可能在结肠癌的转移中起作用。但在结肠癌的研究中也有未发现nm23基因改变的报道。Leone等[35]发现晚期神经母细胞瘤有nm23-H1基因扩增，并与nm23 mRNA表达增高及患者生存率下降有密切关系，检测到1例Ⅳ期肿瘤nm23-H1基因48位点上亮氨酸—缬氨酸点突变，而此突变可能使nm23基因的亮氨酸拉链结构发生变化。他认为nm23的基因改变而非表达下降与神经母细胞瘤转移有关。此外，在前列腺癌、黑色素瘤中也检测到了nm23-H1等位基因缺失。Lau等[36]将人非小细胞肺癌移植到裸鼠的皮下脂肪制成肺癌转移的动物模型，发现nm23基因缺失发生在移植瘤经过四代繁殖以后，或者皮下移植瘤转移到其它部位后。从而提示nm23基因的缺失与肺癌的进展和转移有密切关系。陈军等[37]应用Southern印迹杂交技术对52例肺癌组织中nm23-H1和nm23-H2等位基因的缺失进行了研究，观察到nm23-H1等位基因的缺失与肺癌细胞分化程度和肺癌转移有密切关系。此外，在肾癌细胞系、子宫内膜癌和甲状腺肿瘤的研究中也均未见nm23基因改变。上述结果提示nm23基因缺失和突变在肿瘤中普遍存在，但nm23基因缺失和突变与nm23的表达，以及与肿瘤转移关系的机理尚不清楚，有待进行更深入的研究。
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4 nm23基因结构的研究
人类的nm23基因研究较多的有nm23-H1和nm23-H2两类，都定位于染色体17q21.3。至今nm23基因的cDNA序列已测得，但nm23基因结构仍未完全阐明。现已知道人的17号染色体上有许多与肿瘤发生、发展和转移有关的基因(图1)，其中与nm23基因相邻群集排列的就有4个重要的基因。BRCA1是引起乳腺早期病变和卵巢癌的基因：C-erbB-2是众所周知的乳腺癌扩增癌基因；RARa是视黄酸受体α基因，与细胞分化的控制有关；MDC是一个新的非整合性的金属蛋白酶基因。不难设想，在这个染色体区带的任何改变都会引起这些基因结构和功能的变化，从而引起一系列生化机理的改变。Chen等[38]通过分离和测序研究了nm23-H1基因的5′末端序列发现，5′末端含有598个核苷酸的序列为一个启动子元件(图2)。在这段序列内-572位点处有转录因子TF11D的结合基因序列，-312位点处有CTF/NF1的结合基因序列。于-402位点和-286位点各有蛋白AP-1的结合基因序列。TF11D是一个与RNA多聚酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ识别有关的转录因子，两个AP-1和CTF/NF1序列的存在意味着同族的DNA结合蛋白能够与此序列结构结合并激活转录。进一步把CAT报告基因(CAT reporter gene)与启动子元件结合构成一个质粒并转染人的2fTGH细胞，测定CAT活性的表达验证了nm23-H1基因的5′末端序列为一个启动子元件，也证实了CTF/NF1和AP-1结合序列为启动子功能的必须结构。TF11D的结合序列对启动子的功能起着重要的调节作用。这一研究为最终阐明nm23基因结构和功能起了重要的指导作用。Okada还研究了nm23-H1和nm23-H2两基因的转录起动部位，发现二者含有与已知转录因子相结合的位点，但这些结合位点在两基因间并不相同，说明两基因是通过不同的方式被调节，具有相互独立性，而且这些调节方式可能具有细胞类型差异性。
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图1 人17号染色体：显示了nm23、RARα、BRCA1、NF1和p53基因的位置
Fig 1 Human chromosome 17 showing the locations of nm23, RARα, BRCA1, NF1 and p53 genes
5 nm23抑制肿瘤转移的生化机理
关于nm23基因抑制肿瘤转移的生化机理目前仍未完全阐明。1989年，Liotta在作nm23基因序列同源性分析时发现nm23-H1基因与果蝇awd基因(abnormal wing disc gene)蛋白质具有高度同源性，有77%相同。awd基因是在筛选引起果蝇成虫出翼异常的第三号染色体突变时发现的，awd基因异常导致果蝇广泛的发育畸形。Biggs证实了awd蛋白是一种NDPK。Wallet等在Dictyostelium discoideum中分离出两种NDPK(Gig17和Guk7.2)，与nm23和awd蛋白都有高度同源性。1991年，Gilles等[39]检测了人红细胞NDPK六聚体的两种亚基A链和B链的氨基酸顺序，发现A链与nm23-H1蛋白完全相同，B链与nm23-H2蛋白完全相同，直接证实nm23蛋白产物是一种NDPK。 DR-nm23和nm23-H4蛋白产物与NDPK具有同源性，且nm23-H4与nm23-H1、nm23-H2和DR-nm23的蛋白产物具有55%、56%和60%相同的氨基酸顺序。nm23-H4蛋白多了一个富含阳性电荷的NH2末端区，此末端区的结构是连通线粒体的必须途径。nm23-H4定位于染色体16p13.3，其mRNA长1.2?kb，在人的前列腺、心脏、肝脏、小肠和骨骼肌的组织中呈高表达，而在脑组织、白细胞中呈低表达。在果蝇的K-pn基因突变中，nm23-H4基因的蛋白产物也存在脯氨酸替代丝氨酸的变化。
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图2 nm23-H1基因启动区的核苷酸序列。下划线的核苷酸序列分别代表了-572位点的TF11D、-402位点和-286位点的AP-1以及-312位点的CTF/NF1结合基因序列。胎盘、肿瘤细胞系和结直肠癌普遍的转录起始部位——TIS定位于从第一个ATG编码起的-136位点。
Fig 2 Nucleotide sequence of the promoter region of the nm23-H1 gene. The underlined nucleotides represent the presence of TF11D at positions-572, AP-1 sites at both -402 and -286, and CTF/NF1 motifs at -312. The common transcription initiation site for placenta, tumor cell lines and colorectal tumor noted as TIS is identified at position -136 from the first ATG codon.
