叶下珠属植物体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型的作用
作者：郭卫真 邓学龙 董伯振 朱宇同
单位：郭卫真(广州中医药大学第一附属医院检验科，广州 510405)；邓学龙 董伯振 朱宇同(广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405)
关键词：@叶下珠/药理学；疱疹病毒2型，人/药物作用；疱疹，生殖器/中药疗法；体外研究
广州中医药大学学报000114摘要：为探讨叶下珠属植物对单纯疱疹病毒Ⅱ型的抑制作用，采用地鼠肾细胞株(BHK)和原代兔肾细胞对8种叶下珠属植物水提物进行了体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型作用的研究。结果显示：除珠子草延益亚种外，云泰叶下珠、云贵叶下珠、广东叶下珠、余甘子、黄珠子草、广西叶下珠、苦味叶下珠等7种叶下珠水提物在该2种培养细胞上均有不同程度抑制单纯疱疹病毒Ⅱ型的作用。提示叶下珠属植物对单纯疱疹病毒Ⅱ型感染有一定的治疗作用。
中图分类号：R373.1+1 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1007-3213(2000)01-0054-04
Anti-HSV-Ⅱ Effect of Eight kinds of Phyllanthus Plants in Vitro
GUO Weizhen
(Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China)
DENG Xuelong,DONG Bozhen,ZHU Yutong
(Tropical Medicine Institute,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China)
, 百拇医药
Abstract:BHK and primary rabbit kidney cell lines were used to study the anti-HSV-Ⅱ effect of 8 kinds of water extracts of phyllanthus plants in vitro.The result showed that the water extracts of 7 kinds of phyllanthus plant had an inhibitory effect on HSV-Ⅱ to various degrees and only one kind of phyllanthus plant showed no anti-HSV-Ⅱ action.
Key words:@ PHYLLANTHUS PLANT/pharmacology;HERPESVIRUS-2 HUMAN/drug effects;HERPES GENITALIS/TCD therapy;IN VITRO
, http://www.100md.com
单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)是一种重要致病病毒，能引起生殖器疱疹，并与宫颈癌的发生可能有关。目前临床尚无有效的治疗药物，较为有效的一线抗HSV药物首选无环岛苷(ACV)[1]，但无环岛苷只能缓解症状，缩短病程，尚不能控制HSV的潜伏感染及其复发[2]，而且早于1982年就有无环鸟苷耐药性的报道[3]。目前应用中医药治疗单纯疱疹病毒感染性疾病正日益受到重视。叶下珠属植物抗嗜肝病毒的作用已有广泛报道，但对单纯疱疹病毒Ⅱ型抑制作用的报道尚不多。我们采用地鼠肾细胞株(BHK)和原代兔肾细胞对8种叶下珠水提物体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型作用进行了实验研究，现报道如下。
1 实验材料
1.1 药物
云泰叶下珠、云贵叶下珠、广东叶下珠、余甘子、黄珠子草、广西叶下珠、苦味叶下珠、珠子草延益亚种等8种叶下珠属植物水提物由广州中医药大学热带医学研究所病毒室提供，制备方法为60℃水浴提取2h，不时振荡，将上清液离心沉淀，取上清无菌过滤后-20℃保存备用；无环鸟苷(ACV)为湖北医药工业研究所生产，用Hank's缓冲液配制而成1g/L，4℃保存备用。
, 百拇医药
1.2 病毒株
单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)，由广州市儿童医院病毒实验室提供，在BHK细胞和原代兔肾细胞上传代与检测，冻存于-70℃，测定其组织培养半数感染病毒量(TCID50)在BHK细胞和原代兔肾细胞上分别为4.5和6.23，实验时用维持液稀释成病毒浓度为每0.1mL含100 TCID50。
1.3 细胞
