异种、异位肾移植超急性排斥反应模型的初步探讨
作者：王 熹 赵 明 邱 实 闵志廉 朱有华
单位：第二军医大学长征医院肾移植中心 上海，200003
关键词：异种肾移植；超急性排斥；动物模型
异种器官移植是可望缓解可供移植的人类脏器日益短缺矛盾的有效途径
异种器官移植是可望缓解可供移植的人类脏器日益短缺矛盾的有效途径，超急性排斥反应(HAR)是阻止其成功的关键[1]。为研究其发生机制和有效抑制手段，我们建立了将豚鼠肾脏移植至大白鼠颈部的异种、异位肾移植HAR模型，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 豚鼠，6只，重250g，性别不限(第二军医大学实验动物中心)；SD大鼠，30只，重250 g，雄性(上海计划生育研究所)；手术显微镜(GX-SS，22-3；上海医用光学仪器厂)；HCA离体肾脏保存液(上海市中心血站)；肝素(上海生化试剂三厂)；戊巴比妥钠(第二军医大学朝晖制药厂)。
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1.2 方法
1.2.1 供肾切取 供鼠以戊巴比妥钠(50mg/kg体重)腹腔麻醉，仰卧固定，取腹部正中切口，切开皮肤、腹直肌和腹膜，用自制自动拉钩将腹壁拉向两侧，暴露腹腔内脏器；将肠管推向两侧，充分暴露双侧肾脏及所属区域动脉和静脉。
1.2.2 供肾血管游离 使用棉签和显微镊钝性分离双侧肾动脉、静脉及其分支，游离和其连接的腹主动脉及下腔静脉，除去血管外膜外脂肪和结缔组织，0号丝线结扎分支血管，保留双侧肾动脉、肾静脉及输尿管；于右肾静脉上方以0号丝线围绕下腔静脉、于左肾动脉下方以0号丝线围绕腹主动脉，暂不结扎。
1.2.3 原位灌注 结扎右肾静脉上方的下腔静脉，结扎左肾动脉上方的腹主动脉。轻轻提起左肾动脉下方腹主动脉围绕线，于提起处远端用眼科剪剪一向心端斜切口(腹主动脉勿切断)，向心方向插入自制灌注管，同一水平切开下腔静脉，用0～4℃ HCA肾保存液(内有少许肝素)原位灌注双侧肾脏，至双肾体表面灰白，肾静脉流出的灌注液清亮为止。整块切取双肾及输尿管，注意适当保留输尿管周围结缔组织。
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1.2.4 供肾修整 0～4℃下修整双肾，左肾静脉于腹腔静脉根部结扎离断；于右肾静脉上方结扎下腔静脉、下方保留一段下腔静脉备吻合用。双肾动脉各留一片Carrels瓣后与腹主动脉分离。
1.2.5 供肾移植 受鼠的麻醉及固定方法同上，取颈部正中旁纵切口，长约1.5～2.0 cm。皮下游离出肾窝位置，轻柔分离颈总动脉、颈外静脉。微血管夹阻断近心端血流，远心端结扎、离断；肝素生理盐水冲洗管腔；冰盐水纱布垫保护移植肾。手术显微镜下将肾静脉、受鼠颈外静脉用11-0带针缝合线端-端间断吻合8～12针；肾动脉、颈总动脉用10-0带针缝合线行端-端间断吻合8～10针。开放血流，由输尿管口观测移植肾脏的泌尿情况。将输尿管由颈侧部皮肤穿出，出口处做一乳头并固定两针，乳头部涂少许眼药膏以防干燥坏死，将肾脏放入颈部游离出的肾窝内，与周围组织适当固定。0号丝线缝合切口，术后肌注氨苄青霉素预防感染。受鼠原肾保留。
1.2.6 观测方法 显微镜下由输尿管口观察移植肾的泌尿情况。以停止泌尿1 h以上为发生排斥反应。此时切除移植肾行病理检查。
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1.2.7 实验分组 实验组与对照组均为12只SD大鼠；实验组供鼠为豚鼠；对照组供鼠为同种异体SD大鼠。
2 结 果
2.1 移植肾的泌尿持续时间 自接通血流开始，异种移植肾脏的持续泌尿时间最长为14min，短者为3min，平均泌尿时间为7.1±3.7min，且尿量较少；同种移植肾脏的持续泌尿时间较长，且尿量较多，整个术程均可见输尿管饱满，术后亦可见到造口处不断有尿液涌出，每例肾脏泌尿时间均超过48h，无一例因出血、感染、休克等并发症而死亡。见附表。