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nm23蛋白的第一个生化活性可能与它的磷酸化状态有关。nm23蛋白具有NDPK酶活性，使其能够形成高能nm23磷酸组氨酸[His(p)]中间体，以乒乓机制催化NDP合成NTP，其作用如下所示：
高能化合物如ATP+nm23ADP+nm23-His(P)NDPNTP+nm23
蛋白的磷酸化对细胞分化、信号传导以及其它生化过程都起着十分重要的作用。目前在体内、体外都已证实了存在低能磷酸化状态的nm23蛋白，虽然这种状态蛋白由于热力学原因不能在NDPK反应中直接传递磷酸盐。NDPK上组氨酸位点突变能使NDPK酶活性缺失。在nm23蛋白中还发现了另一种非组氨酸的耐酸性磷酸化形式，为磷酸丝氨酸，主要在丝氨酸44位点上，它可能具有独立的NDPK酶活性的生化功能。
由于nm23的蛋白与NDPK在氨基酸序列上的一致性，因而有人认为nm23很可能是通过与NDPK一致或相似的途径来调节细胞的信号传递和细胞分化。NDPK于1953年被发现以来，其功能被广泛研究，认为有以下几种功能在细胞生长、癌的发生和肿瘤转移中发挥作用：①调节NTPs池的大小，从而促进细胞分化。Keim[23]研究发现NDPK蛋白的水平与淋巴结的增殖有关，从而支持了这一观点。但后来在酵母菌突变的研究中却发现，NDPK的活性与细胞周期变化不一致，且测量组织中的NTPs池的大小也与NDPK活性不一致。②NDPK第二个生物功能为其直接或间接提供GTP和活化G蛋白(包括如ARF的小G蛋白和异三体G蛋白等)而发生信号传递。G蛋白是一种信号结合蛋白，它分布在细胞膜上。当与各类激素和受体结合后，相关G蛋白作为一种中转站向细胞传递信息。G蛋白在与GTP结合后便可发挥催化活性，当GTP被水解为GDP后G蛋白失活，从而引起一系列细胞内信号传递过程。nm23样的NDPK可通过高能磷酸链作用调节GTP供给而调节G蛋白活性，从而调节细胞信号的传递。但Randazzo等[40]经过对细胞的严格生化检查却没有直接发现在G蛋白上GDP向GTP转化磷酸化的证据。③NDPK第三个功能为通过提供GTP而调节微管的聚合与解聚。微管蛋白是一组蛋白微丝，能够维持细胞形态，构成有丝分裂纺锤体。它有两个鸟苷酸结合位点，在体外实验发现微管聚合需要GTP与其结合，当GTP转化为GDP时微管发生解聚。Nickerson等[41]分离出微管相关NDPK，发现其能催化微管蛋白上的GDP磷酸化为GTP，参与微管聚合而形成纺锤体，从而调节细胞运动。awd蛋白也被证实是一种微管相关蛋白。若NDPK和awd发生异常会导致纺锤体形成障碍，从而出现非整倍体细胞及细胞移动异常。Liotta等[42]观察到在转移肿瘤细胞中，DNA的非整倍体与nm23表达降低有关，提示由于NDPK/nm23的表达降低或突变引起了纺锤体形成不完全，从而导致畸形的有丝分裂。但Golden[43]在nm23-H1转染的鼠K-1735 TK黑色素瘤模型中研究NDPK活性和nm23表达与肿瘤转移抑制关系中发现，虽然nm23的表达与肿瘤转移呈负相关，但在对照组与实验组中，NDPK的活性以及微管和染色体的结构变化却无显著差异，从而提示NDPK/nm23在黑色素瘤中具有抑制肿瘤转移的作用，但其机理可能仍有特异之处。
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关于nm23蛋白生化活性的第三个假设为，nm23蛋白及其同源物可能与GTP酶活化蛋白GAP有关。在研究果蝇Pn基因(drosophila awd gene killer of prune)时发现，Pn基因突变导致细胞的异常发展和分化。而Pn基因的一部分序列又与GAP蛋白的催化区序列相似，从而认为nm23/awd可能通过与GAP相似蛋白的相互作用而调节细胞的分化。但后来进一步研究发现GAP催化区是一个保守的氨基酸序列区，而Pn基因在此氨基酸序列区却未显示出相应的保守性，从而在一定程度上也否认了该假设[1]。
第四个假设为nm23蛋白可能是一种分泌蛋白，通过分泌蛋白的作用而调节细胞的分化。但在转染了nm23-1基因的MDA-MB-435细胞株和K-1735TK黑色素瘤细胞株的体外培养的上清液中经过Western印迹杂交，却未得到证实[1]。
第五个假设为nm23蛋白可能通过亮氨酸拉链结构介导蛋白∶DNA二聚体结合而发挥生化功能。在nm23和awd蛋白中有包含亮氨酸拉链结构的亮氨酸重复结构，此类结构也存在于某些特定的转录因子上，作用是调节蛋白∶DNA二聚体的结合。这些亮氨酸重复结构却不存在于低等的微生物如细菌的nm23的蛋白中，从而提示此类结构可能与细胞分化有关。
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此外，Postel等[44]发现nm23-H2与已知的转录因子PuF(purine-binding factor)基因有99%相同。PuF所识别的DNA顺序中富含嘌呤碱基，是一种能结合在基因调节区特异顺序上的转录调节因子，能与人类C-myc基因调控区-142、-115位点的核酸高敏区(nuclease hypersensitive element)相结合，此种结合为C-myc基因转录起动所必需。体外试验也证实nm23-H2多肽有结合DNA的特性，并对人类C-myc基因的转录激活具有直接作用。进一步研究发现nm23-H2基因发生突变而丧失NDPK样酶活性后仍具有与野生型蛋白一样的结合C-myc DNA的结合性。说明nm23-H2基因蛋白产物至少具有两种独立功能：①NDPK酶活性，参与NTP合成；②PuF功能，参与转录。
6 问题和研究方向
现有的研究表明nm23基因的表达水平、基因缺失、突变与肿瘤的临床病理生理指标和预后有一定的内在联系。如在乳腺癌、肝癌、恶性黑色素瘤等肿瘤中，已明确nm23基因的低表达与肿瘤转移和预后不良密切相关；而在甲状腺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤中却见nm23表达增高与肿瘤的增殖、浸润有关。这些现象说明nm23基因在不同肿瘤组织中作用不同，具有组织特异性，而造成这些现象的确切机理和其抑制肿瘤转移的生化机理尚未明了，且nm23基因结构和功能的调控方式也未完全阐明。故目前一个主要研究目的就是要阐明nm23基因的生化机理和分子机理，明确它如何实现对细胞分化和转移进行调节，并希望以此理论作指导，发现控制和治疗肿瘤转移的新方法和新手段。另一个主要研究方向是如何把nm23基因作为一种早期诊断、预后评价和基因治疗手段应用于临床。
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本研究受国家自然科学基金(39470687)、卫生部优秀青年科技人才专项基金(Q9436)和美国纽约中华医学基金(Y9316)资助
参考文献
1，Steeg PS, Able De La Rosa, Flatow U, et al. nm23 and breast cancer metastasis. Breast Cancer Res Treat,1993,25(2)∶175-187.
2，Steeg P. Genetic control of the metastatic phenotype. Semin Cancer Biol,1991,2(2)∶105-110.
3，Steeg PS, Berilacqua G, Kopper L, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential. J Natl Cancer Inst,1988,80(3)∶200-204.
, 百拇医药
4，Stahl JA, Leone A, Rosengard AM, et al. Identification of a second human nm23 gene, nm23-H2. Cancer Res,1991,51(1)∶445-449.
5，Martinez R, Venturelli D, Perrotti D, et al. Gene structure, promoter activity, and chromosomal location of the DR-nm23 gene, a related member of the nm23 gene family. Cancer Res,1997,57(6)∶1180-1187.
6，Milon L, Rousseau-Merck MF, Munier A, et al. nm23-H4 a new member of the family of human nm23/nucleoside diphosphate kinase genes localised on chromosome 16p13.3. Hum Genet,1997,99(4)∶550-557.
, 百拇医药
7，江贤鹏，刘康达，周信达，等.与肿瘤转移抑制基因nm23高度同源的nm23-H3b基因的克隆和序列分析.中华医学杂志，1994，74(11)∶670-673.
8，Steeg PS, Bevilacqua G, Pozzatti R, et al. Altered expression of nm23 a gene associated with low tumor metastatic potential, during adenovirus Z Ela inhibition of experimental metastasis. Cancer Res,1988,48(22)∶6550-6554.
9，Leone A, Flatow U, King C, et al. Reduced tumor incidence metastatic potential and cytokine responsiveness of nm23 transfected melanoma cells. Cell,1991,65(1)∶25-35.
, 百拇医药
10，Leone A, Flatow U, Van Houtte K, et al. Transfection of human nm23-H1 into the human MDA-MB-435 breast carcinoma cell line: relationship to growth colonization metastatic potential and enzymatic activity (Submitted).
