环氧化酶及5-脂氧化酶对肾炎模型中肾小球iNOS表达的影响
作者：吴升华 张淑英 林致华 Elias A.Lianos*
单位：南京医科大学第一附属医院儿科 南京，210029
关键词：一氧化氮合成酶；环氧化酶；肾炎
肾脏病与透析肾移植杂志990108 摘 要 目的：研究花生四烯酸(AA)环氧化酶产物及5-脂氧化酶产物对大鼠加速性肾毒性血清性肾炎(NSN)中肾小球诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)表达的影响。 方法：制备NSN大鼠模型后，应用消炎痛抑制AA环氧化酶，应用MK-0951抑制AA的5-脂氧化酶，观察对肾小球iNOS表达的影响。 结果：在NSN大鼠，应用消炎痛抑制环氧化酶，可减少肾小球合成的前列腺素(PG)E2及血栓素(TX)B2，使肾小球iNOS表达增强，尿亚硝酸盐(NO-2)排出增多；应用MK-0951抑制5-脂氧化酶，可减少肾小球合成的白三烯(LT)B4，也使肾小球iNOS表达增强，尿NO-2增多。 结论：NSN大鼠肾小球合成的环氧化酶及5-脂氧化酶产物PGE2、TX及LT有抑制肾小球iNOS表达的作用。
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EFFECTS OF CYCLOOXYGENATION AND 5-LIPOXYGENATION ON GLOMERULAR EXPRESSION OF THE GENE FOR INDUCIBLE NITRIC OXIDE SYNTHASE IN EXPERIMENTAL GLOMERULONEPHRITIS
Wu Shenghua，Zhang Shuying，Lin Zhihua，Elias A Lianos
Department of Pediatrics，the First affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing，210029
*Department of Nephrology，Wisconsin School of Medicine，U.S.A.
, 百拇医药
OBJECTIVE To investigate the effects of arachidonate cyclooxygenation and 5-lipoxygenation on golmerular expression of the gene for inducible nitric oxide synthesase(iNOS)in rats with accelerated nephrotoxic serum nephritis(NSN).
METHODOLOGY The model of NSN was established in male SD rats with peritoneal injection of rabbit IgG and Freund complete adjuvant followed by intravenous injection of anti-rabbit GBM antibody.Rats of NSN were grouped into：(1)NSN group(n＝8)；(2)NSN+INDO group (n＝8)in which NSN rats were pretreated with indomethacin (3mg/kg，a cyclooxygenase inhibitor)intravenously one hour before the injection of anti-GBM antibody；and (3) NSN+MK(n＝8)group in which the NSN rats were pretreated with MK-0951(a 5-lipoxygenase inhibitor)intravenously one hour before the injection of anti-GBM antibody.Six rats administered with normal rabbit serum were set as the control.HPLC and radioimmunoassay were used in the determination of prostaglandin E2(PGE2)，leukotrience B4(LTB4)and thronmboxane B2(TXB2).Glomerular expression of iNOS was determined by RNAase protection assay.
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RESULTS Enhanced glomerular synthesis of PGE2 and TXB2，increased the urinary excretion of nitrite (NO2)，and up-regulated glomerular expression of iNOS mRNA were found in NSN group as compared to the control.In NSN+INDO group in which cyclooxygenation was inhibited，glomerular synthesis of PGE2 and TXB2 was suppresseds glomerular expression of iNOS enhanced，glomerular synthesis of LTB4 and urinary excretion of NO2 increased.Pretreatment of nephritic rats with MK-0951，a 5-lipoxygenase inhibitor，reduced the enhanced glomerular synthesis of LTB4，stimulated the iNOS induction and increased the urinary excretion of NO2.
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CONCLUSION These results indicated that cyclooxygenation and 5-lipoxygenation inhibit the expression of iNOS in glomeruli of rats with NSN.
