Raf-1蛋白激酶研究新进展
作者：李 彪 李晓玫
单位：
关键词：Raf-1蛋白激酶；信号传导；细胞增殖
细胞外刺激引起的细胞异常增殖和细胞外基质的过度积聚是多种增殖
细胞外刺激引起的细胞异常增殖和细胞外基质的过度积聚是多种增殖、硬化性疾病(如炎症、肿瘤等)的病理基础。目前已发现了多条与细胞增殖或分化相关的细胞内信号传导途径，为有关疾病的研究开辟了新的领域。细胞作为一个整体对外界刺激的反应是其自身整体协调的结果，对各类信号传导途径之间的交互作用进行研究并寻找其交联点，将有助于从整体上对细胞的生物学行为加以调控并找出相关疾病防治的突破口。在目前已知的与细胞增殖分化调控密切相关的信号传导途径中，Raf-1蛋白激酶是酪氨酸激酶相关的信号传导途径中的重要信号分子之一。近年来的研究发现，Raf-1蛋白激酶还可能是与其它信号途径相关的交联点之一，它可能通过与其它信号分子的相互作用或相互调节，参与多种细胞生物学过程的信号传导及其调控。
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1 Raf-1蛋白激酶的分子生物学特征[1]
Raf蛋白激酶是由raf基因编码的蛋白产物，由648个氨基酸组成，分子量为70 000～74 000，活化后具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性。其分子结构中含有3个保守区，分别为CR1(61～194)、CR2(254～269)、CR3(335～627)。CR1位于其分子的氨基端，富含半胱氨酸，含有锌指样结构，与蛋白激酶C的配体结合区结构相似，是活化的Ras与Raf-1蛋白激酶结合的主要部位。CR2亦靠近氨基端，富含丝、苏氨酸。CR3位于其分子的羧基端，是蛋白激酶的催化功能区。
2 Raf-1蛋白激酶的激活方式及其特征
许多研究证实，酪氨酸蛋白激酶的活化对Raf-1激活具有重要作用。在细胞Ras/Raf-1增殖信号途径中，生长因子(如PDGF等)结合于受体后，使受体二聚化，激活特异的受体酪氨酸激酶，从而使受体上相应的酪氨酸残基磷酸化。磷酸化的酪氨酸被含有SH2的Grb2-Sos蛋白复合物所结合，其后，Sos可使与Ras结合的GDP转变为GTP因而使Ras活化，活化的Ras进一步激活Raf-1。Raf-1被激活后继续激活其下游的丝裂素活化蛋白激酶激酶(MEK)和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)，最终通过对转录调节因子表达的影响而将细胞增殖信号传递到细胞核内[2]。在这一信号传导过程中，Raf-1能否被激活、是否能够准确地下传信号对于细胞是否出现受刺激后的增殖效应至关重要。此外，还有研究表明，非受体酪氨酸激酶如Src、Fyn、Lck等也可通过其SH2结构域与Raf-1结合，并可磷酸化其340、341位的酪氨酸，使之改变构象而被激活[3]。
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Ras与Raf-1常以复合物形式存在。其主要结合位点可能为Raf-1之Arg89。多数研究表明，尽管Raf-1与Ras常结合在一起，但Ras并非直接激活Raf-1。如Stokoe等[4]将起膜定位作用但并无Ras活性的k-Ras羧基端17个氨基酸的基因序列与Raf-1之羧基端融合，并表达出融合蛋白RafCAAX，发现其酶活性与和肿瘤源性Ras共表达的Raf-1活性相似，而非膜定位的另一融合蛋白Raf6QCAAX并无Raf-1活性，因而提出Ras可能仅具有使Raf-1由胞浆重新定位于胞膜的作用。Marais等人的实验进一步证实了以上观点[3]。他们认为Raf-1的激活分为两步，第一步是Ras与Raf-1结合并将Raf-1固定于膜内侧，第二步才是Raf-1的活化，其活化可由酪氨酸激酶来完成。目前已证实，在Ras/Raf-1信号途径中，Ras主要是催化胞浆中的Raf-1使之固定于细胞膜内侧，Raf-1一旦与胞膜的脂质层相互作用即可暴露出其激酶功能区，进一步可能由其它非Ras依赖的信号分子(如蛋白激酶C、酪氨酸激酶、其它丝/苏氨酸激酶、磷酸酶或配体等)而激活。
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通过对蛋白质序列分析、合成肽的磷酸化检测及利用点突变致其磷酸化丧失等方法对Raf-1进行分析，已发现Raf-1的第43位、第259位及第621位三个位置是其主要的丝氨酸磷酸化位点，而第340、341位酪氨酸是其主要的酪氨酸磷酸化位点。不同位点的磷酸化对Raf-1活性可能具有不同的意义。