11，Price JE, Polyzos A, Zhang RD, et al. Tumorigenicity and metastasis of human breast carcinoma cell lines in nude mice. Cancer Res,1990,50(3)∶717-721.
12，Lakso M, Steeg PS, Westphal H. Embryonic expression of nm23 during mouse organogenesis. Cell Growth Differentiation,1992,3(12)∶873-879.
, http://www.100md.com
13，Bevilacqua G, Sobel ME, Liotta LA, et al. Association of low nm23 RNA levels in human primary infiltrating ductal breast carcinomas with lymph node involvement and other histopathological indicators of high metastatic potential. Cancer Res,1989,48(18)∶5185-5190.
14，Tokunaga Y, Vrano T, Furukawa K, et al. Reduced expression of nm23-H1, but not of nm23-H2: Is concordant with the frequency of lymph-node metastasis of human breast cancer. Int J Cancer,1993,55(1)∶66-71.
, http://www.100md.com
15，Royds JA, Stephenson TJ, Rees Rc, et al. nm23 protein expression in ductal in situ and invasive human breast carcinoma. J Natl Cancer Inst,1993,85(9)∶727-731.
16，Nakayama T, Obtsuru A, Nakao A, et al. Expression in human hepatocellular carcinoma of nucleoside diphosphate kinase, a homologue of the nm23 gene product. J Natl Cancer Inst,1992,84(17)∶1349-1354.
17，Boix L, Bruix J, Campo E, et al. nm23-H1 expression and disease recurrence after surgical resection of small hepatocellular carcinoma. Gastroenterology,1994,107(2)∶486-491.
, 百拇医药
18，Florenes VA, Aamdal S, Myklebost O, et al. Levels of nm23 messenger RNA in metastatic malignant melanomas: inverse correlation to disease progression. Cancer Res,1992,52(21)∶6088-6091.
19，Nakayama H, Yassui W, Yokozaki H, et al. Reduced expression of nm23 is associated with metastasis of human gastric carcinomas. Jpn J Cancer Res,1993,84(2)∶184-190.
20，Mandai M, Konishi I, Koshiyama M, et al. Expression of metastasis related nm23-H1 and nm23-H2 genes in ovarian carcinomas: Correlation with clinicopathology, EGFR, c-erbB-2, and c-erbB-3 genes, and sex steroid receptor expression. Cancer Res,1994,54(7)∶1825-1830.
, 百拇医药
21，Haut M, Steeg PS, Willson JK, et al. Induction of nm23 gene expression in colon tumors of high and low metastatic potential. J Natl Cancer Inst,1991,83(10)∶712-716.
22，Hailat N, Kein DR, Melhem RF, et al. High levels of p19/nm23 protein in neuroblastoma are associated with advanced stage disease and with N-myc gene amplification. J Clin Invest,1991,88(1)∶341-345.
23，Keim D, Hailat N, Melhem R, et al. Proliferation related expression of p19/nm23 nucleoside diphosphate kinase. J Clin Invest,1992,89(3)∶919-924.
, 百拇医药
24，Higashiyama M, Dio O, Yokouchi H, et al. Immunohistochemical analysis of nm23 gene product/NDP kinase expression in pulmonary adenocarcinoma: lack of prognostic value. Br J Cancer,1992,66(3)∶533-536.
25，Gazzeri S, Brambilla E, Negoescu A, et al. Overexpression of nucleoside diphosphate kinase A/nm23-H1 protein in human lung tumors: association with tumor progression in squamous carcinoma. Lab Invest,1996,74(1)∶158-161.
, 百拇医药
26，Lai WW, Wu MH, Yan JJ, et al. Immunohistochemical analysis of nm23-H1 in stage Ⅰ non-small cell lung cancer: a useful marker in prediction of metastasis. Am Thorac Srug, 1996,62(5)∶1500-1504.
27，陈晓峰，周清华，石应康，等.转移抑制基因nm23-H1在人肺癌组织中的表达研究.中国胸心血管外科临床杂志，1997，4(2)∶89-91.
28，陈晓峰，周清华，石应康，等.转移抑制基因nm23-H1在肺癌中的表达及其与预后的关系.中华实验外科杂志，1998，15(6)∶508-510.
29，刘伦旭，孙芝琳，周清华，等.狭缝印迹杂交分析nm23基因mRNA在人肺癌中的表达.华西医科大学学报，1998，29(4)∶364-367.
, 百拇医药
30，刘伦旭，周清华，覃扬.Northern印迹杂交分析nm23基因在人肺癌中的表达研究.中华肿瘤杂志，1998，20(5)∶342-344.
31，刘伦旭，周清华，石应康，等.癌转移抑制基因nm23在人肺癌中的转录表达研究.肺癌杂志，1999，2(1)∶1-4.
32，Leone A, McBride OW, Weston A, et al. Somatic allelic deletion of nm23 in human cancer. Cancer Res,1991,51(9)∶2490-2493.
33，Cohn KH, Wang FS, Desoto-Lapaix F, et al. Association of nm23-H1 allelic deletions with distant metastasis in colorectal carcinoma. Lancet,1991,238(8769)∶722-724.
, 百拇医药
34，Campo E, Miques R, Jares P, et al. Prognostic significance of the loss of heterozygosity of nm23-H1 and p53 genes in human colorectal carcinomas. Cancer,1994,79(12)∶2913-2922.
35，Leone A, Seeger RC, Hong CM, et al. Evidence for nm23 RNA overexpression, DNA amplification and mutation in aggressive childhood neuroblastomas. Oncogene,1993,8(4)∶855-865.
36，Lau DH, Lu D, Hammond WG, et al. Loss of nm23 and Alu DNA in human lung cancer propagated in nude mice. Cancer Lett, 1995,97(2)∶163-168.
, 百拇医药
37，陈军，周清华，覃扬，等.人肺癌中nm23等位基因缺失的研究.中国肺癌杂志，2000，3(1)∶8-13.
38，Chen HC, Wang LM, Banerye S. Isolation and characterization of the promoter region of human nm23-H1, a metastasis suppressor gene. Oncogene,1994,9(10)∶2905-2912.
39，Gilles AM, Presecan E, Vonica A, et al. Nucleoside diphosphate kinase from human erythrocytes. J Biol Chem, 1991,266(14)∶8784-8789.
40，Randazzo PA, Northup JK, Kahn RA. Regulatory GTP binding proteins (ARF, Gi, and RAS) are not activated directly by nucleoside diphosphate kinase. J Biol Chem,1992,267(25)∶18182-18189.
, 百拇医药
41，Nickerson JA, Wells WW. The microtubule-associated nucleoside diphosphate kinase. J Biol Chem,1984,259(18)∶11297-11300.
42，Liotta LA, Steeg PS. Clues to the function of nm23 and Awd proteins in development, signal transduction and tumor metastasis provided by studies of dictyostelium discoideum. J Natl Cancer Inst,1990,82(14)∶1170-1172.
43，Golden A, Benedict M, Shearn A, et al. Nucleoside diphosphate kinase, nm23 and tumor metastasis: possible biochemical mechanisms. In: Benz C, Liu E eds. Oncogenes and Tumor Sppressor Genes in Human Malignancies. Kluwr Academic Phblishers,1993. 345-358.
44，Postel EH, Berberich SJ, Flint SJ, et al. Human C-myc transcription factor PuF identified as nm23-H2 nucleoside diphosphate kinase, a candidate suppressor of tumor metastasis. Science,1993,2616(5210)∶478-480.
