P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表达及其与骨肉瘤预后的关系
作者：谷贵山 徐莘香
单位：谷贵山(白求恩医科大学第一临床学院骨科 长春 130021)；徐莘香(白求恩医科大学第一临床学院骨科 长春 130021)
关键词：骨肉瘤；基因；免疫组化
P 〔摘要〕 目的 探讨P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤的表达及其与预后的关系。方法 15例骨肉瘤和5例软骨肉瘤石蜡切片，应用S-P免疫组化染色，结合临床资料进行分析。结果 15例骨肉瘤P-170的阳性率为33.33%，GST的阳性率为80%，TOPO-Ⅱ的阳性率为46.67%，nm23和CD44的阳性率分别为93.33%、86.67%。年龄小于20岁的骨肉瘤患者组，P-170、TOPO-Ⅱ、CD44的阳性率均高于年龄大于20岁组，而nm23在小于20岁组的阳性率却低于大于20岁组(P<0.05)。GST的表达率在两组无差异。术前化疗组P-170 CD44 nm23的阳性率高于术前无化疗组，而TOPO-Ⅱ GST在术前化疗组的表达却低于术前无化疗组(P<0.05)。存活在2年以内者P-170，GST，TOPO-Ⅱ的阳性率比存活两年以上者高，而nm23、CD44的表达情况正相反(P<0.05)。P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤的表达率均高于软骨肉瘤(P<0.05)。结论 P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤的表达率明显高于软骨肉瘤。在骨肉瘤中P-170、GST、TOPO-Ⅱ联合表达率越高，病人生存期越短。在临床上可联合检测，以此对骨肉瘤的恶性程度及预后进行评估。
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〔中图分类号〕 R738.1 〔文献标识码〕B
Expression of P-170,GST,TOPO-Ⅱ,nm23,CD44 in osteosarcoma and its correlation with prognosis
GU Gui-shan,XU Xin-xiang
(Department of Orthopeadics,First Clinical College of Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021)
〔Abstract〕 Objective The expression of P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44 in osteosarcoma was analyzed for approaching the relationship between the expression of the above 5 proteins and prognosis.Methods 18cases of human osteosarcoma and 5 cases of chondrosarcoma were studied by the methods of immunohistochemical assay.Results In osteosarcoma the positive rate was 33.3% for P-170,80% for GST and 46.67% for TOPO-Ⅱ、 93.33% for nm23,and 86.67% for CD44.But in chondrosarcoma the positive rate of P-170 was 0, of GST was 20%,of TOPO-Ⅱ was 20%,of CD44 and nm23 was 20% and 0 respectively.The positive rates of P-170,TOPO-Ⅱ and CD44 in the group with the age of less than 20 were higher than those in the group of older than 20.P-170,CD44,nm23 more highly expressed in the group of preoperative chemotherapy than in the group of no-preoperative chemotherapy.The patients survived for no more than 2 years had higher expressions of P-170、GST、TOPO-Ⅱ.Conclusions Detection of P-170,GST,TOPO-Ⅱ,nm23 and CD44 together can evaluate the malignance and prognosis of osteosarcoma,which should be used in clinic to instruct the treatment of osteosarcom.