①原代兔肾单层细胞，细胞取自5日龄之内乳兔，剪碎加胰蛋白酶4℃消化过夜。先去胰酶后加入生长液置37℃、5%CO2孵箱中培养3d，再滴96孔细胞板，待长至单层后待用；②地鼠肾细胞株(BHK)，由广州市儿童医院病毒实验室提供。
1.4 细胞培养液和维持液
各为含10%、2%小牛血清，100kU/L青、链霉素的杜布可改良的伊格尔培养基(DMEM)，GIBCO产品。
, http://www.100md.com
2 方法
2.1 细胞毒性实验
试验在96孔微量板上进行，细胞数为50×109/L，0.1mL/孔，待细胞长至单层后，换成含2%小牛血清的维持液，加入用维持液倍比稀释成不同浓度的药物，37℃、5%CO2孵箱中培养96h，每天观察细胞的形态变化以及有无细胞病变(CPE)。
2.2 药物抗病毒实验[4]
对病毒所致细胞病变的抑制作用：细胞长至单层后，将药物用2%的小牛血清维持液进行倍比稀释，每一浓度接种4个细胞孔，0.1mL/孔，以细胞不出现病变的最小稀释度为该药液对细胞无毒界限，同时100TCID50HSV-Ⅱ，37℃、5%CO2孵箱中培养96h，观察CPE情况。实验均设病毒对照、药物对照、细胞对照，并以ACV作为药物阳性对照，置37℃ CO2培养箱内，每天在倒置显微镜下观察病变并记录。当病毒对照孔细胞出现+++病变时，继续观察4d则终止。细胞出现病变的程度按以下6级标准记录：-：细胞生长正常，无病变出现；±：细胞病变小于整个单层细胞的10%；+：细胞病变约占整个单层细胞的25%；++：细胞病变约占整个单层细胞的50%；+++：细胞病变约占整个单层细胞的75%；++++：细胞病变约占整个单层细胞的90%以上。
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3 结果
3.1 叶下珠属植物对细胞毒性作用
结果见表1。
表1 8种叶下珠属植物水提物对细胞毒性作用 药 物
ρ细胞无毒界限浓度/(g.L-1)
BHK细胞株
原代兔肾单层细胞
云贵叶下珠
10
/
, http://www.100md.com 广东叶下珠
5
/
广西叶下珠
1.25
20
云泰叶下珠
1.25
20
黄珠子草
1.25
20
余甘子
, http://www.100md.com
1.25
20
苦味叶子珠
/
20
珠子草延益亚种
/
20
无环鸟苷
>0.0125
0.05
/：未做(下同)
3.2 叶下珠属植物在BHK和原代兔肾细胞上抗单纯疱疹病毒Ⅱ型作用
, 百拇医药
表2结果表明，该6种叶下珠属植物在BHK细胞上均有不同程度抑制单纯疱疹病毒Ⅱ型的作用，最低有效抑制浓度均为0.625g/L，但都未做出最低抑制浓度，因此我们改用对HSV-Ⅱ较敏感的原代兔肾细胞继续试验，结果见表3。表3结果表明，该6种叶下珠属植物中除珠子草延益亚种外，原代兔肾细胞上均有不同程度抑制单纯疱疹病毒Ⅱ型的作用，其中苦味叶下珠和余甘子的有效抑制浓度均为10g/L，云泰叶下珠和黄珠子草的有效抑制浓度均为20g/L，广西叶下珠的有效抑制浓度范围为2.0～2.5g/L，仍未做出最低抑制浓度，故以广西叶下珠的效果较好。
表2 叶下珠属植物在BHK上抗单纯疱疹病毒Ⅱ型作用 药 物
不同药物稀释浓度(ρ)抗病毒作用
病毒
对照
细胞
, http://www.100md.com
对照
ρ1=20g.L-1
ρ2=10g.L-1
ρ3=5g.L-1
ρ4=2.5g.L-1
ρ5=1.25g.L-1
, http://www.100md.com
ρ6=0.625g.L-1
云贵叶下珠
+
-
-
-
-
-
++++
-
广东叶下珠
+
, 百拇医药
+
-
-
-
-
++++
-
广西叶下珠
+
+
+
+
-
-
, 百拇医药
++++
-
云泰叶下珠
+
+
+
+
-
-
++++
-
黄珠子草
+
+
, 百拇医药
+
+
-
-
++++
-
余甘子
+
+
+
+
-
-
++++
, 百拇医药
-
无环鸟苷*
/
/
/
/
/
/
++++
-
*：ACV最低有效浓度为0.0125g/L，细胞无毒界限浓度为0.05g/L
表3 叶下珠属植物在原代兔肾细胞上抗单纯疱疹病毒Ⅱ型作用 药 物
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不同药物稀释浓度(ρ)抗病毒作用
病毒
对照
细胞
对照
ρ1=20g.L-1
ρ2=10g.L-1
ρ3=5g.L-1
ρ4=2.5g.L-1
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苦味叶下珠
-
-
+
+++
++++
-
珠子草延益亚种
+
++
+++
++++
++++
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-
广西叶下珠
-
-
-
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++++
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云泰叶下珠
