D-2-氨基戊酸对创伤性神经元细胞内游离钙及游离氢的影响
作者：张相彤 刘恩重 石长滨 陈庆文 武俏丽 戴钦舜
单位：哈尔滨医科大学第一附属医院神经外科，150001
关键词：压冲击性脑损伤；游离钙；游离氢；D-2-氨基戊酸
中国急救医学000502 [摘 要] 目的 研究液压冲击伤时体外培养的大鼠神经元细胞内游离钙([Ca2+]i)及游离氢([H+]i)的变化，探讨D-2-氨基戊酸(D-AP-5)对创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及[H+]i的影响及其机制。方法 以Fluo-3/AM和BCECF/AM分别为细胞内钙离子和氢离子的荧光指示剂，用激光共聚焦显微镜测定液压冲击伤时体外培养的神经元细胞内[Ca2+]i及[H+]i的变化。结果 液压冲击伤后神经细胞内游离钙和游离氢迅速升高，伤后仅15分钟，[Ca2+]i即达324.197±38.606 nmol(P<0.01)，[H+]i pH值达7.04±0.033(P<0.01)，[Ca2+]i于伤后24小时达高峰(2 664.17±155.09 nmol)，[H+]i于伤后12 h达高峰(pH值6.016±0.196)，随后逐渐下降，48 h仍维持较高水平(P<0.01)。D-AP-5可明显降低创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及[H+]i升高。伤后22 h以内给药明显降低创伤后细胞内游离钙的升高(P<0.01)，而伤后10 h之内应用可明显降低创伤后细胞内游离氢的升高(P<0.01)，伤后22小时以上应用则无效(P>0.05)。结论 创伤后神经元细胞出现钙超载和酸中毒。D-AP-5可降低创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及[H+]i升高，但D-AP-5应用的有效时间窗不同。揭示对创伤性脑损伤的治疗应强调D-AP-5应用的最佳时间窗。
, 百拇医药
[中图分类号] R 361.3；R 651.15 [文献标识码] A
[文章编号] 1002-1949(2000)05-0260-03
Effect of D-2-amin-5-phosponovaleric acid on [Ca2+]i and [H+]i in cultured neuron following fluid percussing injury
ZHANG Xiang-tong LIU En-zhong SHI Chang-bin et al
(Department of Neurosurgery ,the First Hospital of Harbin Medical University ,Harbin 150001,China)
, 百拇医药
[Abstract] Objective To investigate alteration in [Ca2+]i and [H+]i in wistar rat's neural cell following fluid percussing injury (FPI)and effect of D-2-amino-5-phospgonivaleric acid (D-AP-5)on neuronal [Ca2+]i and [H+]i following trauma.Methods Alteration in [Ca2+]i and [H+]i in wistar rat's neural cell following FPI was measured by means of a confocal laser scanning microscope using Fluo-3/AM and BCECF/AM as a calcium and hydrogen indicator resoectively.Results [Ca2+]i and [H+]i in neural cell subjected to FPI increased acutely (P<0.01)，came up to peak value (2664.17 nmol±155.09 nmol,pH value 6.016±0.196) at 24 h and 12 h postinjury respectively.afterwards decreased gradually, and still maintained higher level at 48 h postinjury. D-AP-5 decresed [Ca2+]i and [H+]i in neuronal cell following trauma .D-AP-5 decreased [Ca2+]i in neuronal cell following FPI within 22 h postinjury (P<0.01) ，decreased [H+]i in neuronal cell following FPI within 10 h postinjury (P<0.01)，application of D-AP-5 was not valuable after 22h postinjury .Conclusions Excessive intracellular calcium accumulation and intracellular acidosis was found following FPI.D-AP-5 reduced calcium influx and intracellular acidosis,which have different windows of time following FPI.The result disclose that optimal time windows of D-AP-5 is emphasixed in therapy of traumatic brain injury.