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〔Key words〕 osteosarcoma; gene; immunohistochemistry
影响骨肉瘤预后的因素众多，这些因素既独立影响又相互关联，以单因素指标预测预后，往往造成较大的偏差。经多年研究，学者们认为影响骨肉瘤预后的根本原因在于：肿瘤细胞的增殖能力，转移能力以及对化疗药物的耐药能力。本文根据骨肉瘤相关基因的不同特性，选择与转移及多药耐有关的nm23、CD44、P-170、GST、TOPO-Ⅱ基因，应用免疫组化方法检测五种蛋白在骨肉瘤的表达，旨在寻找合理搭配的骨肉瘤预后标志物并评价其可靠性。
材料与方法
一、标本来源 本次实验共选用15例骨肉瘤，其中包括骨母细胞性6例，纤维母细胞性5例，软骨母细胞性4例，和5例软骨肉瘤标本，均取自我院病理科，并经病理专家重新进行诊断，所有标本均为手术后经10%福尔马林固定，石蜡包埋后切片。行5um连续切片六张，分别进行HE染色，P-170、GST、TOPO-Ⅱ nm23、CD44染色。
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二、临床资料 15例骨肉瘤患者，男7例，女8例。年龄：11～67岁。股骨下端8例，胫骨上端5例，肱骨上端、肋骨各1例。术前化疗7例，术后化疗11例。术前术后均行化疗5例，存活不足两年者10例，两年以上者5例。
三、主要试剂 P-170、GST、TOPO-Ⅱ nm23、CD44基因蛋白，S-P免疫组化、二氨基联苯胺(DBA)显色试剂盒均购于福州Maxim生物技术开发公司。
四、免疫组织化学染色 石蜡切片脱蜡，水化，PBS(PH7.4)冲洗。过氧化酶(试剂A)阻断15分钟，室温下10%山羊血清(试剂B)封闭非特异性背景15分钟， 加入一抗(P-170、 GST、TOPO-Ⅱ nm23、CD44单克隆抗体)，4℃冰箱过夜。取出后PBS冲洗，加入生物素标记的二抗(试剂C)，室温孵育30分钟，PBS(PH7.4)冲洗。链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶溶液(试剂D)室温孵育30分钟，PBS(PH7.4)冲洗，DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，中性树胶封片。
, 百拇医药
五、结果判定 判定标准：阴性(-)无着色细胞或与背景一致；阳性(+)着色细胞均呈棕黄色。
六、统计学分析：采用X2检验
结果
15例骨肉瘤P-170的阳性率为33.33%，GST的阳性率为80%，TOPO-Ⅱ的阳性率为46.67%， nm23和CD44的阳性率分别为93.33%，86.67%。根据年龄、化疗情况、存活时间进行分组(见表1，2，3，4)。
表1 骨肉瘤P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表达与年龄的关系
基因蛋白
年龄小于20岁
(10例)
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阳性率(%)
年龄大于20岁
(5例)
阳性率(%)
P-170
50%(5/10)
0%(0/5)
GST
80%(8/10)
80%(4/5)
TOPO-Ⅱ
50%(5/10)
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40%(2/5)
CD44
100%(10/10)
60%(3/5)
nm23
90%(9/10)
100%(5/5)
表2 骨肉瘤P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表达与化疗的关系
基因蛋白
术前化疗组
(7例)
, http://www.100md.com 阳性率(%)
术前无化疗组
(8例)
阳性率(%)
P-170
57.1%(4/7)
12.5%(1/8)
GST
71.43%(5/7)
87.5%(7/8)
TOPO-Ⅱ
42.86%(3/7)
, 百拇医药
50%(4/8)
CD44
100%(7/7)
75%(6/8)
nm23
100%(7/7)
87.5%(7/8)
表3 骨肉瘤P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表达与存活的关系
基因蛋白
存活2年以内组
(10例)
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阳性率(%)
存活2年以上组
(含2年，5例)
阳性率(%)
P-170
40%(4/10)
20%(1/5)
GST
90%(9/10)
80%(4/5)
TOPO-Ⅱ
50%(5/10)
, 百拇医药
40%(2/5)
CD44
80%(8/10)
100%(5/5)
nm23
90%(9/10)
100%(5/5)
表4 P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤及软骨肉瘤的表达
基因蛋白
骨肉瘤
(15例)
, 百拇医药 阳性率(%)
软骨肉瘤
(5例)
阳性率(%)
P-170
33.33%(5/15)
0%(0/5)
GST
80%(12/15)
20%(1/5)
TOPO-Ⅱ
46.67%(6/15)
, 百拇医药
0%(0/5)