(收稿：1999-04-14 修回：1999-09-20)
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单位：陈军 周清华(610041 华西医科大学附属第一医院胸外科)
关键词：
中国肺癌杂志000323 肿瘤转移是其恶性标志和特征之一，也是肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因。肿瘤转移是一个复杂的过程，可能涉及原发部位的肿瘤穿过组织基底膜，避开机体免疫反应，穿过血管和淋巴管进入新组织实质，肿瘤血管形成，而后形成转移灶等一系列表型的改变。
阐明肿瘤转移过程可为肿瘤的防治提供新的策略。1987年SEER(survebuance epidemiology and end results in USA)调查表明：在临床诊断和治疗的乳腺癌患者中，仅7%发现远处转移，38%有局部淋巴结转移，52%未见转移，3%资料不全。这在理论上提示如果能阻止肿瘤转移过程的任何一步，都将有益于52%或38%的患者。但事实上在这52%或38%的患者中，可能早已发生了少数肿瘤细胞或微型灶的远处转移，只是由于病灶太小而不能检测到。在这种情况下，只有针对远处病灶中肿瘤细胞的生长、肿瘤血管的形成和肿瘤细胞的克隆化而形成较大转移灶的治疗方法才是有效的。故Steeg等[1]认为研究肿瘤转移应把主要精力放在肿瘤转移过程的最后阶段。
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肿瘤细胞的转移有一系列改变，如穿过组织基底膜至肿瘤细胞的克隆化而形成远处转移灶等表型，并受转移相关基因的调控。这些表型的改变是在其特有的生化机理下完成的，如肿瘤细胞可产生四种类型的蛋白酶而发生浸润。转移的肿瘤细胞在表型和基因整合水平上都十分不稳定。虽然造成这种不稳定性的原因目前尚不清楚，但正是由于这些不稳定性造成了肿瘤细胞表型的改变，从而发生和实现肿瘤的转移。也正是对肿瘤转移过程的生化和分子机理的不清楚阻碍了抗肿瘤转移治疗的发展。
目前关于肿瘤转移多认为是由于肿瘤细胞的一系列表型改变的结果。Steeg[2]报道在体外研究中，通过转染单个癌基因可诱导正常细胞转化为肿瘤细胞，并发生转移，且出现一系列诸如肿瘤细胞的粘附性、蛋白酶的产量、运动性等多种表型的改变。这表明单个癌基因可驱使其下游基因发生遗传的改变。进一步研究发现，正常胚胎细胞和转移肿瘤细胞表型相似，推测与肿瘤转移有关的基因链可能与胚胎发展和分化期的基因链相同。如果能够明白肿瘤转移过程中调节肿瘤转移的上游基因的改变导致下游基因遗传信息发生变化的机理，并找到这种关键的上游基因，就有可能发现阻止肿瘤转移的有效方法。近年来，已发现某些基因改变与肿瘤转移关系密切，其中尤以nm23基因与肿瘤转移的关系更密切。nm23被认为可能是肿瘤转移过程中起关键作用的上游调节基因。本文拟就近年来nm23基因与肿瘤转移关系的研究进展综述如下。
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1 nm23基因的发现、结构及其在肿瘤转移、分化中的作用
1.1 nm23基因的发现 1988年，美国国立癌症研究所的Steeg等[3]在鼠K-1735黑色素瘤的cDNA文库中通过差相杂交筛选出一个cDNA克隆，用这种cDNA与7株具有不同转移能力的K-1735细胞株的mRNA进行Northern印迹杂交，结果显示此基因在每个细胞株的表达分别与它们的转移能力呈负相关；原位杂交也显示其在低转移细胞株中的转录表达比高转移细胞株增高10倍。遂将此基因命名为nm23基因(non-metastasis编号为23的cDNA基因克隆)，认为是一种肿瘤转移抑制基因，并测得此基因cDNA碱基序列及其编码的氨基酸顺序。之后再用抗nm23多肽11抗体进行Western印迹杂交，亦显示出蛋白水平与肿瘤转移能力呈负相关，与mRNA变化相符。1991年，Stahl等[4]用鼠Pnm23-1重组质粒筛选人类成纤维细胞cDNA文库时发现了第二个nm23基因，命名为nm23-H2，Steeg发现的nm23基因遂为nm23-H1，并认为nm23-H1和nm23-H2是两个独立的基因。1997年，Martinez等[5]用差相杂交法从慢性髓性白血病原始细胞的DNA文库中发现了DR-nm23。同年，Milon等[6]用逆转录PCR法差相检查人胃的cDNA文库时发现了nm23-H4基因。国内江贤鹏等[7]用PCR技术从人肝基因组DNA中扩增nm23序列，经克隆筛选得到5′端375?bp克隆，命名为nm23-H3b。序列分析发现，nm23-H3b在40～70?bp之间与原序列完全不同，其它序列与nm23-H1有86%的同源性，与nm23-H2有90%的同源性。BglⅡ消化人肝基因组DNA，以nm23-H3b?DNA为探针，经Southern Blot后出现10.5、7.9和4.0?kb的3条杂交带，未见与nm23-H1和nm23-H2相同的杂交带。因此认为nm23-H3b是一种与人肿瘤转移抑制基因nm23-H1和nm23-H2高度同源的新基因克隆，但随后再未见相关研究的报道。
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1.2 nm23结构及其在肿瘤转移中的作用 人类发现的nm23基因有nm23-H1、nm23-H2、DR-nm23和nm23-H4四种。nm23-H1和nm23-H2都定位于染色体17q21.3，长约10?kb，呈串联排列，中间隔有4?kb，每个基因都含有5个外显子。它们的cDNA碱基序列及其编码的氨基酸顺序已被测得，其蛋白产物含有152个氨基酸，分子量为17?ku，两基因蛋白88%具相同的氨基酸顺序。DR-nm23定位于染色体16q13，含有5个内含子和6个外显子，其蛋白产物与nm23-H1和nm23-H2两基因的蛋白产物具有70%左右的相同氨基酸序列[5]。nm23-H4定位于染色体16p13.3，其蛋白产物具有187个氨基酸顺序[6]。
为了明确nm23在肿瘤转移过程中的作用，Steeg等[8]进一步检测了亚硝基甲基胺诱发的鼠乳腺癌以及用ras和ras+Ela基因转染的小鼠胚胎成纤维细胞系，发现各细胞系nm23基因RNA表达水平均与它们的转移能力呈负相关。在ras+Ela基因转染组中nm23 RNA水平明显高于ras基因转染组，从而认为Ela基因可能是通过提高nm23基因表达来抑制肿瘤的转移。Leone等[9]直接用鼠nm23-1 cDNA转染小鼠K-1735黑色素瘤TK细胞系发现，nm23-1转染的细胞系肿瘤转移能力较对照组低57%～96%，但nm23-1的表达与肿瘤转移未见相关性。同时，在体外研究中发现nm23-1转染的K-1735TK黑色素瘤细胞对TGFβ(transforming growth factor β)的刺激应答明显降低，而Schwartz、Kerbel等的研究发现转移的肿瘤细胞常接受TGFβ的刺激，而非转移的肿瘤细胞对TGFβ的刺激却无应答或受到其抑制。相似的结论也在Leone等[10]和Price等[11]的研究中获得证实，他们分别用人的nm23-H1转染人的MDA-MB-435乳腺癌细胞株，在体外培养和把转染的肿瘤细胞接种到裸鼠上时发现，有nm23-H1表达组的肿瘤转移潜能降低了50%～90%，且在体外研究中表达的nm23-H1细胞株表型出现了：①生长率降低，传代能力下降；②集落形成(克隆化)能力降低；③对细胞素TGFβ的应答降低。这就提示了nm23可能控制肿瘤细胞对TGFβ和其它细胞素的应答。这点对肿瘤细胞在远处转移部位的集落形成十分重要。因转移部位的肿瘤细胞已脱离了原发部位的局部生长因子或肿瘤细胞—体细胞的相互作用，这时如肿瘤细胞不能对外在的诸如细胞素等因素的刺激发生应答，可能就使肿瘤细胞克隆化降低而无法生长。同时，还进行了nm23-H2的转染，发现nm23-H2的表达与肿瘤转移无明显相关性，从而间接提示了nm23-H1和nm23-H2的功能有所不同。