Key words Nitric oxide synthase cyclooxygenase lipoxygenase
一氧化氮合成酶(NOS)主要分为两大类，原生型NOS(cNOS)及诱生型NOS(iNOS)，后者可受多种细胞因子诱导而激活，生成一氧化氮(NO)，参与肾脏疾病的发生与发展。目前花生四烯酸(AA)产物对iNOS是否具有调节作用的报道较少。本文利用大鼠NSN模型，探讨环氧化酶及5-脂氧化酶产物对肾小球iNOS表达的影响。
1 材料和方法
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1.1 制备NSN模型 采用SD雄性大鼠，体重150～200g，腹腔注射兔IgG 1mg与Freund’s完全佐剂1∶1的混合乳剂，5天后静注兔抗鼠肾小球基底膜(GBM)抗体1.5ml/kg(EA Lianos Lab)，对照组静注等剂量正常兔血清(NRS)。静注后收集24h尿，然后处死。
1.2 肾组织检查 取小部分肾皮质作免疫萤光检查以明确抗GBM抗体在肾小球的沉积[1]。应用异硫氰酸荧光素标记的抗大鼠巨噬细胞ED1抗原的单克隆抗体(Accurate Co，USA)进行肾皮质的免疫荧光染色，阳性细胞为巨噬细胞，每只鼠计数25～30个肾小球。
1.3 尿液检查 尿蛋白测定应用Lowry法。尿NO-2测定应用Griess法[2]在0.1ml尿液中加入0.1ml Griess试剂(1%对氨基苯磺酰胺，0.1%萘乙二胺溶于5%磷酸中)，室温中放置10min后在酶标仪上以550 nm波长测定吸光度，以亚硝酸盐为标准制作标准曲线。
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1.4 肾小球合成AA产物测定[3] 用系列过筛法分离大鼠肾小球，混悬于2ml的RPMI-1640培养液中，37℃下孵育30min，加入磷脂酶A2活化剂A23187，再孵育45min后加入甲酸及乙醇，在4℃下抽提18h，用Lowry法测定肾小球沉淀物的蛋白量，将抽提物在真空下干燥，加入甲醇合剂后注入梯度高效液相层析系统(Beckman 112型)，用可变波长吸附检验器(Spectroflow 773型) 检出及分离各种AA产物，用放免法测定PGE2、TXB2及LTB4[3]，结果表示为ng/mg肾小球蛋白。
1.5 肾小球iNOS表达测定 应用RNA酶保护分析法。用系列过筛法及二乙基焦碳酸盐处理的磷酸缓冲液分离大鼠的肾小球，以异硫氰酸胍一步法提取肾小球RNA，用紫外分光光度计测定产量(A 260nm)及纯度(A 260/280nm)。反义RNA探针通过SP6 RNA聚合酶系合成。将222 base的iNOS的cDNA(Carl Nathan教授赠予，康奈尔大学医学院)克隆入SP6表达载体pSP64中(Promega产品)，线性化之后在SP6 RNA聚合酶及[α-32P-GTP](3000Ci/mmol)作用下获得32P标记的反义mRNA样探针，放射活性>109/min.μg-1。将肾小球RNA样品(20μg/鼠)加入微量离心管中，真空下冷冻干燥，加入RNA探针后，将杂交缓冲液加至50μl，85℃水浴中孵育15min，45℃中18h，经RNA酶ONETM(promega产品)消化，加入SDS及蛋白酶K，37℃孵育15min，加入酵母tRNA后经酚/氯仿溶液抽提，乙醇沉淀，以5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，19h放射自显影后定影。应用TECBIAS-6803计算机图象分析系统，对电泳带扫描，以得出光密度值。
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1.6 实验分组 ①正常兔血清对照组(NRS)6只大鼠；②肾炎组(NSN)8只大鼠；③消炎痛处理的肾炎组(NSN+INDO)8只大鼠，应用消炎痛抑制环氧化酶，在静注抗GBM抗体之前1 h静注消炎痛 3mg/kg；④MK-0951处理的肾炎组(NSN+MK)8只大鼠，应用MK-0951(Merck-Frosst Int，Canada)抑制5-脂氧化酶，在静注抗GBM抗体之前 1h给大鼠插胃管注入MK-0951，8mg/kg。
1.7 统计处理 应用单因素方差分析及非配对t检验。结果以均数±标准差表示。
2 结 果
如附表所示，在发病后 24h的NSN大鼠，尿蛋白及尿NO-2升高，肾小球巨噬细胞浸润增加，肾小球合成的PGE2、TXB2及LTB4升高。应用消炎痛处理肾炎大鼠，抑制了肾小球合成PGE2及TXB2，对LTB4无影响，尿NO-2进一步升高。应用MK-0951处理肾炎大鼠，抑制了肾小球LTB4合成，对PGE2、TXB2无影响，尿NO-2进一步升高。
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附表 各组大鼠的尿蛋白、尿NO-2、肾小球巨噬细胞及肾小球AA产物的比较(
±s) 例数
NRS
NSN
NSN+INDO
NSN+MK
6
8
8
8
尿蛋白(mg/24h)
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15.8±2.5
114.4±9.4*
121.6±18.2*
108.4±57.3*
尿NO-2(μmol/24h)
0.21±0.10
8.22±2.45*