目前还发现了一些与Raf-1结合及其激活调节相关的细胞内蛋白，如14-3-3、HSP90、HSP50、Bag-1、KSR等。这些蛋白与Raf-1结合，可能对维持Raf-1的稳定性及其细胞内定位十分重要，但它们均不能直接活化Raf-1。最近有人报道凋亡抑制基因bcl-2的结合蛋白Bag-1能结合于Raf-1之催化活性区，并活化之。另外，还有人发现磷酯酸能够活化Raf-1，Raf-1蛋白之二聚化亦能够活化其自身，虽然有依赖RAS与否的争论。由此可见Raf-1激活的机制不但具有细胞与刺激物特异性，而且可能是多层次、多种因素相互作用的结果。
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3 Raf-1激酶在不同信号传导途径及其交联中的作用
目前的研究发现，Raf-1除了本身在Ras/Raf-1/MAPK(ERK)细胞增殖信号传导途径中扮演重要角色之外，还与其它多种信号传导途径存在着相互调节，很可能是多种信号传导途径之间相互作用的交联信号之一(见附图)。
附图 Raf-1在细胞信号传导途径中的位置及作用
3.1 G蛋白相关信号途径 G蛋白是一种跨膜蛋白，它一端连接细胞膜受体，另一端连接胞膜内侧的蛋白酶分子，如AC、PLC、PLA2等，将细胞外的信息转变为胞膜内的第二信使。G蛋白由α、β、γ三个亚单位组成。在与G蛋白偶联相关的信号传导途径中，Raf-1可与G蛋白βγ亚单位、PKC或PKA发生相互作用。如Pumiglia等[5]利用酵母双杂交技术筛选到一个能与Raf-1结合的克隆，其编码产物为Gβ的C端半部，进一步研究表明Gβγ能够结合于Raf-1的136～239氨基酸区域，并在人肾293T细胞得到了Raf-1与Gβγ的复合物，为Gβγ与Raf-1之间的相互作用提供了直接证据。但也有人认为Gβγ是通过PH接头与RAS蛋白相互作用。
3.2 PKC 在小鼠心肌细胞、MDCK、CHO及小鼠VSMC等许多细胞株，均证明PKC能够活化Raf-1激酶，从而介导细胞对有丝分裂原的反应。PKC可能作用于不同的Raf-1位点。Kolch等[6]利用PKCα对合成肽及点突变肽的作用结合PKCα与Raf-1在SF9细胞的共表达，证明499位丝氨酸对于PKCα对Raf-1的活化及其转化能力是必需的。Carroll等[7]合成了一系列含有PKC底物共有序列的多肽片段，然后用PKC对其进行, 百拇医药
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关键词：Raf-1蛋白激酶；信号传导；细胞增殖
细胞外刺激引起的细胞异常增殖和细胞外基质的过度积聚是多种增殖
细胞外刺激引起的细胞异常增殖和细胞外基质的过度积聚是多种增殖、硬化性疾病(如炎症、肿瘤等)的病理基础。目前已发现了多条与细胞增殖或分化相关的细胞内信号传导途径，为有关疾病的研究开辟了新的领域。细胞作为一个整体对外界刺激的反应是其自身整体协调的结果，对各类信号传导途径之间的交互作用进行研究并寻找其交联点，将有助于从整体上对细胞的生物学行为加以调控并找出相关疾病防治的突破口。在目前已知的与细胞增殖分化调控密切相关的信号传导途径中，Raf-1蛋白激酶是酪氨酸激酶相关的信号传导途径中的重要信号分子之一。近年来的研究发现，Raf-1蛋白激酶还可能是与其它信号途径相关的交联点之一，它可能通过与其它信号分子的相互作用或相互调节，参与多种细胞生物学过程的信号传导及其调控。
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1 Raf-1蛋白激酶的分子生物学特征[1]
Raf蛋白激酶是由raf基因编码的蛋白产物，由648个氨基酸组成，分子量为70 000～74 000，活化后具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性。其分子结构中含有3个保守区，分别为CR1(61～194)、CR2(254～269)、CR3(335～627)。CR1位于其分子的氨基端，富含半胱氨酸，含有锌指样结构，与蛋白激酶C的配体结合区结构相似，是活化的Ras与Raf-1蛋白激酶结合的主要部位。CR2亦靠近氨基端，富含丝、苏氨酸。CR3位于其分子的羧基端，是蛋白激酶的催化功能区。
2 Raf-1蛋白激酶的激活方式及其特征