CD44
86.67%(13/15)
0%(0/5)
nm23
93.33%(14/15)
20%(1/5)
年龄小于20岁的骨肉瘤患者组，P-170 TOPO-Ⅱ CD44的阳性率均高于年龄大于20岁组，而nm23在小于20岁组的阳性率却低于大于20岁组(P<0.05)，GST的表达率在两组无差异。
术前化疗组P-170 CD44 nm23的阳性率高于术前无化疗组，而TOPO-Ⅱ、GST在术前化疗组的表达却低于术前无化疗组(P<0.05)。
, 百拇医药
存活在2年以内者P-170，GST，TOPO-Ⅱ的阳性率比存活两年以上者高，而nm23，CD44的表达情况正相反(P<0.05)。
P-170，GST，TOPO-Ⅱ，nm23，CD44在骨肉瘤的表达率均高于软骨肉瘤(P<0.05)。
讨论
肿瘤细胞的增殖能力、转移能力、及对化疗药物的敏感性是影响骨肉瘤预后的根本原因。这些因素既独立又相互关联。因此，选择综合指标来判断预后显得非常重要。P-170蛋白[1](P-glycoprotein P-gp)是多药耐药基因(MDR1)的表达产物，是一种膜糖蛋白，分子量为170KD，它与某些细菌转运蛋白具有同源基因序列。它是一种ATP依赖的药物外流泵，P-糖蛋白的增加会导致细胞内化疗药物总量的减少，从而阻碍化疗药物的肿瘤细胞杀伤作用，影响化疗的疗效，是肿瘤细胞产生典型多药耐药的主要原因。人体多种器官的正常细胞，例如：肾上腺、肾脏、肝脏、结肠等都有较高的P-170蛋白的表达，在这些组织发生的肿瘤例如：嗜铬细胞瘤、结肠癌、肾细胞癌等也有相应的高表达。1993年，Ulrike stein等应用Northern杂交及免疫组化技术对29例骨组织和32例软组织肿瘤进行研究发现：69%表现为MDR1及P-170的阳性表达，这其中骨肉瘤为高表达，其表达率高达90%，恶纤组为低表达，其余均为中等程度表达。
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GST[2-4]即谷胱甘肽-巯基转移酶，包括谷胱甘肽-巯基转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶，是人体正常代谢所需的酶，谷胱甘肽和谷胱甘肽代谢酶的增加，使肿瘤细胞的解毒能力增加，严重影响了化疗药物对肿瘤的杀伤作用，是骨肉瘤产生多药耐药的另一主要原因，1991年，Brian等研究发现在对阿霉素耐药的人骨与软组织肉瘤细胞株细胞内，谷胱甘肽过氧化物酶活性明显增高，超出非耐药细胞的3.5～6倍，1986年，Gerald等发现在人乳腺癌耐药细胞中存在谷胱甘肽-巯基转移酶的高表达。
TOPO-Ⅱ[5-6]DNA拓扑异构酶Ⅱ是许多抗癌药物的靶酶，耐药细胞通过不同环节调节其酶的表达量及活性，维持耐药表型。TOPO-Ⅱ是一种核酸酶，它的作用是影响细胞DNA的合成，它可以促进肿瘤细胞DNA松弛、解旋、断裂和重接，它的高表达使肿瘤细胞复制加快，增加肿瘤的恶性程度。
nm23[7-12]肿瘤转移抑制基因是1988年由美国国家癌症研究院的Steeg等首先发现的，它在人类肿瘤如肾癌，肺癌，结肠癌等的组织中的表达与预后或淋巴结转移有密切关系，目前被认为是肿瘤转移抑制基因的最佳代表。Bevilacqua等研究显示，具有高度转移性的人乳腺癌伴有低水平的nm23的表达，由此认为nm23基因表达与肿瘤转移潜能呈负相关，这一理论被以后的实验相继证实。在骨肉瘤中，学者们却有相反的发现，1995年Oda等应用免疫组织化学方法研究了41例骨肉瘤和22例骨软骨瘤的nm23表达时发现nm23的表达与骨肉瘤的转移潜能并没有相关关系。
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CD44[13]是分布极广的细胞表面跨膜蛋白，它既是细胞表面的黏附分子同时又充当表面受体的作用，研究表明：它与某些腺癌转移有密切关系。1996年Jamal在研究CD44v基因表达时发现CD44在成骨细胞，骨细胞以及体外培养的骨肉瘤细胞中均有表达，然而表达的类型仅为CD44s，而不是与转移有关的CD44v。我们的研究发现：上述五种基因蛋白在骨肉瘤的阳性表达率均明显高于软骨肉瘤，众所周知，骨肉瘤的恶性程度要高于软骨肉瘤，因此，我们认为P-170，GST，TOPO-Ⅱ，CD44，nm23的高表达与骨肉瘤的恶性度有关。进一步分析发现，P-170，GST，TOPO-Ⅱ表达阳性率越高，病人的生存时间越短，原因在于P-170，GST，TOPO-Ⅱ的联合表达显示，肿瘤细胞既存在典型的多药耐药又存在非典型多药耐药，耐药的发生导致在骨肉瘤治疗中起重要作用的化疗的失败，从而严重影响了骨肉瘤患者的生存率。另外，从五种基因表达与年龄的关系看，年龄小于20岁的骨肉瘤患者组，P-170，TOPO-Ⅱ，CD44的阳性率均高于年龄大于20岁组，而nm23在小于20岁组的阳性率却低于大于20岁组，GST的表达率在两组无差异。骨肉瘤的恶性程度与年龄有关，年龄越小，恶性程度越高，P-170，TOPO-Ⅱ，CD44的阳性率高于高年龄组，这从另一角度显示三者与骨肉瘤恶性度有关。理论上认为化疗后P-170，TOPO-Ⅱ，GST均应高于化疗前，但此研究中仅P-170蛋白的表达率高于化疗前，而TOPO-Ⅱ GST 在术前化疗组的表达却低于术前无化疗组。这表明骨肉瘤发生多药耐药常常以典型多药耐药出现。