12.16±2.74*△
14.41±3.71*△
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ED1(+)细胞/肾小球
3.2±1.1
25.1±2.6*
26.1±2.0*
22.9±1.8*
PGE2(ng/mg肾小球蛋白)
4.3±0.5
7.5±1.3*
4.2±1.1△
6.9±1.4*
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TXB2(ng/mg肾小球蛋白)
5.7±1.8
15.5±2.1*
4.4±1.9△
14.5±2.1*
LTB4(ng/mg肾小球蛋白)
1.4±0.6
27.2±4.1*
24.9±5.8*
13.7±3.2*△
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*P<0.05与NRS组比较，△P<0.05与NSN组比较 附图为各组大鼠肾小球iNOS基因表达变化，在NSN发病后24h可见肾小球iNOS表达，应用消炎痛或MK-0951后这种表达进一步加强，以MK-0951更为显著。
附图 各组大鼠肾小球iNOS的表达
3 讨 论
肾脏中iNOS存在于巨噬细胞、肾小球内皮细胞、系膜细胞及脏层上皮细胞、肾脏血管及集合管等处，在病理状况下iNOS受到肿瘤坏死因子、白介素(IL)-1等诱导而活化，产生大量NO；糖皮质激素、转化生长因子β等可抑制iNOS表达[4～6]。目前关于AA产物对iNOS表达的作用报道较少。NSN为依赖于巨噬细胞的肾小球炎症。在发病后24 h，肾小球iNOS表达及NO合成、尿NO-2均达到高峰，其来源主要为巨噬细胞[2，7]。我们曾证实，在NSN发病后24 h内，肾小球合成的PGE2、TXB2及LTB4等AA产物增多[1，3，8]。AA产物与NO合成可能存在相互作用，而发病后 24h的NSN提供了一个研究这一作用的好模型。
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在对系膜细胞的体外研究中，Tetsuka[9]发现PGE2可抑制IL-1所致的iNOS表达，而PGI2可促进IL-1所致的iNOS表达，应用消炎痛抑制环氧化酶，可促进IL-1所致的iNOS表达及NO合成，说明环氧化酶产物中以PGE2抑制iNOS表旓的作用占主导，而PGI2的作用较小。Fujihara[10]应用环氧化酶抑制剂nitroflurbiprofen处理肾小球硬化模型，可促进肾脏NO合成。Selvemini[11]证实AA本身可促进兔肾脏cNOS表达及NO合成。迄今为止，关于环氧化酶产物TX以及5-脂氧化酶产物LT对NOS的作用尚无报道。本文应用消炎痛抑制环氧化酶，减少了NSN大鼠肾小球合成的PGE2及TXB2(反映TXA2水平)，使iNOS表达增强，尿NO-2增多，提示除PGE2外，TXA2、TXB2也有抑制iNOS表达的作用。在应用MK-0951后NSN大鼠肾小球LTB4合成减少，iNOS表达加强，尿NO-2增多，提示5-脂氧化酶产物LT如LTB2、LTC4及LTD4也可有抑制iNOS表达的作用。
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关于AA产物调节iNOS表达的机制，Tetsuka认为，PGE2可通过活化Ca2+/磷酸肌醇途径激活蛋白激酶C(PKC)，进而抑制iNOS表达，而PGI2通过激活腺苷酸环化酶使环磷酸腺苷(cAMP)增加，通过依赖cAMP的蛋白激酶磷酸化使iNOS表达加强[9]。我们已证实，TXA2促进磷脂酶C活化，进而合成磷酸肌醇及二酯酰甘油，激活PKC[12]。因此，TXA2抑制iNOS表达的机制与PGE2类似。5-脂氧化酶产物LT包括LTB4、LTC4及LTD4，后二者活化PKC机制与TXA2相似，LTB4不活化PKC[13]，这三种LT中何种对iNOS表达有抑制作用及作用机制有待进一步探讨。
NSN中肾小球iNOS及NO合成主要来自巨噬细胞[2，7]。本文中应用消炎痛及MK-0951处理NSN大鼠后，肾小球巨噬细胞浸润变化不显著，提示iNOS表达增强不是由于肾小球巨噬细胞增多所致，而是由于其本身的表达上调。NO有扩血管、抑制肾小球硬化的作用[14]。我们也证实TX合成酶抑制剂或5-脂氧化酶抑制剂可缓解NSN的肾功能减退及肾小球细胞增殖[1，3，8]。本文结果提示，抑制TX及LT的合成可促进NO产生，这对于改善肾功能及减少肾小球硬化将是有益的。
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*美国威斯康辛医学院肾科
参考文献
1 Wu SH，Bresnahan BA，Lianos EA.Hemodynamic role of arachidonate 12- and 5-lipoxygenases in nephrotoxic serum nephritis.Kidney Int，1993；43(6)：1280
2 Cattell V，Cook T，Moncada S.Glomeruli synthesize nitrite in experimental nephrotoxic nephritis.Kidney Int，1990；38：1056
3 吴升华，Hucke B.花生四烯酸氧化产物对肾毒性肾炎肾脏血液动力学的影响.中国病理生理杂志，1995；11(1)：66