附表 移植肾的泌尿持续时间(
±s)
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供者
受者
n
泌尿持续时间
豚鼠
SD大鼠
12
7.1±3.7min
SD大鼠
SD大鼠
12
>48 h
2.2 病理所见 同种移植肾动静脉充盈良好，肾体搏动有力，镜下检查未见明显病理改变。异种肾脏接通血流后很快即发生变化：肾表面颜色由红润变为花斑样、绛紫色，表面张力减弱，肾体搏动消失，回流静脉塌陷；镜下可见肾实质广泛出血坏死，肾小球肿胀、小血管内微血栓形成和肾间质少量炎细胞浸润。3 讨 论
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超急性排斥反应常出现在移植肾接通血流后数分钟至几小时内，很少超过术后24～48 h。临床表现主要是少尿或无尿。病理检查可见移植肾呈暗红色、质地柔软、血管扩张、肾小球毛细血管袢和小血管壁有多形核细胞浸润、间质水肿、血管壁坏死、微血栓形成和出血。一个成功的异种器官移植HAR的小动物模型必须具备以下两个特征：第一，排斥反应的发生非常快，常在数小时内发生；第二，在给定的两个不同的种属间移植时，HAR要么在每一例中都发生，要么都不发生[2]。
为研究异种器官移植HAR及其相关问题，建立的小动物模型除了要满足以上要求外，应力求操作简便、结果可靠、观测方便和稳定实用。目前研究异种器官移植HAR所建立的小动物模型多以心脏移植为主，这主要是因为心脏的自律性收缩可为观察其功能状态带来较大方便；将心脏移植至颈部皮下，亦可由体外直接观测心跳及检测心电图使得所观测指标既准确又方便、且有特异性[3]。与此相比，小动物的肾移植要复杂得多。因为大多数操作需进腹腔，增加了手术的难度，也增加了受鼠的死亡率，而且很难以移植肾脏的泌尿功能作为其功能状态的观察指标，所以多以受鼠存活时间的长短作为移植肾失功与否的标志。但这种方法并不能特异描述移植肾的功能状态，因为，即使是切除双肾的大鼠仍可存活六天之久[4]；况且导致死亡的因素很多，除了外科并发症外，尚有感染、失血、休克等。因此，受鼠的存活时间并非移植肾功能状态的良好观测指标。肾脏的独特功能之一是其泌尿功能，若能准确测知其泌尿状况，无疑是监测移植肾功能的最佳方法。然而，以往将输尿管吻合至膀胱壁的手术很难达到这一目的。
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本实验中，我们尝试将豚鼠肾脏移至大白鼠颈部、输尿管行皮下造口，直接由移植肾的泌尿状况判断其功能，建立了便于观察的异种肾移植HAR模型，并取得满意结果。这一模型，满足异种器官移植HAR的小动物模型必须具备的两个特征，与以往的小动物肾移植模型相比，尚有如下特点：①提高供肾的利用率。以往用于移植的肾脏在与腹腔动、静脉行端-侧吻合时，常需保留一段与之相连的供者的腹主动脉和下腔静脉，不得不放弃另一侧肾脏。本模型中，由于受鼠颈部血管可以游离出较长一段无分支的颈总动脉、颈外静脉，术野暴露清楚。按本法修整的双肾均可很好地与受鼠颈部血管吻合，操作亦十分方便。②手术切口小、时间短、受鼠的创伤亦小。大白鼠颈部血管位置较固定，分支少，容易游离及暴露。熟练操作后，一侧肾脏的血管吻合时间可缩短到15～20min。切口小，对受鼠的创伤亦小。③术后监测容易、结果可靠。对移植肾脏的泌尿功能的连续动态观察是判断HAR的良好指标。将输尿管移植至颈部皮外造口，使这种监测手段得以实施。使结果既准确又有特异性。表面涂以少许眼药膏可防干燥、防感染。由对照组移植肾的泌尿时间可知，48h的观察时间基本可以满足对异种器官移植HAR进行多方面研究的需要。④降低受鼠的并发症和死亡率。由于不打开腹腔，对受鼠的主要脏器的影响较小，亦减少了由于创面蒸发所造成的体液丢失。避免了由于操作不便所致的漏血、漏尿及休克等并发症。本实验中无一例受鼠死于并发症。