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因此，临床上可以联合P-170，GST，TOPO-Ⅱ，nm23，CD44特别是P-170，GST，TOPO-Ⅱ的表达情况来判断骨肉瘤恶性程度及对预后进行评估，在指导治疗，例如化疗方案的设计等方面，联合检测具有重要的临床指导意义。
基金项目：吉林省科委基金资助项目(970329)
作者简介：谷贵山(1965-)，男，吉林省人，博士，副教授。从事骨科、骨肿瘤专业。
参考文献
1，Norbert K,Deanna FP,Grace B,et al.Detection of P-170 in multidrug-resistant cell lines by monoclonal antibodies.Nature,1985,316:82-823
2，Brian LS,Judith LM,Marvin BC,et al.Increased gluathione peroxidase activity in a human sarcoma cell line with inherent doxorubicin resistance.Canser Res.1991,Jan,15,51,521-527
, 百拇医药
3，Gerald B,Anil T,Birandra K,et al.Overexpression of a novel anionic glutathione transferase in multidrug-resistant human breast cancer cells.J Biological Chem.,1986,261(33)15544-15549
4，Yoshi S,Masayuki N,Mayumi O,et al.Increased expression of glutathione S-transferase gene in cis-diamminedichloroplatinum(Ⅱ)-resistant variants of a Chinese hamster ovary cell line.Cancer Res.1989,49,7020-7025
5，Fred H,Drake,Joseph P, et al.Purification of topoisomerase Ⅱ from amsacrine-resistant P388 leucemia cells.J Bio Chem,1987,April 17:16739-16747
, 百拇医药
6，David A,Gewirtz.Dose bulk damage to DNA explain the cytostatic and cytotoxic effects of topoisomerase Ⅱ inhibitors.Biochem Phar,1991,42(12):2253-2258
7，Masake Mandai, Ikuo Knish, Koshiyama, et al.Altered expression of nm23-H1 and c-erB-2 proteins have prognostic significance in adenocarcinoma but not in squamous cell carcinoma of the uterine cervix.Cancer,1995,75:2523-2529
8，Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential.J Natl Inst,1988,80:200-204
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9，Bevilacqua G,Sobel ME,Rosengard AM,et al.Association of low nm23 RNA levels in human primary infiltrating ductal breast carcinomna with lymph node involvement and other histopathological indicators of high metastatic potential.Cancer Res,1989,49:5185-5190
10，Florenes VA,Aamdal S,Myklebost O,et al.Levels of nm23 messenger RNA in metastatic malignant melanomas:inverse correlation to disease progression.Cancer Res,1992,52:6088-6091
, 百拇医药
11，Philippe B,Abel DL,Steeg PS,et al.nm23 protein in neoplastic and nonneoplastic thyroid tissues. Am J Pathol,1994,145:26-32
12，Oda Y,Walter H,Radig K,et al.Immunohistochemical analysis of nm23 protein expression in malignant bone tumor.J Cancer Res Clin Oncol,1995,121:667-673