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4 陈慧勇，吴兆龙.正常肾脏中NO生物合成和稳定内环境的作用.国外医学泌尿系统分册，1998；18(1)：1
5 唐锦辉.一氧化氮与肾脏疾病研究进展.国外医学泌尿系统分册，1996；16(5)：216
6 阳 晓.一氧化氮与慢性肾功能衰竭.国外医学泌尿系统分册，1996；16(5)：219
7 Cook HT，Ebrahim H，Jansen AS et al.Expression of the gene for inducible nitric oxide synthase in experimental glomerulonephritis in the rat.Clin Exp Immunol，1994；97：315
8 Wu SH，Lianos EA.Modulatory effect of arachidonate 5-lipoxygenation on glomerular cell proliferation in nephrotoxic serum nephritis.J Lab Clin Med，1993；122(6)：703
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9 Tetsuka T，Daphna-Iken D，Srivastava SK et al.Cross-talk between cyclooxygenase and nitric oxide pathways：prostaglandin E2 negatively modulates induction of nitric oxide synthase by interleukin 1.Proc Natl Acad Sci USA，1994；91：12168
10 Fujihara CK，Malheiros DMAC，Antunes E et al.Nitric oxide donation exacerbates，while cyclooxygenase inhibition ameliorates，glomerulosclerosis in the remnant model.J Am Soc Nephrol，1996；7(9)：1854
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11 Salvemini D，Seibert K，Masferrer JL et al.Endogenous nitric oxide enhances prostaglandin production in a model of renal inflammation.J Clin Invest，1994；93：1940
12 吴升华，练棣华，林致华.U46619双向调节系膜细胞DNA合成的研究.细胞生物学杂志，1996；18(1)：34
13 吴升华，Kelefiotis DP.花生四烯酸产物对系膜细胞增殖作用的研究.中国病理生理杂志，1994；10(6)：639
14 王东红.一氧化氮与肾小球硬化.国外医学泌尿系统分册，1998；18(1)：6
收稿日期：1998-10-09，修回日期：1998-11-28, 百拇医药(吴升华 张淑英 林致华 Elias A.Lianos*)
单位：南京医科大学第一附属医院儿科 南京，210029
关键词：一氧化氮合成酶；环氧化酶；肾炎
肾脏病与透析肾移植杂志990108 摘 要 目的：研究花生四烯酸(AA)环氧化酶产物及5-脂氧化酶产物对大鼠加速性肾毒性血清性肾炎(NSN)中肾小球诱生型一氧化氮合成酶(iNOS)表达的影响。 方法：制备NSN大鼠模型后，应用消炎痛抑制AA环氧化酶，应用MK-0951抑制AA的5-脂氧化酶，观察对肾小球iNOS表达的影响。 结果：在NSN大鼠，应用消炎痛抑制环氧化酶，可减少肾小球合成的前列腺素(PG)E2及血栓素(TX)B2，使肾小球iNOS表达增强，尿亚硝酸盐(NO-2)排出增多；应用MK-0951抑制5-脂氧化酶，可减少肾小球合成的白三烯(LT)B4，也使肾小球iNOS表达增强，尿NO-2增多。 结论：NSN大鼠肾小球合成的环氧化酶及5-脂氧化酶产物PGE2、TX及LT有抑制肾小球iNOS表达的作用。
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EFFECTS OF CYCLOOXYGENATION AND 5-LIPOXYGENATION ON GLOMERULAR EXPRESSION OF THE GENE FOR INDUCIBLE NITRIC OXIDE SYNTHASE IN EXPERIMENTAL GLOMERULONEPHRITIS
Wu Shenghua，Zhang Shuying，Lin Zhihua，Elias A Lianos
Department of Pediatrics，the First affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing，210029
*Department of Nephrology，Wisconsin School of Medicine，U.S.A.