-
+++
+++
++++
++++
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-
黄珠子草
-
±
±
++
++++
-
余甘子
-
-
+
+
++++
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-
无环鸟苷*
/
/
/
/
++++
-
*：ACV最低有效浓度为0.0125g/L，细胞无毒界限浓度为0.05g/L
4 讨论
单纯疱疹病毒Ⅱ型主要引起生殖器疱疹，为通过性行为传播的复发性疾病。在过去20年中，美国生殖器疱疹增加了16倍，世界卫生组织估计全球每年新发生殖器疱疹病例达2000万。我国生殖器疱疹病毒感染患病人数近年急剧上升，而妇女除了局部感染以外，也可能是子宫颈癌发生的原因之一。主要用无环鸟苷、更昔洛韦等核苷类抗病毒药物治疗，也有采用干扰素与聚肌胞等干扰素诱生剂，但均未能解决病毒复发问题，且有一定毒副作用与耐药性产生。
, 百拇医药
祖国医学在治疗疱疹病毒感染方面有广阔的前景。我们在多年的中草药筛选中，发现一些确有广谱抗病毒作用，且能消炎抑菌、调经扶正、保护粘膜的有效成份 。近年来西方也采用过甘草酸喷剂(商品名Epigen),但抗病毒作用效果较差。国内也有诸如洁尔阴等阴部冲洗用品，但未见能防止病毒感染的药效介绍。
叶下珠属在全世界约有600多个品种，我国有6亚属、7组、33种、4变种。自1988年报道叶下珠治疗乙型肝炎以来[5]，10多年来有关这方面的研究文章已有多篇[6]。但有关对单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)拮抗作用的报道尚不多见。山东省药物研究所曾发现从叶下珠分离的去氢诃子酸甲酯(methyl dehydrochebulate)[7]和短叶苏木酚酸甲酯(methyl brevifolincarboxylate)具有体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)的作用[8]，但未见该两种单体对HSV-2作用的报道。
, http://www.100md.com
本研究发现云泰叶下珠、云贵叶下珠、广东叶下珠、余甘子、黄珠子草、广西叶下珠、苦味叶下珠、珠子草延益亚种等8种叶下珠属植物水提物中，除珠子草延益亚种外均有抑制HSV-2作用，对治疗单纯疱疹病毒Ⅱ型感染有着一定作用，值得进一步深入研究其有效成分。
作者简介：郭卫真，女，1970年3月出生，检验师
参考文献：
[1]吴志华.现代性病学[M]，广州：广东人民出版社，1996.16～177
[2]张杰.中草药抗单纯疱疹病毒作用的研究进展[J].中医药信息，1995，1：31
[3]Bums WH,Saral R,Santos G W,et al.Isolation and characterisation of resistant herpes simplex virus after acyclovir therapy[J].The Lancet，1982，1(8269):421
, 百拇医药
[4]王秋娟，李运曼，王旻，等.家蚕细胞基因工程人α-干扰素注射液抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用[J].中国药科大学学报，1996，27(9)：557
[5]Thyagarajan S.P,Subramanian S,Thirunalasundari T,et al.Effect of Phyllanthus amarus on chronic carriers of hepatitis B virus[J].The Lancet,1988,1:764
[6]朱宇同，方宏勋，容秉培，等.叶下珠治疗病毒性肝炎研究的简况及其发展策略[J].广州中医药大学学报，1998，15(增刊)：63
[7]Zuo Chunxu,Li Fengqin,Yao Qingqiang.Antiviral dehydrochebulic acid methyl and its preparation.CA,1996,124:18553/u
[8]Zuo Chunxu,Li Fengqin,Yao Qingqiang.Antiviral methyl brevifolincarboxylate and its preparation.CA,1996,124:66574/a
收稿日期：1999-06-25, 百拇医药
单位：郭卫真(广州中医药大学第一附属医院检验科，广州 510405)；邓学龙 董伯振 朱宇同(广州中医药大学热带医学研究所，广州 510405)
关键词：@叶下珠/药理学；疱疹病毒2型，人/药物作用；疱疹，生殖器/中药疗法；体外研究