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Lakso等[12]研究了nm23的表达与鼠哺乳系统的发展和分化后发现，在胚胎发育前10?d，nm23表达呈低水平，在器官和多态上皮组织发育分化时nm23呈高水平，而在功能上皮细胞分化后，nm23又呈现低水平；在乳腺中发现，nm23基因表达在新生期呈低水平，未经产期和怀孕期呈高水平，哺乳期又呈现为低水平，从而认为nm23基因的表达与上皮的分化过程有关，但也不是普遍需求于分化的的各个阶段。
2 临床肿瘤中nm23基因表达的研究
目前已有较多的关于nm23基因在各种不同人恶性肿瘤中的表达与肿瘤临床病理生理指标关系的报道。现简单归纳如下。
在乳腺癌的研究中，1989年Bevilacqua等[13]第一次报道在27例原发性浸润性导管癌中，低水平nm23-H1 mRNA表达与高转移潜能的组织病理学指标相关，包括淋巴结转移、激素受体状态及分化程度。也有nm23-H1高表达与无瘤生存期及总生存率延长相关的报道。Stahl等[4]和Tokunaga等[14]用特异性检测方法检测了乳腺癌中nm23-H1和nm23-H2的表达，结果显示nm23-H1较nm23-H2与乳腺癌转移抑制的关系更为密切，从而也提示了nm23基因表达可能有组织差异性。Royds等[15]在研究原位导管乳腺癌时发现nm23表达降低发生在乳腺癌恶性过程的早期，且与肿瘤转移和复发有关。但也有NDPK/nm23表达与乳腺癌淋巴结转移无相关性的报道。
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nm23基因表达降低与肿瘤转移的相关性在肝癌、黑色素瘤、胃癌和卵巢癌中均有报道。在肝癌中，Nakayama等[16]报道nm23表达降低与肝癌远处转移密切相关。Boix等[17]发现nm23-H1高表达的孤立性小肝癌手术切除后，复发率较nm23-H1低表达者显著降低。也有nm23-H1表达与肝内转移呈负相关和与肝癌TNM分期相关的报道。在黑色素瘤中，Florenes等[18]报道nm23 RNA水平与肿瘤转移呈负相关，且与生存率有关，nm23表达高者生存期较长。在胃癌中，Nakayama等[19]报道nm23表达下降与胃癌的浸润、转移密切相关，而且是患者预后不良的标志。在卵巢癌中，Mandai等[20]报道nm23基因表达降低与淋巴转移及远处转移相关。
在结肠癌中，Haut等[21]报道nm23蛋白表达水平与肿瘤转移无明显关系，认为nm23在调控肿瘤转移中具有组织特异性。Hailat等[22]、Keim等[23]在神经母细胞瘤中发现nm23蛋白表达与肿瘤病期呈负相关，即Ⅲ、Ⅳ期肿瘤nm23表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期肿瘤，同时发现nm23高表达者，亦有M-myc基因表达产物的过度表达。相似的报道亦出现在前列腺癌和甲状腺癌的研究中，发现晚期肿瘤较早期肿瘤，恶性肿瘤较良性肿瘤有更高的nm23表达，显示nm23基因表达增高与恶性肿瘤浸润特性相关。
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在肺癌的研究中，Higashiyama等[24]报道88例腺癌，其nm23基因产物NDPK表达与肿瘤临床病理生理指标无相关性。Gazzeri等[25]报道104例肺癌的研究结果，显示肺腺癌中，nm23-H1蛋白表达与临床指标无关，而鳞癌中nm23-H1蛋白高表达与肿瘤病程进展有关。Lai等[26]报道在非Ⅰ期非小细胞肺癌中nm23表达水平降低者较nm23表达正常者术后更易发生远处转移。国内，陈晓峰等[27，28]报道在小细胞肺癌中nm23-H1表达与肿瘤转移呈负相关，且与预后有关，nm23-H1表达降低者预后不良。刘伦旭等[29～31]报道在肺癌中nm23-H2的mRNA表达与淋巴结转移呈负相关，且在鳞癌中与病理分期有关，低分化鳞癌的nm23-H2基因的mRNA表达明显低于中高分化鳞癌，而nm23-H1未见明显相关性。
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综上所述，nm23基因在乳腺癌、肝癌、胃癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌等恶性肿瘤中，其表达与抑制肿瘤转移、良好预后有关。而在神经母细胞瘤、甲状腺癌、前列腺癌等肿瘤中，nm23基因表达可能更与肿瘤增殖及浸润有关。分析其原因可能是：①nm23蛋白表达有一定的组织特异性；②nm23-H1和nm23-H2的两个亚基在调节上也不相同；③在肿瘤中测定nm23的NDPK活性时可能存在肿瘤细胞与其它正常细胞混在一起的情况，故NDPK的定量有差异，且酶的活性往往与各种因子的调节有关，而不仅仅在于它的浓度。故在结果中NDPK/nm23活性与肿瘤转移常可能是无关的；④目前在测定nm23蛋白表达水平时用的抗体，用Western blot发现在肿瘤组织中呈现为高分子量的蛋白条带，但在对照组中亦可见，只是程度较低而已，而现今用的+～号评价染色的系统尚无完整的体系，故也有可能出现一些矛盾性[1]；⑤肿瘤的发生、发展、转移过程是一个多基因参与和调控的过程，在这复杂的过程中，对各个肿瘤都用某一基因的变化来解释显然是不可能，也是不合理的。
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3 nm23基因缺失和突变与肿瘤转移