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OBJECTIVE To investigate the effects of arachidonate cyclooxygenation and 5-lipoxygenation on golmerular expression of the gene for inducible nitric oxide synthesase(iNOS)in rats with accelerated nephrotoxic serum nephritis(NSN).
METHODOLOGY The model of NSN was established in male SD rats with peritoneal injection of rabbit IgG and Freund complete adjuvant followed by intravenous injection of anti-rabbit GBM antibody.Rats of NSN were grouped into：(1)NSN group(n＝8)；(2)NSN+INDO group (n＝8)in which NSN rats were pretreated with indomethacin (3mg/kg，a cyclooxygenase inhibitor)intravenously one hour before the injection of anti-GBM antibody；and (3) NSN+MK(n＝8)group in which the NSN rats were pretreated with MK-0951(a 5-lipoxygenase inhibitor)intravenously one hour before the injection of anti-GBM antibody.Six rats administered with normal rabbit serum were set as the control.HPLC and radioimmunoassay were used in the determination of prostaglandin E2(PGE2)，leukotrience B4(LTB4)and thronmboxane B2(TXB2).Glomerular expression of iNOS was determined by RNAase protection assay.
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RESULTS Enhanced glomerular synthesis of PGE2 and TXB2，increased the urinary excretion of nitrite (NO2)，and up-regulated glomerular expression of iNOS mRNA were found in NSN group as compared to the control.In NSN+INDO group in which cyclooxygenation was inhibited，glomerular synthesis of PGE2 and TXB2 was suppresseds glomerular expression of iNOS enhanced，glomerular synthesis of LTB4 and urinary excretion of NO2 increased.Pretreatment of nephritic rats with MK-0951，a 5-lipoxygenase inhibitor，reduced the enhanced glomerular synthesis of LTB4，stimulated the iNOS induction and increased the urinary excretion of NO2.
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CONCLUSION These results indicated that cyclooxygenation and 5-lipoxygenation inhibit the expression of iNOS in glomeruli of rats with NSN.
Key words Nitric oxide synthase cyclooxygenase lipoxygenase
一氧化氮合成酶(NOS)主要分为两大类，原生型NOS(cNOS)及诱生型NOS(iNOS)，后者可受多种细胞因子诱导而激活，生成一氧化氮(NO)，参与肾脏疾病的发生与发展。目前花生四烯酸(AA)产物对iNOS是否具有调节作用的报道较少。本文利用大鼠NSN模型，探讨环氧化酶及5-脂氧化酶产物对肾小球iNOS表达的影响。