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实验中的难点和注意事项：①豚鼠的血管非常脆，在切取和修整肾脏时需小心；②在吻合肾静脉时，若供肾来自左侧，肾静脉可能因为壁太薄而贴合，找不到管腔进针，可以在吻合口附近的组织凹处滴1滴生理盐水，将肾静脉端浸入以找到管腔；③判断输尿管口有无排尿应在显微镜下观察，输尿管口应摆在能够折反光的位置。
Calne将异种移植按其种属间的远近分为远离种属间的移植(即discordant)和类似于同种移植时的种属之间较近的移植(即concordant)。前者的移植排斥反应发生得非常快；而后者则相对较缓。豚鼠/大白鼠之间的移植与未来的猪/人之间的异种器官移植均属discordant。本实验所设计的异种肾移植模型具有简便实用、安全可靠的特点，对于深入研究异种器官移植时的有关问题，特别是HAR的发生机制和检测某些免疫抑制手段时，相信会有所帮助。
参考文献
1 Lawson JH，Platt JL.Molecular barriers to xenotransplantation.Transplantation，1996；62(3)：303
, http://www.100md.com
2 Platt JL，Gregory M，Agustin P et al.Transplantation of xenografts：a review of progress.Immunol Taday，1990；11(12)：450
3 Yuan L，Michel V，Mark W.Factors involved in rejection of concordant xenografts in complement-deficient rats.Transplantation，1997；63(12)：1705
4 Platt JL，Bach FH.The barrier to xenotransplantation.Transplantation，1991；52(6)：973
收稿日期：1998-09-28，修回日期：1998-10-23, http://www.100md.com
单位：第二军医大学长征医院肾移植中心 上海，200003
关键词：异种肾移植；超急性排斥；动物模型
异种器官移植是可望缓解可供移植的人类脏器日益短缺矛盾的有效途径
异种器官移植是可望缓解可供移植的人类脏器日益短缺矛盾的有效途径，超急性排斥反应(HAR)是阻止其成功的关键[1]。为研究其发生机制和有效抑制手段，我们建立了将豚鼠肾脏移植至大白鼠颈部的异种、异位肾移植HAR模型，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料 豚鼠，6只，重250g，性别不限(第二军医大学实验动物中心)；SD大鼠，30只，重250 g，雄性(上海计划生育研究所)；手术显微镜(GX-SS，22-3；上海医用光学仪器厂)；HCA离体肾脏保存液(上海市中心血站)；肝素(上海生化试剂三厂)；戊巴比妥钠(第二军医大学朝晖制药厂)。
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1.2 方法
1.2.1 供肾切取 供鼠以戊巴比妥钠(50mg/kg体重)腹腔麻醉，仰卧固定，取腹部正中切口，切开皮肤、腹直肌和腹膜，用自制自动拉钩将腹壁拉向两侧，暴露腹腔内脏器；将肠管推向两侧，充分暴露双侧肾脏及所属区域动脉和静脉。
1.2.2 供肾血管游离 使用棉签和显微镊钝性分离双侧肾动脉、静脉及其分支，游离和其连接的腹主动脉及下腔静脉，除去血管外膜外脂肪和结缔组织，0号丝线结扎分支血管，保留双侧肾动脉、肾静脉及输尿管；于右肾静脉上方以0号丝线围绕下腔静脉、于左肾动脉下方以0号丝线围绕腹主动脉，暂不结扎。