, 百拇医药
[Key words] Fluid percussion brain injury; Calcium iron; Hydrogen iron; D-2-amino-5-phosphonovaleric acid
脑创伤是当今青少年致死致残的重要原因之一。脑创伤后神经组织损伤除原发机械损伤外，其所继发的病理损害更为引人注目，这些继发的病理损害与脑创伤后神经生化反应密切相关，其中包括细胞内钙超载和酸中毒[1]。了解创伤后神经元细胞内钙超载及酸中毒的形成机制，对创伤预后改善有着重要意义。本实验着重研究D-2-氨基戊酸(D-AP-5)对创伤后神经元细胞内游离钙[Ca2+]i及游离氢[H+]i的影响，并分析其可能作用机制，从而为临床合理应用提供可靠的理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 取新生Wistar大鼠大脑皮层组织，分散成单细胞悬液后接种于50 ml培养瓶中的预先洗涤有多聚赖氨酸(sigma)的盖玻片上，送入含5%CO2培养箱(Heraeus)37℃培养，培养液为含10%胎牛血清(Hyclone)的RPMI-1640。经8～14天的原代培养后进行实验研究。神经元烯醇化酶(NSE)免疫组化染色显示40%阳性，胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色显示60%阳性。
, 百拇医药
1.2 液压冲击伤实验 液压冲击伤装置参见Scott's模型[2]，冲击压力为2.5 kPa，作用时间为20～30 ms。
1.3 实验分组 创伤组：对照组(uninjury)，创伤15 min、30 min、1 h、6 h、12 h、24h和48 h组。治疗组：神经元细胞分别于伤后15 min、30 min、1 h、4 h、10 h和22 h给予10 μg/ml，D-AP-5(sigma)观察2 h后对细胞内[Ca2+]i及 [H+]i的影响。
1.4 神经元细胞内[Ca2+]i及 [H+]i的测定
1.4.1 细胞内[Ca2+]i的测定
, 百拇医药
在盖玻片上培养的神经细胞，经磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次后，于37℃条件下用Fluo-3/AM(终浓度10 μm，美国Bio-Rad公司)负载45 min。盖玻片倒置密封小室上，用Insight-PlusIQ型激光共聚焦显微镜(美国Meridian公司)488 nm氩激光激发而产生荧光，测定其荧光强度。[Ca2+]i标定公式[Ca2+]i＝Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]。按参考文献[3]，式中Kd为400 nmol，F为测量的相对荧光值，Fmax为加入10 μmol 4-Br-A23187的高钙液(10 mmol/L K2CaEGTA, 10 mmol/L K-mops,100 mmol/L KCl，美国Bio-Rad公司)后所得最大荧光值，Fmin为加入10 μmol 4-Br-A23187的无钙液(10 mmol/L K2H2EGTA,10 mmol/LK-mops,100 mmol/L KCl)后获得最小荧光值。
, 百拇医药
1.4.2 细胞内[H+]i的测定[4]
在盖玻片上培养的神经元细胞，经磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次后，于37℃条件下用BCECF/AM(终浓度0.25 μmol/L)负载12 min。盖玻片倒置密封小室上，用Insight-plusIQ激光共聚焦显微镜488 nm氩离子激光激发，记录530/640 nm发射荧光，求二者之比。根据标准曲线求出细胞内pH值。
直接标定细胞内pH值求标准曲线：制作高钾缓冲液，其成份为(mmol/L)：KCl 120，NaCl 5，CaCl2 1，MgSO4 1，Hepes 10。缓冲液中加入尼日利亚菌素(nigericin)30 μmmol/L和BCECF/AM 0.25 μmmol/L，pH值调至不同值(5.5～7.5)，孵育细胞12 min(37℃)测量细胞内BCECF的530/640 nm激发荧光比值，求出该比值与pH的标准曲线。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 实验结果均采用微机SAS软件系统处理，以均值±标准差表示，组间采用双样本异方差t检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及 [H+]i的变化
脑创伤后与正常对照组(96.745 ±21.248 nmol)比较，伤后仅15 min，神经元胞浆内[Ca2+]i即已显著升高达324.197±38.606 nmol(P<0.01)，为对照组近4倍，伤后24 h达高峰(2 664.17±155.09 nmol)，为对照组25～27倍，48 h仍维持较高水平。
脑创伤后与正常对照组(pH值7.141±0.081)相比较，伤后15 min细胞内[H+]i即已升高(P<0.01)，随后逐渐升高，于伤后12 h达高峰(pH值6.016±0.196)，随后[H+]i逐渐下降，48 h仍维持较高水平(P<0.01)，见表1。