自Leone等[32]首先在109例不同肿瘤组织中发现乳腺癌、非小细胞肺癌、肾癌、结肠癌的nm23-H1等位基因缺失率分别为64%、43%、20%、22%以来，有关nm23基因结构改变与结肠癌的关系研究报告最多。Cohn等[33]前瞻性地研究发现在结肠癌中有nm23-H1等位基因缺失者，远处转移发生率显著增高。同时在检测结肠癌中17号染色体和18号染色体上nm23-H1(17q21)、p53(17p13)和18q21的等位基因缺失情况时发现，在有转移的肿瘤患者中nm23-H1等位基因的缺失是无转移患者的3倍。而17p13和18q21的等位基因缺失却与结肠癌的临床指标无关。Campo等[34]的研究也发现nm23-H1等位基因的缺失与结肠癌的浸润性增加有关，且nm23等位基因的缺失常伴有p53(17p13)的缺失，但p53等位基因的缺失并不一定有nm23基因的缺失；17号染色体(17p13或17q21)等位基因缺失与肿瘤细胞的DNA非整倍性相关。Wang在结肠癌的研究中发现nm23-H1等位基因的突变与肿瘤转移有关，而nm23的表达水平却与肿瘤转移无关，提示nm23-H1基因突变可能在结肠癌的转移中起作用。但在结肠癌的研究中也有未发现nm23基因改变的报道。Leone等[35]发现晚期神经母细胞瘤有nm23-H1基因扩增，并与nm23 mRNA表达增高及患者生存率下降有密切关系，检测到1例Ⅳ期肿瘤nm23-H1基因48位点上亮氨酸—缬氨酸点突变，而此突变可能使nm23基因的亮氨酸拉链结构发生变化。他认为nm23的基因改变而非表达下降与神经母细胞瘤转移有关。此外，在前列腺癌、黑色素瘤中也检测到了nm23-H1等位基因缺失。Lau等[36]将人非小细胞肺癌移植到裸鼠的皮下脂肪制成肺癌转移的动物模型，发现nm23基因缺失发生在移植瘤经过四代繁殖以后，或者皮下移植瘤转移到其它部位后。从而提示nm23基因的缺失与肺癌的进展和转移有密切关系。陈军等[37]应用Southern印迹杂交技术对52例肺癌组织中nm23-H1和nm23-H2等位基因的缺失进行了研究，观察到nm23-H1等位基因的缺失与肺癌细胞分化程度和肺癌转移有密切关系。此外，在肾癌细胞系、子宫内膜癌和甲状腺肿瘤的研究中也均未见nm23基因改变。上述结果提示nm23基因缺失和突变在肿瘤中普遍存在，但nm23基因缺失和突变与nm23的表达，以及与肿瘤转移关系的机理尚不清楚，有待进行更深入的研究。
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4 nm23基因结构的研究
人类的nm23基因研究较多的有nm23-H1和nm23-H2两类，都定位于染色体17q21.3。至今nm23基因的cDNA序列已测得，但nm23基因结构仍未完全阐明。现已知道人的17号染色体上有许多与肿瘤发生、发展和转移有关的基因(图1)，其中与nm23基因相邻群集排列的就有4个重要的基因。BRCA1是引起乳腺早期病变和卵巢癌的基因：C-erbB-2是众所周知的乳腺癌扩增癌基因；RARa是视黄酸受体α基因，与细胞分化的控制有关；MDC是一个新的非整合性的金属蛋白酶基因。不难设想，在这个染色体区带的任何改变都会引起这些基因结构和功能的变化，从而引起一系列生化机理的改变。Chen等[38]通过分离和测序研究了nm23-H1基因的5′末端序列发现，5′末端含有598个核苷酸的序列为一个启动子元件(图2)。在这段序列内-572位点处有转录因子TF11D的结合基因序列，-312位点处有CTF/NF1的结合基因序列。于-402位点和-286位点各有蛋白AP-1的结合基因序列。TF11D是一个与RNA多聚酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ识别有关的转录因子，两个AP-1和CTF/NF1序列的存在意味着同族的DNA结合蛋白能够与此序列结构结合并激活转录。进一步把CAT报告基因(CAT reporter gene)与启动子元件结合构成一个质粒并转染人的2fTGH细胞，测定CAT活性的表达验证了nm23-H1基因的5′末端序列为一个启动子元件，也证实了CTF/NF1和AP-1结合序列为启动子功能的必须结构。TF11D的结合序列对启动子的功能起着重要的调节作用。这一研究为最终阐明nm23基因结构和功能起了重要的指导作用。Okada还研究了nm23-H1和nm23-H2两基因的转录起动部位，发现二者含有与已知转录因子相结合的位点，但这些结合位点在两基因间并不相同，说明两基因是通过不同的方式被调节，具有相互独立性，而且这些调节方式可能具有细胞类型差异性。
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图1 人17号染色体：显示了nm23、RARα、BRCA1、NF1和p53基因的位置
Fig 1 Human chromosome 17 showing the locations of nm23, RARα, BRCA1, NF1 and p53 genes
5 nm23抑制肿瘤转移的生化机理
关于nm23基因抑制肿瘤转移的生化机理目前仍未完全阐明。1989年，Liotta在作nm23基因序列同源性分析时发现nm23-H1基因与果蝇awd基因(abnormal wing disc gene)蛋白质具有高度同源性，有77%相同。awd基因是在筛选引起果蝇成虫出翼异常的第三号染色体突变时发现的，awd基因异常导致果蝇广泛的发育畸形。Biggs证实了awd蛋白是一种NDPK。Wallet等在Dictyostelium discoideum中分离出两种NDPK(Gig17和Guk7.2)，与nm23和awd蛋白都有高度同源性。1991年，Gilles等[39]检测了人红细胞NDPK六聚体的两种亚基A链和B链的氨基酸顺序，发现A链与nm23-H1蛋白完全相同，B链与nm23-H2蛋白完全相同，直接证实nm23蛋白产物是一种NDPK。 DR-nm23和nm23-H4蛋白产物与NDPK具有同源性，且nm23-H4与nm23-H1、nm23-H2和DR-nm23的蛋白产物具有55%、56%和60%相同的氨基酸顺序。nm23-H4蛋白多了一个富含阳性电荷的NH2末端区，此末端区的结构是连通线粒体的必须途径。nm23-H4定位于染色体16p13.3，其mRNA长1.2?kb，在人的前列腺、心脏、肝脏、小肠和骨骼肌的组织中呈高表达，而在脑组织、白细胞中呈低表达。在果蝇的K-pn基因突变中，nm23-H4基因的蛋白产物也存在脯氨酸替代丝氨酸的变化。
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图2 nm23-H1基因启动区的核苷酸序列。下划线的核苷酸序列分别代表了-572位点的TF11D、-402位点和-286位点的AP-1以及-312位点的CTF/NF1结合基因序列。胎盘、肿瘤细胞系和结直肠癌普遍的转录起始部位——TIS定位于从第一个ATG编码起的-136位点。
Fig 2 Nucleotide sequence of the promoter region of the nm23-H1 gene. The underlined nucleotides represent the presence of TF11D at positions-572, AP-1 sites at both -402 and -286, and CTF/NF1 motifs at -312. The common transcription initiation site for placenta, tumor cell lines and colorectal tumor noted as TIS is identified at position -136 from the first ATG codon.