1.2.3 原位灌注 结扎右肾静脉上方的下腔静脉，结扎左肾动脉上方的腹主动脉。轻轻提起左肾动脉下方腹主动脉围绕线，于提起处远端用眼科剪剪一向心端斜切口(腹主动脉勿切断)，向心方向插入自制灌注管，同一水平切开下腔静脉，用0～4℃ HCA肾保存液(内有少许肝素)原位灌注双侧肾脏，至双肾体表面灰白，肾静脉流出的灌注液清亮为止。整块切取双肾及输尿管，注意适当保留输尿管周围结缔组织。
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1.2.4 供肾修整 0～4℃下修整双肾，左肾静脉于腹腔静脉根部结扎离断；于右肾静脉上方结扎下腔静脉、下方保留一段下腔静脉备吻合用。双肾动脉各留一片Carrels瓣后与腹主动脉分离。
1.2.5 供肾移植 受鼠的麻醉及固定方法同上，取颈部正中旁纵切口，长约1.5～2.0 cm。皮下游离出肾窝位置，轻柔分离颈总动脉、颈外静脉。微血管夹阻断近心端血流，远心端结扎、离断；肝素生理盐水冲洗管腔；冰盐水纱布垫保护移植肾。手术显微镜下将肾静脉、受鼠颈外静脉用11-0带针缝合线端-端间断吻合8～12针；肾动脉、颈总动脉用10-0带针缝合线行端-端间断吻合8～10针。开放血流，由输尿管口观测移植肾脏的泌尿情况。将输尿管由颈侧部皮肤穿出，出口处做一乳头并固定两针，乳头部涂少许眼药膏以防干燥坏死，将肾脏放入颈部游离出的肾窝内，与周围组织适当固定。0号丝线缝合切口，术后肌注氨苄青霉素预防感染。受鼠原肾保留。
1.2.6 观测方法 显微镜下由输尿管口观察移植肾的泌尿情况。以停止泌尿1 h以上为发生排斥反应。此时切除移植肾行病理检查。
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1.2.7 实验分组 实验组与对照组均为12只SD大鼠；实验组供鼠为豚鼠；对照组供鼠为同种异体SD大鼠。
2 结 果
2.1 移植肾的泌尿持续时间 自接通血流开始，异种移植肾脏的持续泌尿时间最长为14min，短者为3min，平均泌尿时间为7.1±3.7min，且尿量较少；同种移植肾脏的持续泌尿时间较长，且尿量较多，整个术程均可见输尿管饱满，术后亦可见到造口处不断有尿液涌出，每例肾脏泌尿时间均超过48h，无一例因出血、感染、休克等并发症而死亡。见附表。
附表 移植肾的泌尿持续时间(
±s), 百拇医药
供者
受者
n
泌尿持续时间
豚鼠
SD大鼠
12
7.1±3.7min
SD大鼠
SD大鼠
12
>48 h
2.2 病理所见 同种移植肾动静脉充盈良好，肾体搏动有力，镜下检查未见明显病理改变。异种肾脏接通血流后很快即发生变化：肾表面颜色由红润变为花斑样、绛紫色，表面张力减弱，肾体搏动消失，回流静脉塌陷；镜下可见肾实质广泛出血坏死，肾小球肿胀、小血管内微血栓形成和肾间质少量炎细胞浸润。3 讨 论
, http://www.100md.com
超急性排斥反应常出现在移植肾接通血流后数分钟至几小时内，很少超过术后24～48 h。临床表现主要是少尿或无尿。病理检查可见移植肾呈暗红色、质地柔软、血管扩张、肾小球毛细血管袢和小血管壁有多形核细胞浸润、间质水肿、血管壁坏死、微血栓形成和出血。一个成功的异种器官移植HAR的小动物模型必须具备以下两个特征：第一，排斥反应的发生非常快，常在数小时内发生；第二，在给定的两个不同的种属间移植时，HAR要么在每一例中都发生，要么都不发生[2]。
为研究异种器官移植HAR及其相关问题，建立的小动物模型除了要满足以上要求外，应力求操作简便、结果可靠、观测方便和稳定实用。目前研究异种器官移植HAR所建立的小动物模型多以心脏移植为主，这主要是因为心脏的自律性收缩可为观察其功能状态带来较大方便；将心脏移植至颈部皮下，亦可由体外直接观测心跳及检测心电图使得所观测指标既准确又方便、且有特异性[3]。与此相比，小动物的肾移植要复杂得多。因为大多数操作需进腹腔，增加了手术的难度，也增加了受鼠的死亡率，而且很难以移植肾脏的泌尿功能作为其功能状态的观察指标，所以多以受鼠存活时间的长短作为移植肾失功与否的标志。但这种方法并不能特异描述移植肾的功能状态，因为，即使是切除双肾的大鼠仍可存活六天之久[4]；况且导致死亡的因素很多，除了外科并发症外，尚有感染、失血、休克等。因此，受鼠的存活时间并非移植肾功能状态的良好观测指标。肾脏的独特功能之一是其泌尿功能，若能准确测知其泌尿状况，无疑是监测移植肾功能的最佳方法。然而，以往将输尿管吻合至膀胱壁的手术很难达到这一目的。