广州中医药大学学报000114摘要：为探讨叶下珠属植物对单纯疱疹病毒Ⅱ型的抑制作用，采用地鼠肾细胞株(BHK)和原代兔肾细胞对8种叶下珠属植物水提物进行了体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型作用的研究。结果显示：除珠子草延益亚种外，云泰叶下珠、云贵叶下珠、广东叶下珠、余甘子、黄珠子草、广西叶下珠、苦味叶下珠等7种叶下珠水提物在该2种培养细胞上均有不同程度抑制单纯疱疹病毒Ⅱ型的作用。提示叶下珠属植物对单纯疱疹病毒Ⅱ型感染有一定的治疗作用。
中图分类号：R373.1+1 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1007-3213(2000)01-0054-04
Anti-HSV-Ⅱ Effect of Eight kinds of Phyllanthus Plants in Vitro
GUO Weizhen
(Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China)
DENG Xuelong,DONG Bozhen,ZHU Yutong
(Tropical Medicine Institute,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China)
, 百拇医药
Abstract:BHK and primary rabbit kidney cell lines were used to study the anti-HSV-Ⅱ effect of 8 kinds of water extracts of phyllanthus plants in vitro.The result showed that the water extracts of 7 kinds of phyllanthus plant had an inhibitory effect on HSV-Ⅱ to various degrees and only one kind of phyllanthus plant showed no anti-HSV-Ⅱ action.
Key words:@ PHYLLANTHUS PLANT/pharmacology;HERPESVIRUS-2 HUMAN/drug effects;HERPES GENITALIS/TCD therapy;IN VITRO
, http://www.100md.com
单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)是一种重要致病病毒，能引起生殖器疱疹，并与宫颈癌的发生可能有关。目前临床尚无有效的治疗药物，较为有效的一线抗HSV药物首选无环岛苷(ACV)[1]，但无环岛苷只能缓解症状，缩短病程，尚不能控制HSV的潜伏感染及其复发[2]，而且早于1982年就有无环鸟苷耐药性的报道[3]。目前应用中医药治疗单纯疱疹病毒感染性疾病正日益受到重视。叶下珠属植物抗嗜肝病毒的作用已有广泛报道，但对单纯疱疹病毒Ⅱ型抑制作用的报道尚不多。我们采用地鼠肾细胞株(BHK)和原代兔肾细胞对8种叶下珠水提物体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型作用进行了实验研究，现报道如下。
1 实验材料
1.1 药物
云泰叶下珠、云贵叶下珠、广东叶下珠、余甘子、黄珠子草、广西叶下珠、苦味叶下珠、珠子草延益亚种等8种叶下珠属植物水提物由广州中医药大学热带医学研究所病毒室提供，制备方法为60℃水浴提取2h，不时振荡，将上清液离心沉淀，取上清无菌过滤后-20℃保存备用；无环鸟苷(ACV)为湖北医药工业研究所生产，用Hank's缓冲液配制而成1g/L，4℃保存备用。
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1.2 病毒株
单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)，由广州市儿童医院病毒实验室提供，在BHK细胞和原代兔肾细胞上传代与检测，冻存于-70℃，测定其组织培养半数感染病毒量(TCID50)在BHK细胞和原代兔肾细胞上分别为4.5和6.23，实验时用维持液稀释成病毒浓度为每0.1mL含100 TCID50。
1.3 细胞
①原代兔肾单层细胞，细胞取自5日龄之内乳兔，剪碎加胰蛋白酶4℃消化过夜。先去胰酶后加入生长液置37℃、5%CO2孵箱中培养3d，再滴96孔细胞板，待长至单层后待用；②地鼠肾细胞株(BHK)，由广州市儿童医院病毒实验室提供。
1.4 细胞培养液和维持液
各为含10%、2%小牛血清，100kU/L青、链霉素的杜布可改良的伊格尔培养基(DMEM)，GIBCO产品。
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2 方法
2.1 细胞毒性实验
试验在96孔微量板上进行，细胞数为50×109/L，0.1mL/孔，待细胞长至单层后，换成含2%小牛血清的维持液，加入用维持液倍比稀释成不同浓度的药物，37℃、5%CO2孵箱中培养96h，每天观察细胞的形态变化以及有无细胞病变(CPE)。