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表1 液压冲击损伤后神经元在不同时程[Ca2+]i及 [H+]i的变化 组 别
细胞数/培养
Ca2+(nmol)
H+(pH值)
control
18/3
96.745±21.248
7.141±0.081
15 min
17/5
, 百拇医药
324.197±38.606★
7.04±0.033★
30 min
15/4
348.667±46.8★▲
6.724±0.062★▲
1 h
16/4
346.622±36.242★△
6.689±0.047★▲
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3 h
13/5
352.519±28.115★▲
6.572±0.032★△
6 h
15/5
530.022±78.785★▲
6.535±0.032★▲
12 h
14/3
1888.08±123.64★▲
, 百拇医药
6.016±0.196★▲
24 h
15/4
2664.17±155.09★▲
6.724±0.072★▲
48 h
20/5
411.29±52.456★▲
6.871±0.039★▲
神经元损伤组与其正常组对照组相比较★：P<0.01
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相邻神经元损伤组之间相比较▲：P<0.01，△：P>0.05
2.2 D-AP-5对创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及 [H+]i变化的影响
D-AP-5可明显降低创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及 [H+]i升高。伤后22 h以内给药明显降低创伤后细胞内游离钙的升高(P<0.01)，而伤后10 h之内应用可明显降低创伤后细胞内游离氢的升高(P<0.01)，伤后22小时以上应用则无效(P<0.05)，见表2。
表2 D-AP-5对创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及 [H+]i变化的影响 组别
, 百拇医药
细胞数
/培养
Ca2+(nmol)
H+(pH值)
创伤对照组
治疗组
创伤对照组
治疗组
uninjury
18/3
96.745±21.28
102.36±10.38
, 百拇医药
7.141±0.081
7.162±0.053
2.15 h
16/4
283.83±25.42
203.85±30.66＃
6.596±0.035
6.689±0.068＃
2.30 h
20/4
409.04±76.38
, 百拇医药
182.86±47.08＃
6.596±0.032
6.793±0.086＃
3 h
13/5
352.52±28.12
89.73±15.44＃
6.573±0.032
6.79±0.057＃
6 h
15/5
, 百拇医药
530.02±78.79
78.56±10.25＃
6.535±0.032
6.726±0.091＃
12 h
14/3
1888.08±123.64
66.09±13.06＃
6.016±0.197
6.358±0.192＃
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24 h
15/4
2664.17±155.09
131.29±25.39＃
6.724±0.072
6.709±0.028※
治疗组与创伤对照组相比较＃：P<0.01 ※：P>0.05
3 讨论
Ca2+是神经细胞信息传递及神经递质合成与释放重要的细胞内第二信使[4]。正常生理状态下，神经细胞内外存在很大的Ca2+浓度梯度差，因此，直接检测细胞内游离[Ca2+]i是深入探讨脑创伤时神经生化变化的重要方面。本实验初次采用细胞内Ca2+荧光探针Fluo-3/AM直接检测脑外伤不同时间神经元细胞胞浆中游离[Ca2+]i水平变化，发现脑创伤后神经元细胞存在Ca2+严重超载。伤后15 min显著升高，24 h达高峰，以后逐渐下降，48 h仍维持较高水平。这种脑创伤后神经元胞体游离[Ca2+]i升高的原因尚未完全明确，可能与以下4方面有关：①脑创伤后1～2分钟受伤的神经元细胞出现大量K+外流[5]，其结果导致细胞膜的去极化，使胞膜电压依赖性Ca2+通道开放，大量胞外Ca2+内流。②创伤后神经元细胞K+外流可使细胞无氧糖酵解增加，从而使ATP分解增加而合成减少[6]，引起细胞内ATP缺乏，导致细胞膜上Ca2+-ATPase活性抑制，细胞内Ca2+外排减少。③创伤后神经元细胞膜去极化及ATP缺乏，使间接依赖Na+-K+ATPase的Ca2+-Na+交换泵出现反相交换[7]，使大量Ca2+内流。④脑创伤神经元细胞膜去极化导致大量兴奋氨基酸释放，从而使NMDA受体激活，引起Ca2+、Na+、Cl-的内流[8]。NMDA受体激活同样还可激活磷酯酶C(PLC)，从而分解膜磷酯形成IP3和DAG，IP3作为第三信使可使内质网内Ca2+释放入胞浆内[9]。由于上述4方面因素，细胞外Ca2+进入细胞内增多，而胞内Ca2+外排减少，从而导致神经细胞Ca2+超载。受体耦联钙通道拮抗剂D-AP-5主要与兴奋氨基酸竞争NMDA受体，从而使激活的NMDA受体数目减少，从而减少Ca2+内流[10]。实验研究表明D-AP-5与伤后22小时内应用均有效，尤其在伤后1～10 h应用最佳，这说明伤后1小时以内可能以电压依赖性钙通道内流为主，而伤后1～10小时，NMDA受体激活而致Ca2+内流可能起主导作用。