, http://www.100md.com
本实验中，我们尝试将豚鼠肾脏移至大白鼠颈部、输尿管行皮下造口，直接由移植肾的泌尿状况判断其功能，建立了便于观察的异种肾移植HAR模型，并取得满意结果。这一模型，满足异种器官移植HAR的小动物模型必须具备的两个特征，与以往的小动物肾移植模型相比，尚有如下特点：①提高供肾的利用率。以往用于移植的肾脏在与腹腔动、静脉行端-侧吻合时，常需保留一段与之相连的供者的腹主动脉和下腔静脉，不得不放弃另一侧肾脏。本模型中，由于受鼠颈部血管可以游离出较长一段无分支的颈总动脉、颈外静脉，术野暴露清楚。按本法修整的双肾均可很好地与受鼠颈部血管吻合，操作亦十分方便。②手术切口小、时间短、受鼠的创伤亦小。大白鼠颈部血管位置较固定，分支少，容易游离及暴露。熟练操作后，一侧肾脏的血管吻合时间可缩短到15～20min。切口小，对受鼠的创伤亦小。③术后监测容易、结果可靠。对移植肾脏的泌尿功能的连续动态观察是判断HAR的良好指标。将输尿管移植至颈部皮外造口，使这种监测手段得以实施。使结果既准确又有特异性。表面涂以少许眼药膏可防干燥、防感染。由对照组移植肾的泌尿时间可知，48h的观察时间基本可以满足对异种器官移植HAR进行多方面研究的需要。④降低受鼠的并发症和死亡率。由于不打开腹腔，对受鼠的主要脏器的影响较小，亦减少了由于创面蒸发所造成的体液丢失。避免了由于操作不便所致的漏血、漏尿及休克等并发症。本实验中无一例受鼠死于并发症。
, 百拇医药
实验中的难点和注意事项：①豚鼠的血管非常脆，在切取和修整肾脏时需小心；②在吻合肾静脉时，若供肾来自左侧，肾静脉可能因为壁太薄而贴合，找不到管腔进针，可以在吻合口附近的组织凹处滴1滴生理盐水，将肾静脉端浸入以找到管腔；③判断输尿管口有无排尿应在显微镜下观察，输尿管口应摆在能够折反光的位置。
Calne将异种移植按其种属间的远近分为远离种属间的移植(即discordant)和类似于同种移植时的种属之间较近的移植(即concordant)。前者的移植排斥反应发生得非常快；而后者则相对较缓。豚鼠/大白鼠之间的移植与未来的猪/人之间的异种器官移植均属discordant。本实验所设计的异种肾移植模型具有简便实用、安全可靠的特点，对于深入研究异种器官移植时的有关问题，特别是HAR的发生机制和检测某些免疫抑制手段时，相信会有所帮助。
参考文献
1 Lawson JH，Platt JL.Molecular barriers to xenotransplantation.Transplantation，1996；62(3)：303
, http://www.100md.com
2 Platt JL，Gregory M，Agustin P et al.Transplantation of xenografts：a review of progress.Immunol Taday，1990；11(12)：450
3 Yuan L，Michel V，Mark W.Factors involved in rejection of concordant xenografts in complement-deficient rats.Transplantation，1997；63(12)：1705
4 Platt JL，Bach FH.The barrier to xenotransplantation.Transplantation，1991；52(6)：973
收稿日期：1998-09-28，修回日期：1998-10-23, http://www.100md.com