1 材料和方法
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1.1 制备NSN模型 采用SD雄性大鼠，体重150～200g，腹腔注射兔IgG 1mg与Freund’s完全佐剂1∶1的混合乳剂，5天后静注兔抗鼠肾小球基底膜(GBM)抗体1.5ml/kg(EA Lianos Lab)，对照组静注等剂量正常兔血清(NRS)。静注后收集24h尿，然后处死。
1.2 肾组织检查 取小部分肾皮质作免疫萤光检查以明确抗GBM抗体在肾小球的沉积[1]。应用异硫氰酸荧光素标记的抗大鼠巨噬细胞ED1抗原的单克隆抗体(Accurate Co，USA)进行肾皮质的免疫荧光染色，阳性细胞为巨噬细胞，每只鼠计数25～30个肾小球。
1.3 尿液检查 尿蛋白测定应用Lowry法。尿NO-2测定应用Griess法[2]在0.1ml尿液中加入0.1ml Griess试剂(1%对氨基苯磺酰胺，0.1%萘乙二胺溶于5%磷酸中)，室温中放置10min后在酶标仪上以550 nm波长测定吸光度，以亚硝酸盐为标准制作标准曲线。
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1.4 肾小球合成AA产物测定[3] 用系列过筛法分离大鼠肾小球，混悬于2ml的RPMI-1640培养液中，37℃下孵育30min，加入磷脂酶A2活化剂A23187，再孵育45min后加入甲酸及乙醇，在4℃下抽提18h，用Lowry法测定肾小球沉淀物的蛋白量，将抽提物在真空下干燥，加入甲醇合剂后注入梯度高效液相层析系统(Beckman 112型)，用可变波长吸附检验器(Spectroflow 773型) 检出及分离各种AA产物，用放免法测定PGE2、TXB2及LTB4[3]，结果表示为ng/mg肾小球蛋白。
1.5 肾小球iNOS表达测定 应用RNA酶保护分析法。用系列过筛法及二乙基焦碳酸盐处理的磷酸缓冲液分离大鼠的肾小球，以异硫氰酸胍一步法提取肾小球RNA，用紫外分光光度计测定产量(A 260nm)及纯度(A 260/280nm)。反义RNA探针通过SP6 RNA聚合酶系合成。将222 base的iNOS的cDNA(Carl Nathan教授赠予，康奈尔大学医学院)克隆入SP6表达载体pSP64中(Promega产品)，线性化之后在SP6 RNA聚合酶及[α-32P-GTP](3000Ci/mmol)作用下获得32P标记的反义mRNA样探针，放射活性>109/min.μg-1。将肾小球RNA样品(20μg/鼠)加入微量离心管中，真空下冷冻干燥，加入RNA探针后，将杂交缓冲液加至50μl，85℃水浴中孵育15min，45℃中18h，经RNA酶ONETM(promega产品)消化，加入SDS及蛋白酶K，37℃孵育15min，加入酵母tRNA后经酚/氯仿溶液抽提，乙醇沉淀，以5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，19h放射自显影后定影。应用TECBIAS-6803计算机图象分析系统，对电泳带扫描，以得出光密度值。
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1.6 实验分组 ①正常兔血清对照组(NRS)6只大鼠；②肾炎组(NSN)8只大鼠；③消炎痛处理的肾炎组(NSN+INDO)8只大鼠，应用消炎痛抑制环氧化酶，在静注抗GBM抗体之前1 h静注消炎痛 3mg/kg；④MK-0951处理的肾炎组(NSN+MK)8只大鼠，应用MK-0951(Merck-Frosst Int，Canada)抑制5-脂氧化酶，在静注抗GBM抗体之前 1h给大鼠插胃管注入MK-0951，8mg/kg。
1.7 统计处理 应用单因素方差分析及非配对t检验。结果以均数±标准差表示。
2 结 果
如附表所示，在发病后 24h的NSN大鼠，尿蛋白及尿NO-2升高，肾小球巨噬细胞浸润增加，肾小球合成的PGE2、TXB2及LTB4升高。应用消炎痛处理肾炎大鼠，抑制了肾小球合成PGE2及TXB2，对LTB4无影响，尿NO-2进一步升高。应用MK-0951处理肾炎大鼠，抑制了肾小球LTB4合成，对PGE2、TXB2无影响，尿NO-2进一步升高。
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附表 各组大鼠的尿蛋白、尿NO-2、肾小球巨噬细胞及肾小球AA产物的比较(
±s) 例数NRS
NSN
NSN+INDO
NSN+MK
6
8
8
8
尿蛋白(mg/24h)
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15.8±2.5
114.4±9.4*
121.6±18.2*
108.4±57.3*
尿NO-2(μmol/24h)