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nm23蛋白的第一个生化活性可能与它的磷酸化状态有关。nm23蛋白具有NDPK酶活性，使其能够形成高能nm23磷酸组氨酸[His(p)]中间体，以乒乓机制催化NDP合成NTP，其作用如下所示：
高能化合物如ATP+nm23ADP+nm23-His(P)NDPNTP+nm23
蛋白的磷酸化对细胞分化、信号传导以及其它生化过程都起着十分重要的作用。目前在体内、体外都已证实了存在低能磷酸化状态的nm23蛋白，虽然这种状态蛋白由于热力学原因不能在NDPK反应中直接传递磷酸盐。NDPK上组氨酸位点突变能使NDPK酶活性缺失。在nm23蛋白中还发现了另一种非组氨酸的耐酸性磷酸化形式，为磷酸丝氨酸，主要在丝氨酸44位点上，它可能具有独立的NDPK酶活性的生化功能。
由于nm23的蛋白与NDPK在氨基酸序列上的一致性，因而有人认为nm23很可能是通过与NDPK一致或相似的途径来调节细胞的信号传递和细胞分化。NDPK于1953年被发现以来，其功能被广泛研究，认为有以下几种功能在细胞生长、癌的发生和肿瘤转移中发挥作用：①调节NTPs池的大小，从而促进细胞分化。Keim[23]研究发现NDPK蛋白的水平与淋巴结的增殖有关，从而支持了这一观点。但后来在酵母菌突变的研究中却发现，NDPK的活性与细胞周期变化不一致，且测量组织中的NTPs池的大小也与NDPK活性不一致。②NDPK第二个生物功能为其直接或间接提供GTP和活化G蛋白(包括如ARF的小G蛋白和异三体G蛋白等)而发生信号传递。G蛋白是一种信号结合蛋白，它分布在细胞膜上。当与各类激素和受体结合后，相关G蛋白作为一种中转站向细胞传递信息。G蛋白在与GTP结合后便可发挥催化活性，当GTP被水解为GDP后G蛋白失活，从而引起一系列细胞内信号传递过程。nm23样的NDPK可通过高能磷酸链作用调节GTP供给而调节G蛋白活性，从而调节细胞信号的传递。但Randazzo等[40]经过对细胞的严格生化检查却没有直接发现在G蛋白上GDP向GTP转化磷酸化的证据。③NDPK第三个功能为通过提供GTP而调节微管的聚合与解聚。微管蛋白是一组蛋白微丝，能够维持细胞形态，构成有丝分裂纺锤体。它有两个鸟苷酸结合位点，在体外实验发现微管聚合需要GTP与其结合，当GTP转化为GDP时微管发生解聚。Nickerson等[41]分离出微管相关NDPK，发现其能催化微管蛋白上的GDP磷酸化为GTP，参与微管聚合而形成纺锤体，从而调节细胞运动。awd蛋白也被证实是一种微管相关蛋白。若NDPK和awd发生异常会导致纺锤体形成障碍，从而出现非整倍体细胞及细胞移动异常。Liotta等[42]观察到在转移肿瘤细胞中，DNA的非整倍体与nm23表达降低有关，提示由于NDPK/nm23的表达降低或突变引起了纺锤体形成不完全，从而导致畸形的有丝分裂。但Golden[43]在nm23-H1转染的鼠K-1735 TK黑色素瘤模型中研究NDPK活性和nm23表达与肿瘤转移抑制关系中发现，虽然nm23的表达与肿瘤转移呈负相关，但在对照组与实验组中，NDPK的活性以及微管和染色体的结构变化却无显著差异，从而提示NDPK/nm23在黑色素瘤中具有抑制肿瘤转移的作用，但其机理可能仍有特异之处。
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关于nm23蛋白生化活性的第三个假设为，nm23蛋白及其同源物可能与GTP酶活化蛋白GAP有关。在研究果蝇Pn基因(drosophila awd gene killer of prune)时发现，Pn基因突变导致细胞的异常发展和分化。而Pn基因的一部分序列又与GAP蛋白的催化区序列相似，从而认为nm23/awd可能通过与GAP相似蛋白的相互作用而调节细胞的分化。但后来进一步研究发现GAP催化区是一个保守的氨基酸序列区，而Pn基因在此氨基酸序列区却未显示出相应的保守性，从而在一定程度上也否认了该假设[1]。
第四个假设为nm23蛋白可能是一种分泌蛋白，通过分泌蛋白的作用而调节细胞的分化。但在转染了nm23-1基因的MDA-MB-435细胞株和K-1735TK黑色素瘤细胞株的体外培养的上清液中经过Western印迹杂交，却未得到证实[1]。
第五个假设为nm23蛋白可能通过亮氨酸拉链结构介导蛋白∶DNA二聚体结合而发挥生化功能。在nm23和awd蛋白中有包含亮氨酸拉链结构的亮氨酸重复结构，此类结构也存在于某些特定的转录因子上，作用是调节蛋白∶DNA二聚体的结合。这些亮氨酸重复结构却不存在于低等的微生物如细菌的nm23的蛋白中，从而提示此类结构可能与细胞分化有关。
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此外，Postel等[44]发现nm23-H2与已知的转录因子PuF(purine-binding factor)基因有99%相同。PuF所识别的DNA顺序中富含嘌呤碱基，是一种能结合在基因调节区特异顺序上的转录调节因子，能与人类C-myc基因调控区-142、-115位点的核酸高敏区(nuclease hypersensitive element)相结合，此种结合为C-myc基因转录起动所必需。体外试验也证实nm23-H2多肽有结合DNA的特性，并对人类C-myc基因的转录激活具有直接作用。进一步研究发现nm23-H2基因发生突变而丧失NDPK样酶活性后仍具有与野生型蛋白一样的结合C-myc DNA的结合性。说明nm23-H2基因蛋白产物至少具有两种独立功能：①NDPK酶活性，参与NTP合成；②PuF功能，参与转录。
6 问题和研究方向
现有的研究表明nm23基因的表达水平、基因缺失、突变与肿瘤的临床病理生理指标和预后有一定的内在联系。如在乳腺癌、肝癌、恶性黑色素瘤等肿瘤中，已明确nm23基因的低表达与肿瘤转移和预后不良密切相关；而在甲状腺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤中却见nm23表达增高与肿瘤的增殖、浸润有关。这些现象说明nm23基因在不同肿瘤组织中作用不同，具有组织特异性，而造成这些现象的确切机理和其抑制肿瘤转移的生化机理尚未明了，且nm23基因结构和功能的调控方式也未完全阐明。故目前一个主要研究目的就是要阐明nm23基因的生化机理和分子机理，明确它如何实现对细胞分化和转移进行调节，并希望以此理论作指导，发现控制和治疗肿瘤转移的新方法和新手段。另一个主要研究方向是如何把nm23基因作为一种早期诊断、预后评价和基因治疗手段应用于临床。
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本研究受国家自然科学基金(39470687)、卫生部优秀青年科技人才专项基金(Q9436)和美国纽约中华医学基金(Y9316)资助
参考文献
1，Steeg PS, Able De La Rosa, Flatow U, et al. nm23 and breast cancer metastasis. Breast Cancer Res Treat,1993,25(2)∶175-187.
2，Steeg P. Genetic control of the metastatic phenotype. Semin Cancer Biol,1991,2(2)∶105-110.
3，Steeg PS, Berilacqua G, Kopper L, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential. J Natl Cancer Inst,1988,80(3)∶200-204.
, 百拇医药
4，Stahl JA, Leone A, Rosengard AM, et al. Identification of a second human nm23 gene, nm23-H2. Cancer Res,1991,51(1)∶445-449.
5，Martinez R, Venturelli D, Perrotti D, et al. Gene structure, promoter activity, and chromosomal location of the DR-nm23 gene, a related member of the nm23 gene family. Cancer Res,1997,57(6)∶1180-1187.
6，Milon L, Rousseau-Merck MF, Munier A, et al. nm23-H4 a new member of the family of human nm23/nucleoside diphosphate kinase genes localised on chromosome 16p13.3. Hum Genet,1997,99(4)∶550-557.
, 百拇医药
7，江贤鹏，刘康达，周信达，等.与肿瘤转移抑制基因nm23高度同源的nm23-H3b基因的克隆和序列分析.中华医学杂志，1994，74(11)∶670-673.
8，Steeg PS, Bevilacqua G, Pozzatti R, et al. Altered expression of nm23 a gene associated with low tumor metastatic potential, during adenovirus Z Ela inhibition of experimental metastasis. Cancer Res,1988,48(22)∶6550-6554.
9，Leone A, Flatow U, King C, et al. Reduced tumor incidence metastatic potential and cytokine responsiveness of nm23 transfected melanoma cells. Cell,1991,65(1)∶25-35.
, 百拇医药
10，Leone A, Flatow U, Van Houtte K, et al. Transfection of human nm23-H1 into the human MDA-MB-435 breast carcinoma cell line: relationship to growth colonization metastatic potential and enzymatic activity (Submitted).