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酸中毒是颅脑创伤继发性病理损害过程的另一个重要方面。本实验初次采用细胞内H+荧光探针BCECF/AM直接检测脑创伤后不同时间单个神经元细胞胞浆中游离[H+]i水平变化，发现脑创伤后神经元细胞存在酸中毒。伤后15 min细胞内[H+]i即已升高，随后逐渐升高，并于12 h达高峰，以后逐渐下降，48 h仍维持较高水平。这种脑创伤后神经元胞体游离[H+]i升高的原因尚未完全明确，可能与以下2方面有关：①脑创伤后神经元细胞内K+大量外流，从而导致细胞膜去极化，而这种去极化又可诱导兴奋氨基酸(EAA)的释放，而进一步促进K+外流，同时Ca2+、Na+、Cl-、H+内流，这样在离子跨膜异常与EAA释放之间形成一种恶性循环。神经元细胞为了维持细胞内外正常离子平衡，这种异常跨膜离子障碍激活能量依赖性离子泵及刺激ATP水解增加[11]，最终使糖酵解增强，结果导致乳酸堆积，细胞内酸中毒形成。②脑创伤后r-氨基丁酸(GABA)释放可激活Cl通道，从而使HCO3-外流；同时谷氨酸释放激活NMDA(N-甲基-D-天门氡氨酸)受体，从而H+内流，这样形成细胞外液暂短碱性化[12]，这种细胞外液暂短碱性化、细胞内H+升高及膜去极化均可激活Na+/H+交换泵。此外，脑创伤后与EAA受体耦联的蛋白激酶C(PKC)也可被激活，从而使Na+/H+交换泵磷酸化而激活[13]，Na+/H+交换泵间接依赖Na+/K+ATPase，而Na+/K+泵直接依赖于Na+/K+ATPase，这样ATP大量消耗，一方面ATP消耗过程中产生H+，另一方面刺激无氧糖酵解增强，从而满足ATP的消耗，最终产生乳酸堆积，细胞内酸中毒[14]。本实验采用NMDA受体竞争性拮抗剂D-AP-5，于创伤后10 h之内应用有效，4 h之内应用最佳，22 h以上应用则无效。这说明EAA释放主要在伤后10 h之内，而10 h以上一方面由于EAA释放减少，另一方面由于其它生化级联反应(如花生四烯酸等)形成有机酸增多，并且细胞内Ca2+超载、自由基形成、酸中毒等之间相互影响，最终使创伤后期酸中毒形成不单一局限于EAA受体所介导的离子紊乱这一原因。
, 百拇医药
创伤后神经元细胞内游离钙升高与酸中毒之间相互影响，互为因果。[H+]i可与[Ca2+]i竞争细胞内蛋白质结合位点，从而引起[Ca2+]i水平升高。此外在酸中毒环境，Ca2+-ATPase依赖性的Na+/Ca2+泵出现反相交换，从而导致[Ca2+]i升高[15]。而[Ca2+]i的升高一方面引起线粒体呼吸链电子传递障碍，导致ATP生成减少，刺激乳酸形成[16]，另一方面Ca2+激活磷脂酶C、A，进而促使膜磷脂分解，导致大量有机酸和自由基形成，进一步增加[H+]i。
上述实验说明，D-AP-5通过与兴奋氨基酸竞争NMDA受体，使激活的NMDA受体数目减少，从而减少了Ca2+内流及减轻跨膜离子障碍，进而抑制创伤后神经元细胞Ca2+超载和酸中毒，且有效治疗时间窗不同，提示临床上对创伤性颅脑损伤的治疗，应选定D-AP-5作用的最佳时间窗。本实验是在细胞水平上的创伤研究，至于整体水平效果如何，还有待于进一步研究。
, 百拇医药
[基金来源] 黑龙江省科委科技计划项目资助(NO.G98C19-13)
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收稿：1999-04-10
修回：1999-11-25
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单位：哈尔滨医科大学第一附属医院神经外科，150001
关键词：压冲击性脑损伤；游离钙；游离氢；D-2-氨基戊酸
中国急救医学000502 [摘 要] 目的 研究液压冲击伤时体外培养的大鼠神经元细胞内游离钙([Ca2+]i)及游离氢([H+]i)的变化，探讨D-2-氨基戊酸(D-AP-5)对创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及[H+]i的影响及其机制。方法 以Fluo-3/AM和BCECF/AM分别为细胞内钙离子和氢离子的荧光指示剂，用激光共聚焦显微镜测定液压冲击伤时体外培养的神经元细胞内[Ca2+]i及[H+]i的变化。