0.21±0.10
8.22±2.45*
12.16±2.74*△
14.41±3.71*△
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ED1(+)细胞/肾小球
3.2±1.1
25.1±2.6*
26.1±2.0*
22.9±1.8*
PGE2(ng/mg肾小球蛋白)
4.3±0.5
7.5±1.3*
4.2±1.1△
6.9±1.4*
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TXB2(ng/mg肾小球蛋白)
5.7±1.8
15.5±2.1*
4.4±1.9△
14.5±2.1*
LTB4(ng/mg肾小球蛋白)
1.4±0.6
27.2±4.1*
24.9±5.8*
13.7±3.2*△
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*P<0.05与NRS组比较，△P<0.05与NSN组比较 附图为各组大鼠肾小球iNOS基因表达变化，在NSN发病后24h可见肾小球iNOS表达，应用消炎痛或MK-0951后这种表达进一步加强，以MK-0951更为显著。
附图 各组大鼠肾小球iNOS的表达
3 讨 论
肾脏中iNOS存在于巨噬细胞、肾小球内皮细胞、系膜细胞及脏层上皮细胞、肾脏血管及集合管等处，在病理状况下iNOS受到肿瘤坏死因子、白介素(IL)-1等诱导而活化，产生大量NO；糖皮质激素、转化生长因子β等可抑制iNOS表达[4～6]。目前关于AA产物对iNOS表达的作用报道较少。NSN为依赖于巨噬细胞的肾小球炎症。在发病后24 h，肾小球iNOS表达及NO合成、尿NO-2均达到高峰，其来源主要为巨噬细胞[2，7]。我们曾证实，在NSN发病后24 h内，肾小球合成的PGE2、TXB2及LTB4等AA产物增多[1，3，8]。AA产物与NO合成可能存在相互作用，而发病后 24h的NSN提供了一个研究这一作用的好模型。
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在对系膜细胞的体外研究中，Tetsuka[9]发现PGE2可抑制IL-1所致的iNOS表达，而PGI2可促进IL-1所致的iNOS表达，应用消炎痛抑制环氧化酶，可促进IL-1所致的iNOS表达及NO合成，说明环氧化酶产物中以PGE2抑制iNOS表旓的作用占主导，而PGI2的作用较小。Fujihara[10]应用环氧化酶抑制剂nitroflurbiprofen处理肾小球硬化模型，可促进肾脏NO合成。Selvemini[11]证实AA本身可促进兔肾脏cNOS表达及NO合成。迄今为止，关于环氧化酶产物TX以及5-脂氧化酶产物LT对NOS的作用尚无报道。本文应用消炎痛抑制环氧化酶，减少了NSN大鼠肾小球合成的PGE2及TXB2(反映TXA2水平)，使iNOS表达增强，尿NO-2增多，提示除PGE2外，TXA2、TXB2也有抑制iNOS表达的作用。在应用MK-0951后NSN大鼠肾小球LTB4合成减少，iNOS表达加强，尿NO-2增多，提示5-脂氧化酶产物LT如LTB2、LTC4及LTD4也可有抑制iNOS表达的作用。
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关于AA产物调节iNOS表达的机制，Tetsuka认为，PGE2可通过活化Ca2+/磷酸肌醇途径激活蛋白激酶C(PKC)，进而抑制iNOS表达，而PGI2通过激活腺苷酸环化酶使环磷酸腺苷(cAMP)增加，通过依赖cAMP的蛋白激酶磷酸化使iNOS表达加强[9]。我们已证实，TXA2促进磷脂酶C活化，进而合成磷酸肌醇及二酯酰甘油，激活PKC[12]。因此，TXA2抑制iNOS表达的机制与PGE2类似。5-脂氧化酶产物LT包括LTB4、LTC4及LTD4，后二者活化PKC机制与TXA2相似，LTB4不活化PKC[13]，这三种LT中何种对iNOS表达有抑制作用及作用机制有待进一步探讨。
NSN中肾小球iNOS及NO合成主要来自巨噬细胞[2，7]。本文中应用消炎痛及MK-0951处理NSN大鼠后，肾小球巨噬细胞浸润变化不显著，提示iNOS表达增强不是由于肾小球巨噬细胞增多所致，而是由于其本身的表达上调。NO有扩血管、抑制肾小球硬化的作用[14]。我们也证实TX合成酶抑制剂或5-脂氧化酶抑制剂可缓解NSN的肾功能减退及肾小球细胞增殖[1，3，8]。本文结果提示，抑制TX及LT的合成可促进NO产生，这对于改善肾功能及减少肾小球硬化将是有益的。
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*美国威斯康辛医学院肾科
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收稿日期：1998-10-09，修回日期：1998-11-28, 百拇医药(吴升华 张淑英 林致华 Elias A.Lianos*)