13，Robert A,Karin W,Martin H,et al.Participation in normal immune response of a metastasis-inducing splice variant of CD44.Science 1992,257,(31)682-685
收稿日期：1999-5-31, http://www.100md.com
单位：谷贵山(白求恩医科大学第一临床学院骨科 长春 130021)；徐莘香(白求恩医科大学第一临床学院骨科 长春 130021)
关键词：骨肉瘤；基因；免疫组化
P 〔摘要〕 目的 探讨P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤的表达及其与预后的关系。方法 15例骨肉瘤和5例软骨肉瘤石蜡切片，应用S-P免疫组化染色，结合临床资料进行分析。结果 15例骨肉瘤P-170的阳性率为33.33%，GST的阳性率为80%，TOPO-Ⅱ的阳性率为46.67%，nm23和CD44的阳性率分别为93.33%、86.67%。年龄小于20岁的骨肉瘤患者组，P-170、TOPO-Ⅱ、CD44的阳性率均高于年龄大于20岁组，而nm23在小于20岁组的阳性率却低于大于20岁组(P<0.05)。GST的表达率在两组无差异。术前化疗组P-170 CD44 nm23的阳性率高于术前无化疗组，而TOPO-Ⅱ GST在术前化疗组的表达却低于术前无化疗组(P<0.05)。存活在2年以内者P-170，GST，TOPO-Ⅱ的阳性率比存活两年以上者高，而nm23、CD44的表达情况正相反(P<0.05)。P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤的表达率均高于软骨肉瘤(P<0.05)。结论 P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤的表达率明显高于软骨肉瘤。在骨肉瘤中P-170、GST、TOPO-Ⅱ联合表达率越高，病人生存期越短。在临床上可联合检测，以此对骨肉瘤的恶性程度及预后进行评估。
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〔中图分类号〕 R738.1 〔文献标识码〕B
Expression of P-170,GST,TOPO-Ⅱ,nm23,CD44 in osteosarcoma and its correlation with prognosis
GU Gui-shan,XU Xin-xiang
(Department of Orthopeadics,First Clinical College of Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021)
〔Abstract〕 Objective The expression of P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44 in osteosarcoma was analyzed for approaching the relationship between the expression of the above 5 proteins and prognosis.Methods 18cases of human osteosarcoma and 5 cases of chondrosarcoma were studied by the methods of immunohistochemical assay.Results In osteosarcoma the positive rate was 33.3% for P-170,80% for GST and 46.67% for TOPO-Ⅱ、 93.33% for nm23,and 86.67% for CD44.But in chondrosarcoma the positive rate of P-170 was 0, of GST was 20%,of TOPO-Ⅱ was 20%,of CD44 and nm23 was 20% and 0 respectively.The positive rates of P-170,TOPO-Ⅱ and CD44 in the group with the age of less than 20 were higher than those in the group of older than 20.P-170,CD44,nm23 more highly expressed in the group of preoperative chemotherapy than in the group of no-preoperative chemotherapy.The patients survived for no more than 2 years had higher expressions of P-170、GST、TOPO-Ⅱ.Conclusions Detection of P-170,GST,TOPO-Ⅱ,nm23 and CD44 together can evaluate the malignance and prognosis of osteosarcoma,which should be used in clinic to instruct the treatment of osteosarcom.