结果 液压冲击伤后神经细胞内游离钙和游离氢迅速升高，伤后仅15分钟，[Ca2+]i即达324.197±38.606 nmol(P<0.01)，[H+]i pH值达7.04±0.033(P<0.01)，[Ca2+]i于伤后24小时达高峰(2 664.17±155.09 nmol)，[H+]i于伤后12 h达高峰(pH值6.016±0.196)，随后逐渐下降，48 h仍维持较高水平(P<0.01)。D-AP-5可明显降低创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及[H+]i升高。伤后22 h以内给药明显降低创伤后细胞内游离钙的升高(P<0.01)，而伤后10 h之内应用可明显降低创伤后细胞内游离氢的升高(P<0.01)，伤后22小时以上应用则无效(P>0.05)。结论 创伤后神经元细胞出现钙超载和酸中毒。D-AP-5可降低创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及[H+]i升高，但D-AP-5应用的有效时间窗不同。揭示对创伤性脑损伤的治疗应强调D-AP-5应用的最佳时间窗。
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[中图分类号] R 361.3；R 651.15 [文献标识码] A
[文章编号] 1002-1949(2000)05-0260-03
Effect of D-2-amin-5-phosponovaleric acid on [Ca2+]i and [H+]i in cultured neuron following fluid percussing injury
ZHANG Xiang-tong LIU En-zhong SHI Chang-bin et al
(Department of Neurosurgery ,the First Hospital of Harbin Medical University ,Harbin 150001,China)
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[Abstract] Objective To investigate alteration in [Ca2+]i and [H+]i in wistar rat's neural cell following fluid percussing injury (FPI)and effect of D-2-amino-5-phospgonivaleric acid (D-AP-5)on neuronal [Ca2+]i and [H+]i following trauma.Methods Alteration in [Ca2+]i and [H+]i in wistar rat's neural cell following FPI was measured by means of a confocal laser scanning microscope using Fluo-3/AM and BCECF/AM as a calcium and hydrogen indicator resoectively.Results [Ca2+]i and [H+]i in neural cell subjected to FPI increased acutely (P<0.01)，came up to peak value (2664.17 nmol±155.09 nmol,pH value 6.016±0.196) at 24 h and 12 h postinjury respectively.afterwards decreased gradually, and still maintained higher level at 48 h postinjury. D-AP-5 decresed [Ca2+]i and [H+]i in neuronal cell following trauma .D-AP-5 decreased [Ca2+]i in neuronal cell following FPI within 22 h postinjury (P<0.01) ，decreased [H+]i in neuronal cell following FPI within 10 h postinjury (P<0.01)，application of D-AP-5 was not valuable after 22h postinjury .Conclusions Excessive intracellular calcium accumulation and intracellular acidosis was found following FPI.D-AP-5 reduced calcium influx and intracellular acidosis,which have different windows of time following FPI.The result disclose that optimal time windows of D-AP-5 is emphasixed in therapy of traumatic brain injury.