2.2 药物抗病毒实验[4]
对病毒所致细胞病变的抑制作用：细胞长至单层后，将药物用2%的小牛血清维持液进行倍比稀释，每一浓度接种4个细胞孔，0.1mL/孔，以细胞不出现病变的最小稀释度为该药液对细胞无毒界限，同时100TCID50HSV-Ⅱ，37℃、5%CO2孵箱中培养96h，观察CPE情况。实验均设病毒对照、药物对照、细胞对照，并以ACV作为药物阳性对照，置37℃ CO2培养箱内，每天在倒置显微镜下观察病变并记录。当病毒对照孔细胞出现+++病变时，继续观察4d则终止。细胞出现病变的程度按以下6级标准记录：-：细胞生长正常，无病变出现；±：细胞病变小于整个单层细胞的10%；+：细胞病变约占整个单层细胞的25%；++：细胞病变约占整个单层细胞的50%；+++：细胞病变约占整个单层细胞的75%；++++：细胞病变约占整个单层细胞的90%以上。
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3 结果
3.1 叶下珠属植物对细胞毒性作用
结果见表1。
表1 8种叶下珠属植物水提物对细胞毒性作用 药 物
ρ细胞无毒界限浓度/(g.L-1)
BHK细胞株
原代兔肾单层细胞
云贵叶下珠
10
/
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5
/
广西叶下珠
1.25
20
云泰叶下珠
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黄珠子草
1.25
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余甘子
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1.25
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苦味叶子珠
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20
珠子草延益亚种
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20
无环鸟苷
>0.0125
0.05
/：未做(下同)
3.2 叶下珠属植物在BHK和原代兔肾细胞上抗单纯疱疹病毒Ⅱ型作用
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表2结果表明，该6种叶下珠属植物在BHK细胞上均有不同程度抑制单纯疱疹病毒Ⅱ型的作用，最低有效抑制浓度均为0.625g/L，但都未做出最低抑制浓度，因此我们改用对HSV-Ⅱ较敏感的原代兔肾细胞继续试验，结果见表3。表3结果表明，该6种叶下珠属植物中除珠子草延益亚种外，原代兔肾细胞上均有不同程度抑制单纯疱疹病毒Ⅱ型的作用，其中苦味叶下珠和余甘子的有效抑制浓度均为10g/L，云泰叶下珠和黄珠子草的有效抑制浓度均为20g/L，广西叶下珠的有效抑制浓度范围为2.0～2.5g/L，仍未做出最低抑制浓度，故以广西叶下珠的效果较好。
表2 叶下珠属植物在BHK上抗单纯疱疹病毒Ⅱ型作用 药 物
不同药物稀释浓度(ρ)抗病毒作用
病毒
对照
细胞
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对照
ρ1=20g.L-1
ρ2=10g.L-1
ρ3=5g.L-1
ρ4=2.5g.L-1
ρ5=1.25g.L-1
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ρ6=0.625g.L-1
云贵叶下珠
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广东叶下珠
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广西叶下珠
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黄珠子草
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余甘子
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无环鸟苷*
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*：ACV最低有效浓度为0.0125g/L，细胞无毒界限浓度为0.05g/L
表3 叶下珠属植物在原代兔肾细胞上抗单纯疱疹病毒Ⅱ型作用 药 物
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不同药物稀释浓度(ρ)抗病毒作用
病毒
对照
细胞
对照
ρ1=20g.L-1
ρ2=10g.L-1