许多研究证实，酪氨酸蛋白激酶的活化对Raf-1激活具有重要作用。在细胞Ras/Raf-1增殖信号途径中，生长因子(如PDGF等)结合于受体后，使受体二聚化，激活特异的受体酪氨酸激酶，从而使受体上相应的酪氨酸残基磷酸化。磷酸化的酪氨酸被含有SH2的Grb2-Sos蛋白复合物所结合，其后，Sos可使与Ras结合的GDP转变为GTP因而使Ras活化，活化的Ras进一步激活Raf-1。Raf-1被激活后继续激活其下游的丝裂素活化蛋白激酶激酶(MEK)和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)，最终通过对转录调节因子表达的影响而将细胞增殖信号传递到细胞核内[2]。在这一信号传导过程中，Raf-1能否被激活、是否能够准确地下传信号对于细胞是否出现受刺激后的增殖效应至关重要。此外，还有研究表明，非受体酪氨酸激酶如Src、Fyn、Lck等也可通过其SH2结构域与Raf-1结合，并可磷酸化其340、341位的酪氨酸，使之改变构象而被激活[3]。
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Ras与Raf-1常以复合物形式存在。其主要结合位点可能为Raf-1之Arg89。多数研究表明，尽管Raf-1与Ras常结合在一起，但Ras并非直接激活Raf-1。如Stokoe等[4]将起膜定位作用但并无Ras活性的k-Ras羧基端17个氨基酸的基因序列与Raf-1之羧基端融合，并表达出融合蛋白RafCAAX，发现其酶活性与和肿瘤源性Ras共表达的Raf-1活性相似，而非膜定位的另一融合蛋白Raf6QCAAX并无Raf-1活性，因而提出Ras可能仅具有使Raf-1由胞浆重新定位于胞膜的作用。Marais等人的实验进一步证实了以上观点[3]。他们认为Raf-1的激活分为两步，第一步是Ras与Raf-1结合并将Raf-1固定于膜内侧，第二步才是Raf-1的活化，其活化可由酪氨酸激酶来完成。目前已证实，在Ras/Raf-1信号途径中，Ras主要是催化胞浆中的Raf-1使之固定于细胞膜内侧，Raf-1一旦与胞膜的脂质层相互作用即可暴露出其激酶功能区，进一步可能由其它非Ras依赖的信号分子(如蛋白激酶C、酪氨酸激酶、其它丝/苏氨酸激酶、磷酸酶或配体等)而激活。
, http://www.100md.com
通过对蛋白质序列分析、合成肽的磷酸化检测及利用点突变致其磷酸化丧失等方法对Raf-1进行分析，已发现Raf-1的第43位、第259位及第621位三个位置是其主要的丝氨酸磷酸化位点，而第340、341位酪氨酸是其主要的酪氨酸磷酸化位点。不同位点的磷酸化对Raf-1活性可能具有不同的意义。
目前还发现了一些与Raf-1结合及其激活调节相关的细胞内蛋白，如14-3-3、HSP90、HSP50、Bag-1、KSR等。这些蛋白与Raf-1结合，可能对维持Raf-1的稳定性及其细胞内定位十分重要，但它们均不能直接活化Raf-1。最近有人报道凋亡抑制基因bcl-2的结合蛋白Bag-1能结合于Raf-1之催化活性区，并活化之。另外，还有人发现磷酯酸能够活化Raf-1，Raf-1蛋白之二聚化亦能够活化其自身，虽然有依赖RAS与否的争论。由此可见Raf-1激活的机制不但具有细胞与刺激物特异性，而且可能是多层次、多种因素相互作用的结果。
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3 Raf-1激酶在不同信号传导途径及其交联中的作用
目前的研究发现，Raf-1除了本身在Ras/Raf-1/MAPK(ERK)细胞增殖信号传导途径中扮演重要角色之外，还与其它多种信号传导途径存在着相互调节，很可能是多种信号传导途径之间相互作用的交联信号之一(见附图)。
附图 Raf-1在细胞信号传导途径中的位置及作用
3.1 G蛋白相关信号途径 G蛋白是一种跨膜蛋白，它一端连接细胞膜受体，另一端连接胞膜内侧的蛋白酶分子，如AC、PLC、PLA2等，将细胞外的信息转变为胞膜内的第二信使。G蛋白由α、β、γ三个亚单位组成。在与G蛋白偶联相关的信号传导途径中，Raf-1可与G蛋白βγ亚单位、PKC或PKA发生相互作用。如Pumiglia等[5]利用酵母双杂交技术筛选到一个能与Raf-1结合的克隆，其编码产物为Gβ的C端半部，进一步研究表明Gβγ能够结合于Raf-1的136～239氨基酸区域，并在人肾293T细胞得到了Raf-1与Gβγ的复合物，为Gβγ与Raf-1之间的相互作用提供了直接证据。但也有人认为Gβγ是通过PH接头与RAS蛋白相互作用。
3.2 PKC 在小鼠心肌细胞、MDCK、CHO及小鼠VSMC等许多细胞株，均证明PKC能够活化Raf-1激酶，从而介导细胞对有丝分裂原的反应。PKC可能作用于不同的Raf-1位点。Kolch等[6]利用PKCα对合成肽及点突变肽的作用结合PKCα与Raf-1在SF9细胞的共表达，证明499位丝氨酸对于PKCα对Raf-1的活化及其转化能力是必需的。Carroll等[7]合成了一系列含有PKC底物共有序列的多肽片段，然后用PKC对其进行, 百拇医药