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[Key words] Fluid percussion brain injury; Calcium iron; Hydrogen iron; D-2-amino-5-phosphonovaleric acid
脑创伤是当今青少年致死致残的重要原因之一。脑创伤后神经组织损伤除原发机械损伤外，其所继发的病理损害更为引人注目，这些继发的病理损害与脑创伤后神经生化反应密切相关，其中包括细胞内钙超载和酸中毒[1]。了解创伤后神经元细胞内钙超载及酸中毒的形成机制，对创伤预后改善有着重要意义。本实验着重研究D-2-氨基戊酸(D-AP-5)对创伤后神经元细胞内游离钙[Ca2+]i及游离氢[H+]i的影响，并分析其可能作用机制，从而为临床合理应用提供可靠的理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 取新生Wistar大鼠大脑皮层组织，分散成单细胞悬液后接种于50 ml培养瓶中的预先洗涤有多聚赖氨酸(sigma)的盖玻片上，送入含5%CO2培养箱(Heraeus)37℃培养，培养液为含10%胎牛血清(Hyclone)的RPMI-1640。经8～14天的原代培养后进行实验研究。神经元烯醇化酶(NSE)免疫组化染色显示40%阳性，胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色显示60%阳性。
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1.2 液压冲击伤实验 液压冲击伤装置参见Scott's模型[2]，冲击压力为2.5 kPa，作用时间为20～30 ms。
1.3 实验分组 创伤组：对照组(uninjury)，创伤15 min、30 min、1 h、6 h、12 h、24h和48 h组。治疗组：神经元细胞分别于伤后15 min、30 min、1 h、4 h、10 h和22 h给予10 μg/ml，D-AP-5(sigma)观察2 h后对细胞内[Ca2+]i及 [H+]i的影响。
1.4 神经元细胞内[Ca2+]i及 [H+]i的测定
1.4.1 细胞内[Ca2+]i的测定
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在盖玻片上培养的神经细胞，经磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次后，于37℃条件下用Fluo-3/AM(终浓度10 μm，美国Bio-Rad公司)负载45 min。盖玻片倒置密封小室上，用Insight-PlusIQ型激光共聚焦显微镜(美国Meridian公司)488 nm氩激光激发而产生荧光，测定其荧光强度。[Ca2+]i标定公式[Ca2+]i＝Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]。按参考文献[3]，式中Kd为400 nmol，F为测量的相对荧光值，Fmax为加入10 μmol 4-Br-A23187的高钙液(10 mmol/L K2CaEGTA, 10 mmol/L K-mops,100 mmol/L KCl，美国Bio-Rad公司)后所得最大荧光值，Fmin为加入10 μmol 4-Br-A23187的无钙液(10 mmol/L K2H2EGTA,10 mmol/LK-mops,100 mmol/L KCl)后获得最小荧光值。
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1.4.2 细胞内[H+]i的测定[4]
在盖玻片上培养的神经元细胞，经磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次后，于37℃条件下用BCECF/AM(终浓度0.25 μmol/L)负载12 min。盖玻片倒置密封小室上，用Insight-plusIQ激光共聚焦显微镜488 nm氩离子激光激发，记录530/640 nm发射荧光，求二者之比。根据标准曲线求出细胞内pH值。
直接标定细胞内pH值求标准曲线：制作高钾缓冲液，其成份为(mmol/L)：KCl 120，NaCl 5，CaCl2 1，MgSO4 1，Hepes 10。缓冲液中加入尼日利亚菌素(nigericin)30 μmmol/L和BCECF/AM 0.25 μmmol/L，pH值调至不同值(5.5～7.5)，孵育细胞12 min(37℃)测量细胞内BCECF的530/640 nm激发荧光比值，求出该比值与pH的标准曲线。
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1.5 统计学处理 实验结果均采用微机SAS软件系统处理，以均值±标准差表示，组间采用双样本异方差t检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及 [H+]i的变化