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〔Key words〕 osteosarcoma; gene; immunohistochemistry
影响骨肉瘤预后的因素众多，这些因素既独立影响又相互关联，以单因素指标预测预后，往往造成较大的偏差。经多年研究，学者们认为影响骨肉瘤预后的根本原因在于：肿瘤细胞的增殖能力，转移能力以及对化疗药物的耐药能力。本文根据骨肉瘤相关基因的不同特性，选择与转移及多药耐有关的nm23、CD44、P-170、GST、TOPO-Ⅱ基因，应用免疫组化方法检测五种蛋白在骨肉瘤的表达，旨在寻找合理搭配的骨肉瘤预后标志物并评价其可靠性。
材料与方法
一、标本来源 本次实验共选用15例骨肉瘤，其中包括骨母细胞性6例，纤维母细胞性5例，软骨母细胞性4例，和5例软骨肉瘤标本，均取自我院病理科，并经病理专家重新进行诊断，所有标本均为手术后经10%福尔马林固定，石蜡包埋后切片。行5um连续切片六张，分别进行HE染色，P-170、GST、TOPO-Ⅱ nm23、CD44染色。
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二、临床资料 15例骨肉瘤患者，男7例，女8例。年龄：11～67岁。股骨下端8例，胫骨上端5例，肱骨上端、肋骨各1例。术前化疗7例，术后化疗11例。术前术后均行化疗5例，存活不足两年者10例，两年以上者5例。
三、主要试剂 P-170、GST、TOPO-Ⅱ nm23、CD44基因蛋白，S-P免疫组化、二氨基联苯胺(DBA)显色试剂盒均购于福州Maxim生物技术开发公司。
四、免疫组织化学染色 石蜡切片脱蜡，水化，PBS(PH7.4)冲洗。过氧化酶(试剂A)阻断15分钟，室温下10%山羊血清(试剂B)封闭非特异性背景15分钟， 加入一抗(P-170、 GST、TOPO-Ⅱ nm23、CD44单克隆抗体)，4℃冰箱过夜。取出后PBS冲洗，加入生物素标记的二抗(试剂C)，室温孵育30分钟，PBS(PH7.4)冲洗。链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶溶液(试剂D)室温孵育30分钟，PBS(PH7.4)冲洗，DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，中性树胶封片。
, 百拇医药
五、结果判定 判定标准：阴性(-)无着色细胞或与背景一致；阳性(+)着色细胞均呈棕黄色。
六、统计学分析：采用X2检验
结果
15例骨肉瘤P-170的阳性率为33.33%，GST的阳性率为80%，TOPO-Ⅱ的阳性率为46.67%， nm23和CD44的阳性率分别为93.33%，86.67%。根据年龄、化疗情况、存活时间进行分组(见表1，2，3，4)。
表1 骨肉瘤P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表达与年龄的关系
基因蛋白
年龄小于20岁
(10例)
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阳性率(%)
年龄大于20岁
(5例)
阳性率(%)
P-170
50%(5/10)
0%(0/5)
GST
80%(8/10)
80%(4/5)
TOPO-Ⅱ
50%(5/10)
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40%(2/5)
CD44
100%(10/10)
60%(3/5)
nm23
90%(9/10)
100%(5/5)
表2 骨肉瘤P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表达与化疗的关系
基因蛋白
术前化疗组
(7例)
, http://www.100md.com 阳性率(%)