ρ3=5g.L-1
ρ4=2.5g.L-1
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苦味叶下珠
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珠子草延益亚种
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广西叶下珠
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黄珠子草
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无环鸟苷*
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*：ACV最低有效浓度为0.0125g/L，细胞无毒界限浓度为0.05g/L
4 讨论
单纯疱疹病毒Ⅱ型主要引起生殖器疱疹，为通过性行为传播的复发性疾病。在过去20年中，美国生殖器疱疹增加了16倍，世界卫生组织估计全球每年新发生殖器疱疹病例达2000万。我国生殖器疱疹病毒感染患病人数近年急剧上升，而妇女除了局部感染以外，也可能是子宫颈癌发生的原因之一。主要用无环鸟苷、更昔洛韦等核苷类抗病毒药物治疗，也有采用干扰素与聚肌胞等干扰素诱生剂，但均未能解决病毒复发问题，且有一定毒副作用与耐药性产生。
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祖国医学在治疗疱疹病毒感染方面有广阔的前景。我们在多年的中草药筛选中，发现一些确有广谱抗病毒作用，且能消炎抑菌、调经扶正、保护粘膜的有效成份 。近年来西方也采用过甘草酸喷剂(商品名Epigen),但抗病毒作用效果较差。国内也有诸如洁尔阴等阴部冲洗用品，但未见能防止病毒感染的药效介绍。
叶下珠属在全世界约有600多个品种，我国有6亚属、7组、33种、4变种。自1988年报道叶下珠治疗乙型肝炎以来[5]，10多年来有关这方面的研究文章已有多篇[6]。但有关对单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)拮抗作用的报道尚不多见。山东省药物研究所曾发现从叶下珠分离的去氢诃子酸甲酯(methyl dehydrochebulate)[7]和短叶苏木酚酸甲酯(methyl brevifolincarboxylate)具有体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)的作用[8]，但未见该两种单体对HSV-2作用的报道。
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本研究发现云泰叶下珠、云贵叶下珠、广东叶下珠、余甘子、黄珠子草、广西叶下珠、苦味叶下珠、珠子草延益亚种等8种叶下珠属植物水提物中，除珠子草延益亚种外均有抑制HSV-2作用，对治疗单纯疱疹病毒Ⅱ型感染有着一定作用，值得进一步深入研究其有效成分。
作者简介：郭卫真，女，1970年3月出生，检验师
参考文献：
[1]吴志华.现代性病学[M]，广州：广东人民出版社，1996.16～177
[2]张杰.中草药抗单纯疱疹病毒作用的研究进展[J].中医药信息，1995，1：31
[3]Bums WH,Saral R,Santos G W,et al.Isolation and characterisation of resistant herpes simplex virus after acyclovir therapy[J].The Lancet，1982，1(8269):421
, 百拇医药
[4]王秋娟，李运曼，王旻，等.家蚕细胞基因工程人α-干扰素注射液抗Ⅱ型单纯疱疹病毒作用[J].中国药科大学学报，1996，27(9)：557
[5]Thyagarajan S.P,Subramanian S,Thirunalasundari T,et al.Effect of Phyllanthus amarus on chronic carriers of hepatitis B virus[J].The Lancet,1988,1:764
[6]朱宇同，方宏勋，容秉培，等.叶下珠治疗病毒性肝炎研究的简况及其发展策略[J].广州中医药大学学报，1998，15(增刊)：63
[7]Zuo Chunxu,Li Fengqin,Yao Qingqiang.Antiviral dehydrochebulic acid methyl and its preparation.CA,1996,124:18553/u
[8]Zuo Chunxu,Li Fengqin,Yao Qingqiang.Antiviral methyl brevifolincarboxylate and its preparation.CA,1996,124:66574/a
收稿日期：1999-06-25, 百拇医药