脑创伤后与正常对照组(96.745 ±21.248 nmol)比较，伤后仅15 min，神经元胞浆内[Ca2+]i即已显著升高达324.197±38.606 nmol(P<0.01)，为对照组近4倍，伤后24 h达高峰(2 664.17±155.09 nmol)，为对照组25～27倍，48 h仍维持较高水平。
脑创伤后与正常对照组(pH值7.141±0.081)相比较，伤后15 min细胞内[H+]i即已升高(P<0.01)，随后逐渐升高，于伤后12 h达高峰(pH值6.016±0.196)，随后[H+]i逐渐下降，48 h仍维持较高水平(P<0.01)，见表1。
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表1 液压冲击损伤后神经元在不同时程[Ca2+]i及 [H+]i的变化 组 别
细胞数/培养
Ca2+(nmol)
H+(pH值)
control
18/3
96.745±21.248
7.141±0.081
15 min
17/5
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324.197±38.606★
7.04±0.033★
30 min
15/4
348.667±46.8★▲
6.724±0.062★▲
1 h
16/4
346.622±36.242★△
6.689±0.047★▲
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3 h
13/5
352.519±28.115★▲
6.572±0.032★△
6 h
15/5
530.022±78.785★▲
6.535±0.032★▲
12 h
14/3
1888.08±123.64★▲
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6.016±0.196★▲
24 h
15/4
2664.17±155.09★▲
6.724±0.072★▲
48 h
20/5
411.29±52.456★▲
6.871±0.039★▲
神经元损伤组与其正常组对照组相比较★：P<0.01
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相邻神经元损伤组之间相比较▲：P<0.01，△：P>0.05
2.2 D-AP-5对创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及 [H+]i变化的影响
D-AP-5可明显降低创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及 [H+]i升高。伤后22 h以内给药明显降低创伤后细胞内游离钙的升高(P<0.01)，而伤后10 h之内应用可明显降低创伤后细胞内游离氢的升高(P<0.01)，伤后22小时以上应用则无效(P<0.05)，见表2。
表2 D-AP-5对创伤后神经元细胞内[Ca2+]i及 [H+]i变化的影响 组别
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细胞数
/培养
Ca2+(nmol)
H+(pH值)
创伤对照组
治疗组
创伤对照组
治疗组
uninjury
18/3
96.745±21.28
102.36±10.38
, 百拇医药
7.141±0.081
7.162±0.053
2.15 h
16/4
283.83±25.42
203.85±30.66＃
6.596±0.035
6.689±0.068＃
2.30 h
20/4
409.04±76.38
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182.86±47.08＃
6.596±0.032
6.793±0.086＃
3 h
13/5
352.52±28.12
89.73±15.44＃
6.573±0.032
6.79±0.057＃
6 h
15/5
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530.02±78.79
78.56±10.25＃
6.535±0.032
6.726±0.091＃
12 h
14/3
1888.08±123.64
66.09±13.06＃
6.016±0.197
6.358±0.192＃
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24 h
15/4
2664.17±155.09
131.29±25.39＃
6.724±0.072
6.709±0.028※
治疗组与创伤对照组相比较＃：P<0.01 ※：P>0.05
3 讨论