术前无化疗组
(8例)
阳性率(%)
P-170
57.1%(4/7)
12.5%(1/8)
GST
71.43%(5/7)
87.5%(7/8)
TOPO-Ⅱ
42.86%(3/7)
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50%(4/8)
CD44
100%(7/7)
75%(6/8)
nm23
100%(7/7)
87.5%(7/8)
表3 骨肉瘤P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表达与存活的关系
基因蛋白
存活2年以内组
(10例)
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阳性率(%)
存活2年以上组
(含2年，5例)
阳性率(%)
P-170
40%(4/10)
20%(1/5)
GST
90%(9/10)
80%(4/5)
TOPO-Ⅱ
50%(5/10)
, 百拇医药
40%(2/5)
CD44
80%(8/10)
100%(5/5)
nm23
90%(9/10)
100%(5/5)
表4 P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤及软骨肉瘤的表达
基因蛋白
骨肉瘤
(15例)
, 百拇医药 阳性率(%)
软骨肉瘤
(5例)
阳性率(%)
P-170
33.33%(5/15)
0%(0/5)
GST
80%(12/15)
20%(1/5)
TOPO-Ⅱ
46.67%(6/15)
, 百拇医药
0%(0/5)
CD44
86.67%(13/15)
0%(0/5)
nm23
93.33%(14/15)
20%(1/5)
年龄小于20岁的骨肉瘤患者组，P-170 TOPO-Ⅱ CD44的阳性率均高于年龄大于20岁组，而nm23在小于20岁组的阳性率却低于大于20岁组(P<0.05)，GST的表达率在两组无差异。
术前化疗组P-170 CD44 nm23的阳性率高于术前无化疗组，而TOPO-Ⅱ、GST在术前化疗组的表达却低于术前无化疗组(P<0.05)。
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存活在2年以内者P-170，GST，TOPO-Ⅱ的阳性率比存活两年以上者高，而nm23，CD44的表达情况正相反(P<0.05)。
P-170，GST，TOPO-Ⅱ，nm23，CD44在骨肉瘤的表达率均高于软骨肉瘤(P<0.05)。
讨论
肿瘤细胞的增殖能力、转移能力、及对化疗药物的敏感性是影响骨肉瘤预后的根本原因。这些因素既独立又相互关联。因此，选择综合指标来判断预后显得非常重要。P-170蛋白[1](P-glycoprotein P-gp)是多药耐药基因(MDR1)的表达产物，是一种膜糖蛋白，分子量为170KD，它与某些细菌转运蛋白具有同源基因序列。它是一种ATP依赖的药物外流泵，P-糖蛋白的增加会导致细胞内化疗药物总量的减少，从而阻碍化疗药物的肿瘤细胞杀伤作用，影响化疗的疗效，是肿瘤细胞产生典型多药耐药的主要原因。人体多种器官的正常细胞，例如：肾上腺、肾脏、肝脏、结肠等都有较高的P-170蛋白的表达，在这些组织发生的肿瘤例如：嗜铬细胞瘤、结肠癌、肾细胞癌等也有相应的高表达。1993年，Ulrike stein等应用Northern杂交及免疫组化技术对29例骨组织和32例软组织肿瘤进行研究发现：69%表现为MDR1及P-170的阳性表达，这其中骨肉瘤为高表达，其表达率高达90%，恶纤组为低表达，其余均为中等程度表达。