11，Price JE, Polyzos A, Zhang RD, et al. Tumorigenicity and metastasis of human breast carcinoma cell lines in nude mice. Cancer Res,1990,50(3)∶717-721.
12，Lakso M, Steeg PS, Westphal H. Embryonic expression of nm23 during mouse organogenesis. Cell Growth Differentiation,1992,3(12)∶873-879.
, http://www.100md.com
13，Bevilacqua G, Sobel ME, Liotta LA, et al. Association of low nm23 RNA levels in human primary infiltrating ductal breast carcinomas with lymph node involvement and other histopathological indicators of high metastatic potential. Cancer Res,1989,48(18)∶5185-5190.
14，Tokunaga Y, Vrano T, Furukawa K, et al. Reduced expression of nm23-H1, but not of nm23-H2: Is concordant with the frequency of lymph-node metastasis of human breast cancer. Int J Cancer,1993,55(1)∶66-71.
, http://www.100md.com
15，Royds JA, Stephenson TJ, Rees Rc, et al. nm23 protein expression in ductal in situ and invasive human breast carcinoma. J Natl Cancer Inst,1993,85(9)∶727-731.
16，Nakayama T, Obtsuru A, Nakao A, et al. Expression in human hepatocellular carcinoma of nucleoside diphosphate kinase, a homologue of the nm23 gene product. J Natl Cancer Inst,1992,84(17)∶1349-1354.
17，Boix L, Bruix J, Campo E, et al. nm23-H1 expression and disease recurrence after surgical resection of small hepatocellular carcinoma. Gastroenterology,1994,107(2)∶486-491.
, 百拇医药
18，Florenes VA, Aamdal S, Myklebost O, et al. Levels of nm23 messenger RNA in metastatic malignant melanomas: inverse correlation to disease progression. Cancer Res,1992,52(21)∶6088-6091.
19，Nakayama H, Yassui W, Yokozaki H, et al. Reduced expression of nm23 is associated with metastasis of human gastric carcinomas. Jpn J Cancer Res,1993,84(2)∶184-190.
20，Mandai M, Konishi I, Koshiyama M, et al. Expression of metastasis related nm23-H1 and nm23-H2 genes in ovarian carcinomas: Correlation with clinicopathology, EGFR, c-erbB-2, and c-erbB-3 genes, and sex steroid receptor expression. Cancer Res,1994,54(7)∶1825-1830.
, 百拇医药
21，Haut M, Steeg PS, Willson JK, et al. Induction of nm23 gene expression in colon tumors of high and low metastatic potential. J Natl Cancer Inst,1991,83(10)∶712-716.
22，Hailat N, Kein DR, Melhem RF, et al. High levels of p19/nm23 protein in neuroblastoma are associated with advanced stage disease and with N-myc gene amplification. J Clin Invest,1991,88(1)∶341-345.
23，Keim D, Hailat N, Melhem R, et al. Proliferation related expression of p19/nm23 nucleoside diphosphate kinase. J Clin Invest,1992,89(3)∶919-924.
, 百拇医药
24，Higashiyama M, Dio O, Yokouchi H, et al. Immunohistochemical analysis of nm23 gene product/NDP kinase expression in pulmonary adenocarcinoma: lack of prognostic value. Br J Cancer,1992,66(3)∶533-536.
25，Gazzeri S, Brambilla E, Negoescu A, et al. Overexpression of nucleoside diphosphate kinase A/nm23-H1 protein in human lung tumors: association with tumor progression in squamous carcinoma. Lab Invest,1996,74(1)∶158-161.
, 百拇医药
26，Lai WW, Wu MH, Yan JJ, et al. Immunohistochemical analysis of nm23-H1 in stage Ⅰ non-small cell lung cancer: a useful marker in prediction of metastasis. Am Thorac Srug, 1996,62(5)∶1500-1504.
27，陈晓峰，周清华，石应康，等.转移抑制基因nm23-H1在人肺癌组织中的表达研究.中国胸心血管外科临床杂志，1997，4(2)∶89-91.
28，陈晓峰，周清华，石应康，等.转移抑制基因nm23-H1在肺癌中的表达及其与预后的关系.中华实验外科杂志，1998，15(6)∶508-510.
29，刘伦旭，孙芝琳，周清华，等.狭缝印迹杂交分析nm23基因mRNA在人肺癌中的表达.华西医科大学学报，1998，29(4)∶364-367.
, 百拇医药
30，刘伦旭，周清华，覃扬.Northern印迹杂交分析nm23基因在人肺癌中的表达研究.中华肿瘤杂志，1998，20(5)∶342-344.
31，刘伦旭，周清华，石应康，等.癌转移抑制基因nm23在人肺癌中的转录表达研究.肺癌杂志，1999，2(1)∶1-4.
32，Leone A, McBride OW, Weston A, et al. Somatic allelic deletion of nm23 in human cancer. Cancer Res,1991,51(9)∶2490-2493.
33，Cohn KH, Wang FS, Desoto-Lapaix F, et al. Association of nm23-H1 allelic deletions with distant metastasis in colorectal carcinoma. Lancet,1991,238(8769)∶722-724.
, 百拇医药
34，Campo E, Miques R, Jares P, et al. Prognostic significance of the loss of heterozygosity of nm23-H1 and p53 genes in human colorectal carcinomas. Cancer,1994,79(12)∶2913-2922.
35，Leone A, Seeger RC, Hong CM, et al. Evidence for nm23 RNA overexpression, DNA amplification and mutation in aggressive childhood neuroblastomas. Oncogene,1993,8(4)∶855-865.
36，Lau DH, Lu D, Hammond WG, et al. Loss of nm23 and Alu DNA in human lung cancer propagated in nude mice. Cancer Lett, 1995,97(2)∶163-168.
, 百拇医药
37，陈军，周清华，覃扬，等.人肺癌中nm23等位基因缺失的研究.中国肺癌杂志，2000，3(1)∶8-13.
38，Chen HC, Wang LM, Banerye S. Isolation and characterization of the promoter region of human nm23-H1, a metastasis suppressor gene. Oncogene,1994,9(10)∶2905-2912.
39，Gilles AM, Presecan E, Vonica A, et al. Nucleoside diphosphate kinase from human erythrocytes. J Biol Chem, 1991,266(14)∶8784-8789.
40，Randazzo PA, Northup JK, Kahn RA. Regulatory GTP binding proteins (ARF, Gi, and RAS) are not activated directly by nucleoside diphosphate kinase. J Biol Chem,1992,267(25)∶18182-18189.
, 百拇医药
41，Nickerson JA, Wells WW. The microtubule-associated nucleoside diphosphate kinase. J Biol Chem,1984,259(18)∶11297-11300.
42，Liotta LA, Steeg PS. Clues to the function of nm23 and Awd proteins in development, signal transduction and tumor metastasis provided by studies of dictyostelium discoideum. J Natl Cancer Inst,1990,82(14)∶1170-1172.
43，Golden A, Benedict M, Shearn A, et al. Nucleoside diphosphate kinase, nm23 and tumor metastasis: possible biochemical mechanisms. In: Benz C, Liu E eds. Oncogenes and Tumor Sppressor Genes in Human Malignancies. Kluwr Academic Phblishers,1993. 345-358.
44，Postel EH, Berberich SJ, Flint SJ, et al. Human C-myc transcription factor PuF identified as nm23-H2 nucleoside diphosphate kinase, a candidate suppressor of tumor metastasis. Science,1993,2616(5210)∶478-480.
(收稿：1999-04-14 修回：1999-09-20)
, 百拇医药