Ca2+是神经细胞信息传递及神经递质合成与释放重要的细胞内第二信使[4]。正常生理状态下，神经细胞内外存在很大的Ca2+浓度梯度差，因此，直接检测细胞内游离[Ca2+]i是深入探讨脑创伤时神经生化变化的重要方面。本实验初次采用细胞内Ca2+荧光探针Fluo-3/AM直接检测脑外伤不同时间神经元细胞胞浆中游离[Ca2+]i水平变化，发现脑创伤后神经元细胞存在Ca2+严重超载。伤后15 min显著升高，24 h达高峰，以后逐渐下降，48 h仍维持较高水平。这种脑创伤后神经元胞体游离[Ca2+]i升高的原因尚未完全明确，可能与以下4方面有关：①脑创伤后1～2分钟受伤的神经元细胞出现大量K+外流[5]，其结果导致细胞膜的去极化，使胞膜电压依赖性Ca2+通道开放，大量胞外Ca2+内流。②创伤后神经元细胞K+外流可使细胞无氧糖酵解增加，从而使ATP分解增加而合成减少[6]，引起细胞内ATP缺乏，导致细胞膜上Ca2+-ATPase活性抑制，细胞内Ca2+外排减少。③创伤后神经元细胞膜去极化及ATP缺乏，使间接依赖Na+-K+ATPase的Ca2+-Na+交换泵出现反相交换[7]，使大量Ca2+内流。④脑创伤神经元细胞膜去极化导致大量兴奋氨基酸释放，从而使NMDA受体激活，引起Ca2+、Na+、Cl-的内流[8]。NMDA受体激活同样还可激活磷酯酶C(PLC)，从而分解膜磷酯形成IP3和DAG，IP3作为第三信使可使内质网内Ca2+释放入胞浆内[9]。由于上述4方面因素，细胞外Ca2+进入细胞内增多，而胞内Ca2+外排减少，从而导致神经细胞Ca2+超载。受体耦联钙通道拮抗剂D-AP-5主要与兴奋氨基酸竞争NMDA受体，从而使激活的NMDA受体数目减少，从而减少Ca2+内流[10]。实验研究表明D-AP-5与伤后22小时内应用均有效，尤其在伤后1～10 h应用最佳，这说明伤后1小时以内可能以电压依赖性钙通道内流为主，而伤后1～10小时，NMDA受体激活而致Ca2+内流可能起主导作用。
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酸中毒是颅脑创伤继发性病理损害过程的另一个重要方面。本实验初次采用细胞内H+荧光探针BCECF/AM直接检测脑创伤后不同时间单个神经元细胞胞浆中游离[H+]i水平变化，发现脑创伤后神经元细胞存在酸中毒。伤后15 min细胞内[H+]i即已升高，随后逐渐升高，并于12 h达高峰，以后逐渐下降，48 h仍维持较高水平。这种脑创伤后神经元胞体游离[H+]i升高的原因尚未完全明确，可能与以下2方面有关：①脑创伤后神经元细胞内K+大量外流，从而导致细胞膜去极化，而这种去极化又可诱导兴奋氨基酸(EAA)的释放，而进一步促进K+外流，同时Ca2+、Na+、Cl-、H+内流，这样在离子跨膜异常与EAA释放之间形成一种恶性循环。神经元细胞为了维持细胞内外正常离子平衡，这种异常跨膜离子障碍激活能量依赖性离子泵及刺激ATP水解增加[11]，最终使糖酵解增强，结果导致乳酸堆积，细胞内酸中毒形成。②脑创伤后r-氨基丁酸(GABA)释放可激活Cl通道，从而使HCO3-外流；同时谷氨酸释放激活NMDA(N-甲基-D-天门氡氨酸)受体，从而H+内流，这样形成细胞外液暂短碱性化[12]，这种细胞外液暂短碱性化、细胞内H+升高及膜去极化均可激活Na+/H+交换泵。此外，脑创伤后与EAA受体耦联的蛋白激酶C(PKC)也可被激活，从而使Na+/H+交换泵磷酸化而激活[13]，Na+/H+交换泵间接依赖Na+/K+ATPase，而Na+/K+泵直接依赖于Na+/K+ATPase，这样ATP大量消耗，一方面ATP消耗过程中产生H+，另一方面刺激无氧糖酵解增强，从而满足ATP的消耗，最终产生乳酸堆积，细胞内酸中毒[14]。本实验采用NMDA受体竞争性拮抗剂D-AP-5，于创伤后10 h之内应用有效，4 h之内应用最佳，22 h以上应用则无效。这说明EAA释放主要在伤后10 h之内，而10 h以上一方面由于EAA释放减少，另一方面由于其它生化级联反应(如花生四烯酸等)形成有机酸增多，并且细胞内Ca2+超载、自由基形成、酸中毒等之间相互影响，最终使创伤后期酸中毒形成不单一局限于EAA受体所介导的离子紊乱这一原因。
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创伤后神经元细胞内游离钙升高与酸中毒之间相互影响，互为因果。[H+]i可与[Ca2+]i竞争细胞内蛋白质结合位点，从而引起[Ca2+]i水平升高。此外在酸中毒环境，Ca2+-ATPase依赖性的Na+/Ca2+泵出现反相交换，从而导致[Ca2+]i升高[15]。而[Ca2+]i的升高一方面引起线粒体呼吸链电子传递障碍，导致ATP生成减少，刺激乳酸形成[16]，另一方面Ca2+激活磷脂酶C、A，进而促使膜磷脂分解，导致大量有机酸和自由基形成，进一步增加[H+]i。
上述实验说明，D-AP-5通过与兴奋氨基酸竞争NMDA受体，使激活的NMDA受体数目减少，从而减少了Ca2+内流及减轻跨膜离子障碍，进而抑制创伤后神经元细胞Ca2+超载和酸中毒，且有效治疗时间窗不同，提示临床上对创伤性颅脑损伤的治疗，应选定D-AP-5作用的最佳时间窗。本实验是在细胞水平上的创伤研究，至于整体水平效果如何，还有待于进一步研究。
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[基金来源] 黑龙江省科委科技计划项目资助(NO.G98C19-13)
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收稿：1999-04-10
修回：1999-11-25
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