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GST[2-4]即谷胱甘肽-巯基转移酶，包括谷胱甘肽-巯基转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶，是人体正常代谢所需的酶，谷胱甘肽和谷胱甘肽代谢酶的增加，使肿瘤细胞的解毒能力增加，严重影响了化疗药物对肿瘤的杀伤作用，是骨肉瘤产生多药耐药的另一主要原因，1991年，Brian等研究发现在对阿霉素耐药的人骨与软组织肉瘤细胞株细胞内，谷胱甘肽过氧化物酶活性明显增高，超出非耐药细胞的3.5～6倍，1986年，Gerald等发现在人乳腺癌耐药细胞中存在谷胱甘肽-巯基转移酶的高表达。
TOPO-Ⅱ[5-6]DNA拓扑异构酶Ⅱ是许多抗癌药物的靶酶，耐药细胞通过不同环节调节其酶的表达量及活性，维持耐药表型。TOPO-Ⅱ是一种核酸酶，它的作用是影响细胞DNA的合成，它可以促进肿瘤细胞DNA松弛、解旋、断裂和重接，它的高表达使肿瘤细胞复制加快，增加肿瘤的恶性程度。
nm23[7-12]肿瘤转移抑制基因是1988年由美国国家癌症研究院的Steeg等首先发现的，它在人类肿瘤如肾癌，肺癌，结肠癌等的组织中的表达与预后或淋巴结转移有密切关系，目前被认为是肿瘤转移抑制基因的最佳代表。Bevilacqua等研究显示，具有高度转移性的人乳腺癌伴有低水平的nm23的表达，由此认为nm23基因表达与肿瘤转移潜能呈负相关，这一理论被以后的实验相继证实。在骨肉瘤中，学者们却有相反的发现，1995年Oda等应用免疫组织化学方法研究了41例骨肉瘤和22例骨软骨瘤的nm23表达时发现nm23的表达与骨肉瘤的转移潜能并没有相关关系。
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CD44[13]是分布极广的细胞表面跨膜蛋白，它既是细胞表面的黏附分子同时又充当表面受体的作用，研究表明：它与某些腺癌转移有密切关系。1996年Jamal在研究CD44v基因表达时发现CD44在成骨细胞，骨细胞以及体外培养的骨肉瘤细胞中均有表达，然而表达的类型仅为CD44s，而不是与转移有关的CD44v。我们的研究发现：上述五种基因蛋白在骨肉瘤的阳性表达率均明显高于软骨肉瘤，众所周知，骨肉瘤的恶性程度要高于软骨肉瘤，因此，我们认为P-170，GST，TOPO-Ⅱ，CD44，nm23的高表达与骨肉瘤的恶性度有关。进一步分析发现，P-170，GST，TOPO-Ⅱ表达阳性率越高，病人的生存时间越短，原因在于P-170，GST，TOPO-Ⅱ的联合表达显示，肿瘤细胞既存在典型的多药耐药又存在非典型多药耐药，耐药的发生导致在骨肉瘤治疗中起重要作用的化疗的失败，从而严重影响了骨肉瘤患者的生存率。另外，从五种基因表达与年龄的关系看，年龄小于20岁的骨肉瘤患者组，P-170，TOPO-Ⅱ，CD44的阳性率均高于年龄大于20岁组，而nm23在小于20岁组的阳性率却低于大于20岁组，GST的表达率在两组无差异。骨肉瘤的恶性程度与年龄有关，年龄越小，恶性程度越高，P-170，TOPO-Ⅱ，CD44的阳性率高于高年龄组，这从另一角度显示三者与骨肉瘤恶性度有关。理论上认为化疗后P-170，TOPO-Ⅱ，GST均应高于化疗前，但此研究中仅P-170蛋白的表达率高于化疗前，而TOPO-Ⅱ GST 在术前化疗组的表达却低于术前无化疗组。这表明骨肉瘤发生多药耐药常常以典型多药耐药出现。
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因此，临床上可以联合P-170，GST，TOPO-Ⅱ，nm23，CD44特别是P-170，GST，TOPO-Ⅱ的表达情况来判断骨肉瘤恶性程度及对预后进行评估，在指导治疗，例如化疗方案的设计等方面，联合检测具有重要的临床指导意义。
基金项目：吉林省科委基金资助项目(970329)
作者简介：谷贵山(1965-)，男，吉林省人，博士，副教授。从事骨科、骨肿瘤专业。
参考文献
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收稿日期：1999-5-31, http://www.100md.com